Name: Établir des cultures primaires de fibroblastes adultes à partir de rongeurs (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 43 s
Description: Découvrez le protocole d'isolation de fibroblastes primaires à partir de tissus cutanés et pulmonaires de rongeurs sauvages. Cette méthode par digestion enzymatique avec collagénase permet d'obtenir environ 10 millions de cellules viables.

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Nous remercions le Dr Steven Austad de nous fournir la première version de ce protocole. Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH et le Ellison Medical Foundation à VG et AS

1. Avant de partir <ol><li> Stériliser des ciseaux et des pinces à l'éthanol 70%. </li><li> Placer les petits agitateur magnétique dans un bécher 30 mL, couvrir avec deux couches de papier d'aluminium, et autoclave. </li><li> Préparer un 28 unités Wunsch / ml de solution stock Libérase Blendzyme 3 dans l'eau stérile. Faire aliquotes de 0,5 ml et congeler à -20 ° C. Dégeler une aliquote de nouvelles avant chaque utilisation. La solution peut paraître nuageux après décongélation. Vortex la solution jusqu'à ce qu'elle devienne claire. </li><li> Réchauffez les milieux de culture cellulaire. </li></ol> 2. Préparation des échantillons d'animaux Attention: les animaux sauvages peuvent contenir des agents pathogènes tels que virus de la rage. Soyez toujours conscient de dièses ouverte. <ol><li> Euthanasier l'animal et le lieu de la carcasse à 4 ° C. Il est préférable d'utiliser la carcasse immédiatement, toutefois, si cela n'est pas pratique, comme si les animaux sont recueillies sur le terrain, les carcasses peuvent être utilisés dans les 24 heures. Après 24 heures, les baisses de rendement des cellules. </li><li> Disséquer l'animal dans le bloc opératoire ou dans hotte chimique (et non dans la hotte de culture de tissus). </li><li> Aisselles zone est un site pratique pour recueillir des échantillons de peau comme la peau des aisselles est plus mince, contient moins de gras, et la fourrure est moins dense. Nettoyez le site d'incision avec de l'éthanol à 70%. Assurez-vous que la fourrure est imbibé d'éthanol. </li><li> Rasez les poils autour du site d'incision avec un scalpel tranchant. Rasage une zone plus vaste que le site d'incision désirée. Essayez de minimiser les coupures de la peau. Vaporiser la zone avec 70% d'éthanol et laisser sécher. </li><li> Pour recueillir un échantillon de peau d'accise d'un fragment d'environ 1 cm 2. Pincer la peau avec une pince de tissu et couper avec des ciseaux. Essayez de ne pas couper la couche de graisse avec la peau, sous forme de graisse interfère avec la digestion par la collagénase. Pour recueillir les échantillons pulmonaires, lavez la région de la poitrine avec de l'éthanol à 70%, et ouvert la peau sur la poitrine avec des ciseaux en faisant une incision en forme de T et en tirant en dehors des volets de la peau. Laver la zone musculaire ouvert avec 70% d'éthanol et laisser sécher. Couper la cage thoracique à l'aide des pinces stériles et les ciseaux (utilisation tailleurs d'os pour les gros animaux). Utiliser des techniques stériles pour éviter de contaminer les organes internes. Ne pas toucher les organes internes avec des instruments qui a touché la fourrure animale. Coupez les fragments pulmonaires d'environ 1 cm 2 à l'aide des pinces stériles et des ciseaux. </li><li> Fragments de tissus place dans des tubes de 50 ml avec du PBS stérile pour éviter le dessèchement. </li><li> Laver l'extérieur de l'tubes de 50 ml avec des fragments de tissu avec de l'éthanol, et les prendre à la hotte de culture de tissus. </li><li> Débarrassez-vous correctement des carcasses d'animaux. </li></ol> 