JoVE Encyclopedia of Experiments
Recherche sur le cancer
0 vues • 4:24 min • April 30th, 2023
- Le ganglion de la racine dorsale ou DRG sont des neurones sensoriels qui relaient les messages de la périphérie vers le système nerveux central. En revanche, les neurones du plexus myentérique sont impliqués dans les mouvements péristaltiques des intestins.
Dans les affections cancéreuses telles que le cancer du pancréas, ces neurones se modifient morphologiquement et fonctionnellement. Pour étudier les changements de morphologie neuronale, ensemencez les cellules neurales sur des lamelles pré-enrobées de protéine de laminine, placées dans une plaque multipuits, et recouvrez les cellules avec le milieu neural basal.
La protéine laminine favorise la croissance des neurites. Incuber les cellules pendant la nuit. Ensuite, ajoutez le milieu d’extraction de tissu cancéreux du pancréas dans les trois premiers puits et le milieu d’extraction de tissu pancréatique sain dans les trois puits suivants. Incuber l’assiette. Maintenant, effectuez une coloration immunohistochimique à l’aide de marqueurs d’anticorps spécifiques aux neurones, qui se lient aux neurones. Placez la lamelle sur la lame de verre et placez la lame sous un microscope inversé. Mesurez la densité des neurites à l’aide du logiciel.
Les neurones DRG cultivés dans l’extrait de tissu cancéreux du pancréas présentent généralement une plus grande densité de neurites que dans l’extrait de tissu pancréatique sain. En revanche, les neurones du plexus myentérique forment des neurites plus longs que dans les extraits de tissu pancréatique sain. Dans le protocole suivant, nous effectuerons un test de neuroplasticité in vitro sur les neurones DRG et du plexus myentérique d'une souris nouveau-née.
- Pour préparer les cellules à la culture, utilisez un hémocytomètre pour estimer le nombre total de neurones et de cellules gliales. Ensuite, ensemencez les cellules sur des lamelles pré-enduites de 13 millimètres dans une plaque de 24 puits. Le revêtement utilisé dépend des objectifs expérimentaux. Ensuite, garnissez les puits d’un milieu basal neural et laissez les cellules se fixer aux puits, pendant la nuit. Le lendemain, décongelez le milieu supplémenté en extrait de tissu, ou le milieu supplémenté en surnageant de lignée cellulaire.
Ensuite, aspirez le substrat de semis des DRG et effectuez un lavage facultatif très doux avec du PBS. Ensuite, pipetez lentement le milieu supplémenté en extrait de tissu ou le milieu supplémenté en surnageant de la lignée cellulaire sur les cellules pour obtenir 100 microgrammes par millilitre. Maintenant, laissez les cellules se développer pendant 48 heures à 37 degrés Celsius dans l’extrait de tissu ou le milieu fourni par le surnageant de la lignée cellulaire. Après 48 heures, aspirez le média et fixez-le à 4 % de paraformaldéhyde pour l’immunomarquage.
Pour une double coloration immunofluorescente, utilisez des marqueurs spécifiques des neurones et des cellules gliales. Pour la morphométrie, utilisez un microscope à lumière inversée équipé d’une caméra CCD en combinaison avec un logiciel automatisé pour mesurer la densité des neurites. À l’aide d’un grossissement de 200X, mesurez la densité de neurites des cultures neuronales en superposant une grille de 50 X 50 microns et en comptant la densité de fibres par carré, mesurée dans les fibres qui se croisent. Répétez cette analyse pour quatre régions différentes de croissance la plus dense sur quatre à cinq photomicrographies représentatives sur chaque lamelle.
Mesurez l’excroissance des neurites, le nombre moyen de branches par neurone, la longueur moyenne des branches et la taille péricaryonale à partir de 30 neurones solitaires sélectionnés au hasard dans chaque lamelle en marquant les neurites et le péricaryen.