Encyclopédie des expériences JoVE
Recherche sur le cancer
0 vues • 5:39 min • April 30th, 2023
- Les cellules cancéreuses du pancréas interagissent avec les fibroblastes associés au cancer dans le microenvironnement tumoral ou TME. Ces interactions modulent l’activité métabolique des cellules cancéreuses et affectent la progression du cancer.
Les sphéroïdes sont les agrégats cellulaires qui récapitulent l’EUT in vitro. Par conséquent, nous pouvons utiliser ces sphéroïdes pour tester les changements dans les fonctions métaboliques de la tumeur par dosage de flux extracellulaire. Ce test mesure la concentration extracellulaire d’oxygène et de protons pour déterminer le métabolisme aérobie et glycolytique, respectivement.
Commencez par prélever des sphéroïdes 3D de taille appropriée fabriqués en co-cultivant des cellules cancéreuses du pancréas avec des fibroblastes pancréatiques. Maintenant, transférez les sphéroïdes dans une plaque d’analyse de flux et couvrez-la d’une cartouche de capteur contenant des médicaments d’essai. Exécutez le test dans un analyseur de flux extracellulaire.
L’analyseur de flux injecte pneumatiquement les médicaments à tester de la cartouche du capteur à la plaque d’analyse à des points temporels spécifiques. En réponse aux médicaments testés, les cellules libèrent des protons et de l’oxygène dans la micro-chambre à plaque et les fluorophores présents dans la sonde du capteur mesurent ces niveaux. Enfin, à l’aide d’un logiciel approprié, analysez la fonctionnalité des sphéroïdes.
Dans le protocole suivant, nous démontrerons une méthode de mesure de la fonction métabolique des cellules tumorales pancréatiques présentes dans les sphéroïdes 3D à l’aide du test de flux extracellulaire.
La veille du test métabolique, hydratez la cartouche de la sonde avec 200 microlitres de calibrant de test par puits dans la plaque utilitaire fournie et incubez la plaque utilitaire pendant la nuit dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius sans CO2.
Le lendemain matin, observez les sphéroïdes dans la plaque de croissance au microscope optique pour vérifier leur morphologie et leur uniformité globale. Transférez la plaque de croissance sur un entraînement de maintien magnétique et aspirez soigneusement environ 120 microlitres de milieu de croissance par puits.
Lavez doucement les sphéroïdes avec 120 microlitres de milieu de test chauffé trois fois. Après le dernier lavage, inspectez à nouveau les sphéroïdes au microscope pour confirmer qu’ils n’ont pas été emportés et ajoutez 180 microlitres de milieu de dosage chaud dans chaque puits.
À l’aide d’une large pointe percée, aspirez soigneusement un seul sphéroïde prélavé de la plaque de croissance répulsive cellulaire et transférez doucement le sphéroïde directement au centre d’un puits d’une plaque de dosage de sphéroïdes, permettant au sphéroïde de tomber dans la micro-chambre centrale du puits par gravité.
Lorsque tous les sphéroïdes ont été transférés, placez la plaque de test dans l’incubateur d’air humidifié sans CO2 et à 37 degrés Celsius pendant une heure. Pendant l’incubation, orientez la cartouche du capteur de manière à ce que les rangées A à H soient sur le côté gauche et placez un guide de chargement sur le dessus de la cartouche de sorte que la lettre correspondant à l’orifice à charger se trouve dans le coin supérieur gauche.
Si la plaque a été chargée uniformément, ouvrez le logiciel d’analyse et cliquez sur Gabarits. Double-cliquez sur Modèle vierge et cliquez sur Générer des groupes. Sous l’onglet Carte des plaques, attribuez des groupes à la plaque d’essai correspondant au plan d’expérience et sélectionnez les quatre puits d’angle comme puits d’arrière-plan.
Sous l’onglet Protocole de l’instrument, cochez Calibrer, Équilibrer et Cycle de mesures de base. Cliquez sur Injections et définissez le composé pour chaque orifice. Passez les cycles de mesure à 6. Passez en revue le résumé du protocole et du groupe, puis enregistrez le modèle de conception de test.
Sur la base de la conception du test comme guide, utilisez une pipette multicanaux pour distribuer chaque réactif directement dans les orifices d’injection, en maintenant les guides de chargement en place du bout des doigts. Lorsque tous les réactifs ont été chargés, retirez le guide de chargement et tenez la cartouche à la hauteur des yeux pour inspecter visuellement les orifices d’injection pour un chargement uniforme.
Transférez la cartouche et la plaque utilitaire dans l’analyseur de flux extracellulaire et lancez l’étalonnage avant le dosage. Une fois calibré, remplacez la plaque utilitaire par la plaque de dosage préchauffée contenant les sphéroïdes 3D et commencez le test. Une fois le test terminé, exportez les données dans le logiciel d’analyse de données approprié.