Isolement de cellules souches PDAC : une méthode pour isoler des cellules souches cancéreuses de tumeurs pancréatiques

- Les cellules souches du cancer du pancréas ou CSC sont un sous-ensemble de cellules cancéreuses auto-renouvelables et peuvent donner naissance à la tumeur entière. Les CSC résident dans une niche bien protégée composée d’autres cellules, telles que les fibroblastes, les cellules immunitaires, les cellules endothéliales et les composants de la matrice extracellulaire, tels que les cytokines et les facteurs de croissance. Les interactions qui se produisent entre les cellules dans un tel environnement aident les CSC à se propager et à augmenter la croissance tumorale.

Pour étudier les propriétés des CSC, nous les isolons des tumeurs pancréatiques. Commencez par prélever la suspension cellulaire du tissu tumoral pancréatique humain dans un milieu de croissance CSC. Ensuite, ensemencez la suspension, composée principalement de fibroblastes et de CSC, sur une plaque recouverte de gélatine et incubez-la pendant la durée souhaitée. Les fibroblastes adhèrent à la surface de la gélatine, laissant les CSC flottants librement dans la suspension cellulaire.

Prenez une petite quantité de suspension cellulaire et ajoutez du bleu de trypan. Pipetez ce mélange jusqu’à un hémocytomètre et comptez le nombre de cellules viables. Le bleu de trypan pénètre dans les cellules mortes et les colore en bleu, laissant les cellules vivantes incolores. Enfin, conservez les CSC pour une analyse plus approfondie.

Dans le protocole suivant, nous isolerons les CSC des tumeurs pancréatiques.

- Pour isoler des cellules souches cancéreuses d’un adénocarcinome canalaire pancréatique dans une enceinte de biosécurité stérile, utilisez un scalpel stérile et une pince pour hacher la tumeur humaine dans une boîte de culture de 60 x 15 millimètres contenant un millilitre de PBS stérile, en ajoutant trois à quatre millilitres supplémentaires de PBS si nécessaire, jusqu’à ce que le tissu soit complètement dissocié.

Transférez la suspension tissulaire dans un tube conique stérile et ajoutez du PBS à un volume final de cinq millilitres. Ensuite, homogénéisez mécaniquement l’échantillon avec le dissociateur, la centrifugeuse et digérez le tissu homogénéisé avec de la collagénase à 37 degrés Celsius.

Au bout d’une heure, centrifugez les cellules en remettant en suspension la pastille dans 10 millilitres de milieu complet. Filtrez la suspension cellulaire à travers une crépine de 40 micromètres et faites tourner à nouveau les cellules, cette fois en remettant la pastille en suspension dans cinq millilitres d’ACK.

Après cinq minutes à température ambiante, retirez le tampon de lyse des globules rouges par centrifugation et remettez la pastille en suspension dans un milieu de cellules souches cancéreuses. Ensuite, incubez les cellules sur une boîte recouverte de gélatine à 37 degrés Celsius pour éliminer la plupart des cellules fibroblastiques qui se fixent rapidement. Au bout d’une heure, récupérez le surnageant et quantifiez le nombre de cellules cancéreuses du pancréas viables.