Name: Culture poumon embryonnaire de la souris, un système pour évaluer les mécanismes moléculaires des Branching (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Apprenez la culture d'organes de poumons embryonnaires de souris pour étudier les interactions épithélio-mésenchymateuses. Cette méthode permet d'observer la croissance et le branchement pulmonaire in vitro.

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Ce travail a été soutenu par l&#39;Institut de recherche Saban pré-doctoral Prix (PMDM), et par le NIH RO1 HL75773 (DW).

La culture d'organes est une technique très utile et polyvalent pour étudier l'expression génique et protéique. Ces méthodes de cultures ex vivo peut être utilisé comme préliminaire ou en complément à des études in vivo. 1. Isolement poumon embryonnaire <ol><li> Timed enceintes souris sont sacrifiées le jour postcoitum 11.5 ou 12.5 (E11.5-12.5) par le CO 2 narcose selon les directives des NIH et OLAW. L'animal est placé dans une chambre et de CO 2 de 100% est introduit. Après que l'animal est inconscient du flux de CO 2 est augmentée. La mort clinique de l'animal doit être assurée. </li><li> Toutes les étapes suivantes doivent être remplies dans des conditions stériles dans une hotte à flux laminaire. L'utérus est retiré de la femmes enceintes. Pour enlever l'utérus de l'animal, les femelles enceintes sont placées sur leur dos et pulvérisé avec de l'éthanol à 70%. Une incision est faite dans l'abdomen, et la peau est enlevée en tirant la peau vers le haut tout en maintenant pattes postérieures de l'animal. La cavité péritonéale est ouvert et l'utérus est retiré de l'animal. </li><li> Le sang est rincé en plaçant l'utérus dans un tube conique de 50 ml remplie de froid Hanks Balanced Salt Solution (HBSS), et le tube est bercé pendant 2 minutes. </li><li> L'utérus est ensuite placé dans une boîte de Pétri sous le microscope stéréoscopique disséquer, et les embryons libérés de l'utérus par incision de la paroi utérine à l'aide des ciseaux à ressort. Les embryons sont récoltés à l'aide d'une cuillère perforée, et placé sur la glace dans un nouveau plat de Pétri contenant HBSS. </li><li> Sous le microscope stéréoscopique de dissection, poumons embryonnaires sont disséqués, un par un dans une boîte de Petri contenant HBSS froid (figure 1). </li><li> Le poumon embryonnaire isolée est placée sur la glace dans une boîte de Petri contenant HBSS aide d'une pipette de transfert stérile. </li></ol> 2. Culture poumon embryonnaire <ol><li> 500 microlitres de 1 millilitre par puits de D-MEM/F-12 supplémenté avec 50 unités / ml de pénicilline-streptomycine est ajouté dans un plat en polystyrène Nunclon. </li><li> Un Nuclepore polycarbonate Track-Etch membrane est placée sur le dessus du support. Lorsque le Nuclepore polycarbonate Track-Etch membrane est placée sur le dessus du support, assurez-vous que le côté brillant est contre les médias, et le côté rugueux est tourné vers le haut. </li><li> Un poumon disséqué embryon est placé au sommet de la Nuclepore polycarbonate Track-Etch membrane à l'aide d'une pipette de transfert stérile. </li><li> La position de poumon embryonnaire est ajusté à l'aide de la pince. Poumon embryonnaire placé sur le filtre devrait avoir une trachée intact et être placés avec leur trachée avoir une position droite, permettant ainsi à tous d'avoir les poumons la même pression interne. </li><li> Le plat de polystyrène Nunclon est transféré pour la culture souhaitée dans un incubateur à cellules (figure 2). </li></ol> 3. Matériaux 1. Isolement embryonnaires poumon entier <ol><li> Timed-enceintes (C57BL6 de type sauvage ou transgéniques) des souris à être sacrifiés au jour postcoitum 11,5 à 13,5 (E11.5-13.5). </li><li> Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquide, sans chlorure de calcium, chlorure de magnésium, ou sulfate de magnésium. (Invitrogen, Carlsbad, CA) complété avec 50 unités / ml de pénicilline-streptomycine (Invitrogen, Carlsbad, CA). Stocker le HBSS à température ambiante et à 4 ° C après ouverture. Aliquoter et de stocker les pénicilline-streptomycine à -20 ° C. </li><li> Stéréoscopique loupe binoculaire (Leica, Wetzlar, Allemagne). </li><li> Des outils de dissection dont Dumont forceps, beaux ciseaux à iris (droite), Noyes ciseaux printemps et Moria ® cuillère (perforés) (Outils Fine Science, Foster City, CA). </li></ol> 2. Culture embryonnaire poumon entier <ol><li> Dulbecco milieu de Eagle modifié: mélange nutritif F-12 (D-MEM/F-12) (1X), liquide, 01h01 Contient de la L-glutamine, mais pas de tampon HEPES. (Invitrogen, Carlsbad, CA) complété avec 50 unités / ml de pénicilline-streptomycine (Invitrogen, Carlsbad, CA). Conserver le flacon DMEM/F-12 abri de la lumière (par exemple, couvert par une feuille d'aluminium) et stocker à 4 ° C. Aliquoter et de stocker les pénicilline-streptomycine à -20 ° C. </li><li> Nuclepore polycarbonate Track-Etch membrane, 8,0 m, 13mm (Whatman Nuclepore Track-Etch membrane (Whatman, Florham Park, NJ). </li><li> Vaisselle en polystyrène Nunclon avec couvercles, 4 puits (Rochester, NY). </li><li> Pipettes de transfert jetable, stérile (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2035/2035fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Dissection de E12 poumons embryonnaires humaines. (A) E12.5 embryon complet vu du côté droit (B). Forelimb droit a été retiré de l'embryon. (C) Pince tenait par la main gauche tenant l'embryon constante dans le plat. Les flèches indiquent le plan de dissection (D) est postérieure des poumons embryonnaires au cœur (enlevé) Et antérieure à la colonne vertébrale. Cette figure montre les poumons après l'enlèvement de la peau et le cœur. (E) la suppression du pharynx permet la séparation des poumons intacts de l'embryon (F). Étrangères tissus du pharynx et l'œsophage ont été coupé. Disséqué E12.5 poumon embryonnaire avec la trachée et du larynx intacte est montré. (Cr) du lobe crânien, (Med) lobe, (Ca) du lobe caudal, lobe accessoire (Acc), (Le) lobe gauche. <img src="/files/ftp_upload/2035/2035fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. FGF9 induit une expansion du mésenchyme et la dilatation de l'épithélium dans les poumons cultivées in vitro. (AC) E12.5 poumon est cultivé pendant 48 heures en l'absence de FGF9. Notez l'augmentation de la ramification. (DF) E12.5 pulmonaires cultivées pendant 48 heures en présence de FGF9. Notez la dilatation de l'épithélium et le mésenchyme dès après 24 heures de culture (E). Après 48 heures (F), l'effet sur ​​l'épithélium est encore plus prononcée. Échelle bar: AF 400 um 4. Le protocole texte complet de cette approche expérimentale est disponible en <a href="http://springerprotocols.com/Abstract/doi/10.1007/978-1-59745-019-5_5">protocoles Springer</a> .