3. Cellules Extraction <ol><li> Transfert des fragments de tissu dans un plat de 10 cm de culture de tissu à l'aide scalpel stérile. Ne transférez pas trop de PBS avec l'échantillon. </li><li> Coupez le tissu dans ~ 1 mm en utilisant deux morceaux scalpels. Utilisez deux lames de ciseaux en utilisant une action à partir du centre et en tirant à part. Gardez le tissu en boule, ne pas couper morceau par morceau. Quand la coupe est suffisamment la peau ressemble à du mastic, il ne sera pas séparée en morceaux, mais s'étendra mince. Le tissu pulmonaire est plus facile à couper, et il va séparer en petits morceaux. </li><li> Avec un scalpel, le transfert du tissu découpé en 30 stériles bécher mL avec un barreau d'agitation stérile. Laver la plaque utilisée pour la découpe de tissus avec 10 ml de DMEM/F12 des médias avec les unités Wunsch 0,14 / mL Libérase Blendzyme 3, et 1X antibiotique / antimycotique, et ajouter la solution dans le bécher de 30 mL avec des fragments de tissus. </li><li> Couvrir le bécher avec du papier stérile, et incuber à 37 ° C, en remuant doucement, pendant 30 à 90 minutes. La longueur de l'incubation dépend du type d'espèces et de tissus. Prenez soin de ne pas trop digérer les tissus. Meilleurs rendements sont obtenus lorsque des fragments de tissus sont encore présentes à la fin de la digestion. Peau prend plus de temps à digérer que le poumon. Peau d'animaux de grande taille prend plus de temps à digérer. Vérifiez la digestion après 30 minutes, puis toutes les 10 min. Lorsque la digestion est terminée la peau, les médias devient trouble et de fragments de peau séparés les uns des autres, et les bords des morceaux devenus "flou". La digestion du poumon doit être arrêté lorsque la couleur change pulmonaires fragments du rouge au blanc et commencer à former des fibres collante. </li><li> Pipeter la solution contenant des fragments de tissus et pour briser les mottes. Transférer la solution dans le tube de 50 ml stérile. Si les fragments se déplacer facilement à travers la coupe 10 ml pipette et la digestion a été bien fait. Rincer le bécher 3 fois avec 10 ml d'eau tiède DMEM/F12 médias avec 15% de FBS, 1X antibiotique / antimycotique et ajouter le support sur le tube de 50 ml avec des fragments de tissus. Fermer le tube de 50 ml et mélanger par inversion à quelques reprises. Le FBS dans les médias cesseront de digestion Libérase. </li><li> Centrifuger à 524 g dans une centrifugeuse de culture tissulaire seau balancer pendant 5 min. Enlever le surnageant. Reprendre le culot dans 10 ml d'eau tiède DMEM/F12 médias avec 15% de FBS, 1X antibiotique / antimycotique. Pipet la suspension avecforce maximale pour briser les morceaux de tissu. </li><li> Ajouter un autre de 30 ml de DMEM/F12 médias avec 15% de FBS, 1X antibiotique / antimycotique, mélanger et centrifuger à 524 g dans une centrifugeuse de culture tissulaire seau balancer pendant 5 min. Répéter une fois de plus pour éliminer les traces d'Libérase. </li><li> Reprendre le culot dans 10 ml de DMEM/F12 médias avec 15% de FBS, 1X antibiotique / antimycotique et transférer dans un plat de 10 cm de culture de tissu et placer dans un incubateur de culture tissulaire à 37 ° C, 5% de CO 2, 3% O 2 . </li><li> Vérifiez les plaques tous les jours pour les fibroblastes et la couleur des médias. Si l'isolement a été un succès, les fibroblastes ramper hors des fragments de tissu et attacher à la plaque (figure 1). Les fibroblastes commencent à quitter les fragments de tissus dans les 2-5 jours. </li><li> Si les changements de supports de la couleur au jaune, cela indique une contamination potentielle ou le surpeuplement des cellules. Examiner les plaques sous la loupe à fort grossissement. Si