Surveillance du microenvironnement tumoral basée sur la PTM : une méthode de suivi des changements de rigidité ECM à l’aide de sphéroïdes tumoraux

- Lors de l’invasion tumorale, les cellules tumorales périphériques subissent une transition épithéliale-mésenchymateuse ou EMT, entraînant la dégradation locale de la matrice extracellulaire ou ECM. Nous pouvons étudier l’interaction des cellules tumorales avec l’ECM in vitro.

Pour étudier ces interactions, transférez un sphéroïde préformé dérivé de cellules tumorales pancréatiques dans une plaque contenant un échafaudage de collagène ainsi que des sondes de traçage fluorescentes intégrées et des milieux de culture. Le sphéroïde tumoral libère des protéases, qui dégradent le collagène et réduisent la rigidité de l’ECM, ce qui permet la libre circulation des sondes de traçage dans l’ECM.

Incuber la plaque pendant la durée souhaitée. Observez l’échantillon au microscope optique pour regarder la grille des points d’échantillonnage dans l’échafaudage de collagène et enregistrer des données vidéo à partir de ceux-ci. La région de la matrice près du sphéroïde montre une dégradation maximale du collagène. Par conséquent, il a augmenté le mouvement de la sonde. En revanche, la zone plus éloignée du sphéroïde montre une dégradation moindre du collagène, ce qui entraîne une restriction du mouvement des molécules de sonde.

Cette technique d’examen des propriétés rhéologiques de l’ECM en mesurant les trajectoires des particules traceurs est connue sous le nom de microrhéologie de suivi des particules ou PTM. Dans le protocole suivant, nous effectuerons un test de formation de sphère pour identifier les cellules souches du cancer du pancréas et évaluer l’effet de la metformine.

Pour commencer, préparez un poste de travail à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire avec deux flacons de 2 millilitres. Le flacon 1 contiendra le sphéroïde tumoral, et le flacon 2 sera un contrôle acellulaire. Préparez un mélange dilué de sondes traceurs fluorescentes de 1 micron de diamètre modifiés au carboxylate en ajoutant 2 parties de sondes mères à 25 parties d’eau stérile.

Sortez une bouteille de 3,1 milligrammes par millilitre de collagène bovin du réfrigérateur et placez-la sur de la glace. Aliquote 125 microlitres de collagène suivis de 50 microlitres de solution de sonde de traçage diluée dans le flacon 1. Vortex brièvement pour répartir les sondes.

Ensuite, ajoutez 235 microlitres de milieu de culture cellulaire approprié contenant du rouge de phénol pour un volume total de 410 microlitres et tourbillonnez brièvement avant de retirer 205 microlitres et de le placer dans le flacon 2. Ensuite, ajoutez environ 2 microlitres d’hydroxyde de sodium à 1 molaire dans le flacon 1 pour ramener la solution à un pH neutre. Vortex brièvement pour mélanger. Ensuite, remettez immédiatement dans le support à glace afin que le mélange ne commence pas à durcir.

Retirez délicatement 40 microlitres de milieu du puits contenant le sphéroïde tumoral. Conservez ces 40 microlitres pendant la réalisation de l’étape suivante. Vérifiez le puits pour voir si le sphéroïde a été retiré à l’étape précédente. Si ce n’est pas le cas, remettez les 40 microlitres dans le puits et répétez l’étape précédente.

Si c’était le cas, ajoutez les 40 microlitres contenant le sphéroïde dans le flacon 1. Remuez doucement le flacon 1 avant de transférer le mélange en portions de 60 microlitres dans trois puits séparés d’une plaque de 96 puits. Inspectez chaque puits au microscope après avoir ajouté le mélange pour déterminer quel puits contient le sphéroïde.

Ajoutez ensuite environ 2 microlitres d’hydroxyde de sodium à 1 molaire et 40 microlitres de milieu de culture cellulaire dans le flacon 2, et vortex avant d’aliquoter 60 microlitres de ce mélange dans un puits vide dans la plaque à 96 puits et de l’étiqueter comme témoin acellulaire. Placez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius pour durcir pendant au moins une heure.

Pour construire une grille de points d’échantillonnage, transférez d’abord la plaque d’échantillon de l’incubateur à la platine du microscope. Attendez 10 minutes pour que l’échantillon s’équilibre à la température ambiante si une platine chauffée n’est pas disponible. Observez l’échantillon avec des lentilles d’objectif de faible puissance pour vous assurer qu’il est intact et prêt pour l’imagerie. Déterminez la position de la tumeur dans le puits et documentez-la avec une image en lumière transmise pour un co-enregistrement spatial ultérieur.

Typiquement, 20 points d’échantillonnage dans chaque puits répartis en anneaux concentriques autour du sphéroïde produiront des résultats suffisamment détaillés. Déplacez la platine dans la position souhaitée et utilisez un logiciel d’interface de microscope pour enregistrer les coordonnées x et y.

Passez le microscope à une lentille d’objectif haute puissance et sélectionnez le cube de filtre approprié pour la longueur d’onde d’excitation des sondes de traçage. À l’aide de la liste des points créés, passez au premier point de la grille. Ajustez la mise au point pour trouver le fond du puits avant de remonter pour trouver un champ de vision contenant plusieurs sondes de traçage mises au point.

Observez l’histogramme d’intensité et ajustez l’intensité et le temps d’exposition pour obtenir la plus grande plage dynamique possible tout en veillant à ce que l’image ne soit pas saturée. Obtenez une séquence vidéo à une fréquence d’images de 20 à 30 millisecondes par image et enregistrez-la avec une convention de dénomination appropriée. Pendant l’enregistrement, ne touchez pas le microscope ou la table.

Répétez l’enregistrement pour chaque point d’échantillonnage de la grille. Ensuite, répétez le processus pour construire une grille pour chaque puits de l’expérience et répétez l’ensemble du processus pour chaque point temporel pendant la durée de la surveillance longitudinale.