<ol><li>Alescio, T., Cassini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+in+vitro+of+tracheal+buds+by+pulmonary+mesenchyme+grafted+on+tracheal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">Induction in vitro of tracheal buds by pulmonary mesenchyme grafted on tracheal epithelium.</a> J Exp Zool. 150, 83-94 (1962).</li>
<li>Warburton, D., Schwarz, M., Tefft, D., Flores-Delgado, G., Anderson, K. D., Cardoso, W. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+lung+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of lung morphogenesis.</a> Mech Dev. 92, 55-81 (2000).</li>
<li>Spooner, B. S., Hardman, P., Paulsen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gravity+in+mammalian+organ+development%3A+differentiation+of+cultured+lung+and+pancreas+rudiments+during+spaceflight%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">Gravity in mammalian organ development: differentiation of cultured lung and pancreas rudiments during spaceflight.</a> J Exp Zool. 269, 212-222 (1994).</li>
<li>Moral, del, M, P., De Langhe, S. P., Sala, F. G., Veltmaat, J. M., Tefft, D., Wang, K., Warburton, D., Bellusci, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+role+of+FGF9+on+epithelium+and+mesenchyme+in+mouse+embryonic+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential role of FGF9 on epithelium and mesenchyme in mouse embryonic lung.</a> Dev Biol. 293, 77-89 (2006).</li>
<li>Moral, D. el, M, P., Sala, F. G., Tefft, D., Shi, W., Keshet, E., Bellusci, S., Warburton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-A+signaling+through+Flk-1+is+a+critical+facilitator+of+early+embryonic+lung+epithelial+to+endothelial+crosstalk+and+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">VEGF-A signaling through Flk-1 is a critical facilitator of early embryonic lung epithelial to endothelial crosstalk and branching morphogenesis.</a> Dev Biol. 290, 177-188 (2006).</li>
<li>Jaskoll, T. F., Don-Wheeler, G., Johnson, R., Slavkin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+mouse+lung+morphogenesis+and+type+II+cytodifferentiation+in+serumless%2C+chemically+defined+medium+using+prolonged+in+vitro+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Differ%22%5BJournal%5D)">Embryonic mouse lung morphogenesis and type II cytodifferentiation in serumless, chemically defined medium using prolonged in vitro cultures.</a> Cell Differ. 24, 105-117 (1988).</li>
<li>Seth, R., Shum, L., Wu, F., Wuenschell, C., Hall, F. L., Slavkin, H. C., Warburton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+epidermal+growth+factor+expression+in+early+mouse+embryo+lung+branching+morphogenesis+in+culture%3A+antisense+oligodeoxynucleotide+inhibitory+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of epidermal growth factor expression in early mouse embryo lung branching morphogenesis in culture: antisense oligodeoxynucleotide inhibitory strategy.</a> Dev Biol. 158, 555-559 (1993).</li>
</ol>