les bactéries, les champignons ou les vers sont présents jeter les plaques (ce qui est rarement un problème avec les animaux de laboratoire, mais peut se produire lorsque les échantillons sont prélevés dans la nature). Si aucune contamination est présente, mais les médias ont changé de couleur, cela est causé soit par trop de cellules ou de fragments de tissus trop nombreux placés dans le même plat. Si plus de 60% de la plaque est recouverte par les fibroblastes joint, changer le support sur la plaque et le transfert des fragments de tissu d'une nouvelle plaque avec les nouveaux médias. Si ce n'est pas fibroblastes de nombreux attaché à la plaque, le changement des médias et de diviser les morceaux de tissu à un 2-4 plaques. </li><li> Après 7 jours, si les médias n'avaient pas été changés plus tôt, changer le support et le transfert des fragments de tissu d'une nouvelle plaque avec les nouveaux médias. </li><li> Incuber les cellules et de fragments de tissus pour 7 jours supplémentaires. Par tous les jours 14 fibroblastes viables ont quitté les fragments de tissus. </li><li> Après 14 jours depuis le début de l'isolement cellulaire, jeter le vieux médias et des fragments de tissus, la récolte des cellules et la plaque entre eux sur une nouvelle plaque à 5x10 5 cellules / plaque avec EMEM FBS 15%, 1X pénicilline / streptomycine, acides aminés non essentiels , et de sodium pyruvate. Les médias EMEM viendra soutenir la croissance des fibroblastes types de cellules et d'autres ne vont mourir ou d'arrêter la prolifération. </li><li> Après que les cellules atteignent 80-90% de confluence, de geler une partie aliquote de cellules pour une utilisation future. </li><li> Poursuivre la culture des cellules en les découpant à 5x10 5 cellules / plaque lorsque les cellules atteignent 80-90% de confluence. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs Fibroblastes normaux sont de grosses cellules avec des protubérances de premier plan (lamellipodes) (figure 2). Fibroblastes poussent en monocouche. Une culture de croissance sain contient des cellules 1-10% dans la phase M, reconnu comme arrondi cellules élevées sur la surface de la plaque, mais pas détaché de la plaque (figure 3). Typiquement, un plat de 10 cm ensemencé avec 5x10 5 cellules confluentes devient en 3-4 jours. Le temps de doublement varie considérablement entre les espèces, et peut être plus élevé pour certaines des espèces de rongeurs à long terme 1. Lorsque les cellules de remplir une plaque qu'ils arrêtent la prolifération en phase G1. Plaque d'confluent de fibroblastes contient une couche de cellules serrées (figure 4). Lorsque les cellules atteignent la confluence de 90% qu'ils sont prêts pour le fractionnement. Si désiré, les cellules peuvent être maintenues sur une plaque arrêtés confluentes pendant de longues périodes de temps avec les changements de supports réguliers (une ou deux fois par semaine). <img src="/files/ftp_upload/2033/2033fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. L'isolement des fibroblastes de peau de souris (A) et du poumon (B). Les médias a été changé pour éliminer les cellules seules et les débris avant de prendre les photos au jour 7. <img src="/files/ftp_upload/2033/2033fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Fibroblastes pulmonaires de la souris. <img src="/files/ftp_upload/2033/2033fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Un champ de fibroblastes de souris contenant des cellules en M-scène, photographiée à un grossissement de 10X. <img src="/files/ftp_upload/2033/2033fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. Une plaque confluent de fibroblastes de souris, photographiées à un grossissement de 10X.

<ol><li>Seluanov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+tumor+suppressor+mechanisms+evolve+in+rodent+species+that+differ+in+size+and+lifespan.+Aging+%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct tumor suppressor mechanisms evolve in rodent species that differ in size and lifespan. Aging .</a> Cell. 7, 813-823 (2008).</li>
<li>Parrinello, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+sensitivity+severely+limits+the+replicative+lifespan+of+murine+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts.</a> Nat Cell Biol. 5, 741-747 (2003).</li>
</ol>

Normale fibroblastes primaires fournissent une excellente alternative aux établie lignées cellulaires de cancer dans la recherche biologique. Un avantage important des fibroblastes est qu&#39;ils ne portent des mutations dans les oncogènes et suppresseurs de tumeur et de maintenir intactes les points de contrôle du cycle cellulaire. Cela rend les fibroblastes normaux d&#39;un système privilégié pour les études de la régulation du cycle cellulaire, la réparation de l&#39;ADN, et l&#39;apoptose. Le protocole décrit ici fo...

<table><tbody><tr><td>Milieu DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (SVF), qualifié</td><td>Invitrogen</td><td>01437-036</td><td>Le sérum qualifié a été pré-testé afin d'assurer un bon soutien de la croissance des fibroblastes primaires.</td></tr><tr><td>Antibiotique/Antimycotique</td><td>Invitrogen</td><td>15420-096</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Liberase TM Research Grade&lt;/strong&gt;</td><td>Roche</td><td>&lt;strong&gt;05401127001&lt;/strong&gt;</td><td>Enzyme de remplacement.</td></tr><tr><td colspan="4">Note des auteurs : Étant donné que Roche a cessé la production de Liberase Blendzyme 3 (11814184001), ils recommandent d'utiliser à la place Liberase TM Research Grade, milieu contenant de la thermolysine (n° de catalogue 05401119001 - 10 mg, n° de catalogue 05401127001 - 100 mg). Nous avons effectué ce changement avec succès, sans aucun problème.</td></tr><tr><td>Milieu EMEM</td><td>ATCC</td><td>30-203</td><td>Le milieu EMEM fourni par ATCC contient déjà des acides aminés non essentiels et du pyruvate de sodium.</td></tr><tr><td>Lame chirurgicale jetable stérile #21 à bord tranchant</td><td>Multiples fournisseurs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubateur à contrôle tri-gaz</td><td>Forma ou Heraeus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Établir des cultures primaires de fibroblastes adultes à partir de rongeurs

Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents

L&#39;importance de l&#39;utilisation de cellules primaires, plutôt que de lignées cellulaires de cancer, pour des études biologiques est de plus largement reconnu. Les cellules primaires sont préférés dans les études sur le contrôle du cycle cellulaire, l&#39;apoptose, et la réparation de l&#39;ADN, les cellules cancéreuses sont porteurs de mutations dans les gènes impliqués dans ces processus. Les cellules primaires ne peuvent pas être cultivées indéfiniment en raison de l&#39;apparition de la sénescence réplicative ou aneuploidization. Ainsi, de nouvelles cultures doivent être établis régulièrement. La procédure d&#39;isolement de fibroblastes embryonnaires de rongeurs bien établie, mais d&#39;isoler des cultures de fibroblastes adultes représente souvent un défi. Fibroblastes de rongeurs adultes isolés de modèles murins de maladies humaines peut être un contrôle préféré quand on les compare à des fibroblastes provenant de patients humains. Par ailleurs, les fibroblastes adultes sont les seuls matériaux disponibles lorsque vous travaillez avec des rongeurs sauvages où les femmes enceintes ne peuvent pas être obtenus facilement. Ici nous fournissons un protocole pour l&#39;isolement et la culture de fibroblastes adultes de la peau des rongeurs et des poumons. Nous avons utilisé cette procédure avec succès pour isoler les fibroblastes de plus de vingt espèces de rongeurs à partir des souris de laboratoire et des rats à des rongeurs sauvages tels que le castor, le porc-épic et l&#39;écureuil.

Cet article décrit un protocole pour l&#39;isolement et l&#39;entretien des cultures de fibroblastes primaires de la peau et les tissus pulmonaires de rongeurs sauvages.

L'importance d'utiliser des cellules primaires, plutôt que des lignées cellulaires cancéreuses, pour les études biologiques est désormais largement reconnue. Les cellules primaires sont privilégiées...

L'isolement de fibroblastes viables à partir de tissus cutanés et pulmonaires d'animaux commence par la dissection de fragments de peau et de poumon sur une carcasse animale. En utilisant une technique stérile, le tissu est découpé en petits fragments et digéré avec de la collagénase. Les fragments de tissu digérés sont ensuite incubés dans un milieu de culture riche jusqu'à ce que les fibroblastes sortent du tissu.Enfin, les fragments de tissu sont retirés et le milieu riche est remplacé par un milieu de culture spécifique aux fibroblastes. Après la mise en culture des cellules, des aliquotes sont congelées pour une utilisation ultérieure. En définitive, un fragment de tissu cutané ou pulmonaire d'un centimètre carré permet d'obtenir 10 puissance 7 fibroblastes en passage.Et le principal avantage de cette technique par rapport aux autres méthodes qui n'impliquent pas la digestion enzymatique des tissus est qu'elle permet d'obtenir un grand nombre de cellules à partir d'une variété d'échantillons animaux. Cette méthode aidera les chercheurs dans le domaine de la biologie comparée à isoler efficacement les globules sanguins de diverses espèces de mammifères. Une démonstration visuel

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Ce protocole décrit une méthode rapide pour générer simultanément des cultures de mlanocytes et de fibroblastes à partir de la peau de souris de 0 à 4 jours. Ces cultures primaires peuvent être maintenues et manipulées in vitro pour étudier une variété de processus physiologiquement pertinents, y compris la biologie des cellules de la peau, la pigmentation, la cicatrisation des plaies et le mélanome.

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