culture poumon embryonnaire de la souris, un système pour évaluer les mécanismes moléculaires des branching

Mouse Embryonic Lung Culture, A System to Evaluate the Molecular Mechanisms of Branching

Spécifications du poumon primordiale ainsi que la morphogenèse de branchement, et la formation de diverses lignées cellulaires pulmonaires nécessite une interaction spécifique de l&#39;endoderme du poumon avec son mésenchyme environnant et de mésothélium. Lung mésenchyme a été montré pour être la source de signaux inductifs pour la morphogenèse des poumons de branchement. Épithélio-mésenchymateuse-mésothéliales interactions sont également essentielles à la morphogenèse poumon embryonnaire. Début culture embryonnaire d&#39;orgue du poumon est un système très utile pour étudier les interactions épithélio-mésenchymateuses. Les deux produits morphogenèse épithéliales et mésenchymateuses dans des conditions spécifiques qui peuvent être facilement manipulées dans ce système (en l&#39;absence de l&#39;influence maternelle et la circulation sanguine). Plus important encore, cette technique peut être facilement fait dans un serumless, milieux de culture chimiquement défini. Gain et perte de fonction peut être réalisée en utilisant des protéines exprimées, vecteurs viraux recombinants et / ou l&#39;analyse des souches de souris transgéniques, l&#39;ARN antisens, ainsi que knockdown gène de l&#39;ARN interférence.

Début culture embryonnaire d&#39;orgue du poumon est un système très utile pour étudier les interactions épithélio-mésenchymateuses. Les deux produits morphogenèse épithéliales et mésenchymateuses dans des conditions spécifiques qui peuvent être facilement manipulées dans ce système.

Culture poumon embryonnaire de la souris, un système pour évaluer les mécanismes moléculaires des Branching

La spécification du primordium pulmonaire ainsi que la morphogenèse branching, et la formation des différentes lignées cellulaires pulmonaires, nécessitent une interaction spécifique de...

Dans cette vidéo, une méthode de dissection et de culture des poumons d'embryons de souris est présentée. Le protocole commence par la collecte d'embryons à E 11,5 ou E 12,5. Ensuite, les embryons sont ouverts et les poumons sont extraits.Les poumons sont ensuite mis en culture dans une interface liquide-air et incubés selon les conditions de culture. Les modifications de la croissance et du bourgeonnement du mésenchyme et de l'épithélium du poumon embryonnaire en réponse à des traitements spécifiques peuvent être observées à l'aide d'un microscope stéréo. Bonjour, je suis David War Burton.Je dirige le programme de biologie du développement et de médecine régénérative à l'Institut de recherche Ban de l'hôpital pour enfants de Los Angeles. Et je suis Jan Carro, postdoctorante senior dans le laboratoire de la Dre War Burton. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une technique permettant d'isoler le poumon de souris embryonnaire et de le placer en culture d'organe.Cette technique s'est développée à partir de la description initiale de Tina Jaco Halkin et Pablo, qui nous l'ont présentée à la faculté de médecine dentaire de l'USC il y a environ 20 ans. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la morphogenèse ramifiée du mouton. Commençons donc.Au jour 11,5 ou 12,5 après le Postum, placer une souris gravide sacrifiée au dioxyde de carbone sous une hotte à flux laminaire, sur le dos. Pulvériser avec de l'éthanol à 70 %. Pratiquer une incision dans l'abdomen.Ensuite, tout en tenant les pattes arrière de l'animal, retirez la peau en tirant vers le haut. Ouvrez la cavité péritonéale et retirez l'utérus. Placez l'utérus dans un tube conique de 50 millilitres rempli de solution saline équilibrée de Hanks froide ou HBSS et agitez doucement pendant deux minutes pour éliminer le sang.Ensuite, transférez l'utérus dans une boîte de Pétri sous un microscope stéréoscopique. À l'aide de ciseaux à ressort, incisez la paroi utérine pour libérer les embryons. Puis, à l'aide d'une cuillère perforée, récoltez les embryons et placez-les dans une boîte de Pétri contenant du HBSS, puis mettez-les sur de la glace.Continuer à travailler sous le microscope stéréoscopique et commencer la dissection des poumons embryonnaires. Commencer par placer l'embryon sur son côté gauche. À l'aide de pinces, retirer le membre antérieur droit en tenant les pinces de maintien dans la main gauche.Coupez l'embryon en partant de l'ouverture du membre et retirez la peau. Cette étape vous permettra d'observer les organes internes et de localiser le cœur et les poumons pour l'étape suivante. Retirez le cœur.Les poumons embryonnaires se situent en arrière du cœur et en avant de la colonne vertébrale. Ensuite, séparez le poumon intact de l'embryon. Puis retirez les tissus superflus ainsi que l'œsophage.Une fois les poumons retirés, utilisez une pipette de transfert stérile pour les transférer dans une boîte de Pétri contenant du HBSS froid sur de la glace. Ajoutez de 0,5 à un millilitre de D-M-E-M-F 12 supplémenté avec 50 unités par millilitre de pénicilline-streptomycine dans chaque puits d'une boîte en polystyrène sans clone delta. Ensuite, placez une membrane en polycarbonate nucléopore obtenue par gravure sur support au-dessus du milieu, côté brillant vers le bas et côté rugueux vers le haut.À l’aide d’une pipette de transfert stérile, placer un poumon embryonnaire disséqué sur la membrane en polycarbonate nucléoporeuse. À l’aide du microscope stéréo, ajuster la position du poumon embryonnaire. Le poumon embryonnaire doit présenter une trachée intacte placée en position droite, comme illustré ici.Cela garantit que tous les poumons ont la même pression interne ; transférez ensuite la boîte dans un incubateur à cellules et cultivez pendant la durée souhaitée. Ici, des poumons de E 12,5 ont été cultivés en présence ou en absence de FGF neuf. FGF neuf est un membre de la famille des facteurs de croissance des fibroblastes qui induit l'expansion du mésenchyme et la dilatation de l'épithélium dans des poumons cultivés in vitro après 48 heures.En l'absence de FGF neuf, une ramification accrue est observée. Ces images sont des photographies du poumon embryonnaire prises au microscope stéréo. En revanche, les poumons cultivés pendant 48 heures en présence de FGF neuf présentent un épithélium dilaté et un mechy.Après 24 heures de culture. Après 48 heures, l'effet sur l'épithélium est encore plus marqué. Nous venons donc de vous montrer comment préparer des cultures d'organes à partir de poumon de souris embryonnaire.Lors de cette procédure, il est important de se souvenir de retirer le poumon de l'embryon le plus rapidement possible afin de réduire la détérioration du tissu. Merci donc d'avoir regardé. Nous espérons que vous trouverez cette technique utile.Bonne chance avec vos expériences.

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