Méthode de la goutte suspendue : une technique pour générer des sphéroïdes de mélanome en 3D
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Recherche sur le cancer
0 vues • 3:33 min • April 30th, 2023
- Les sphéroïdes sont des modèles tridimensionnels de culture cellulaire in vitro qui imitent l’architecture tumorale in vivo et aident à étudier les interactions intra-tumorales. Pour mettre en place la culture, préparez d’abord une suspension unicellulaire de cellules de mélanome dans leur milieu approprié. Ensuite, repérez de petits volumes de cette suspension cellulaire, suffisamment écartés sur la surface intérieure du couvercle d’une boîte de culture stérile et non adhésive. Retournez soigneusement le couvercle et placez-le sur la base de la boîte de culture contenant du PBS pour créer une chambre d’hydratation. Incuber la plaque dans des conditions appropriées.
L’humidité du PBS empêche l’évaporation du média des gouttes suspendues. Rafraîchissez les gouttes en remplaçant quelques microlitres de média. En raison de la tension superficielle, les gouttelettes conservent leur forme sphérique et restent suspendues à la surface intérieure de la plaque. Les forces gravitationnelles permettent aux cellules de rester en suspension sans se propager, mais s’agrègent pour former des sphéroïdes tridimensionnels dans les gouttelettes. Enfin, rincez les gouttelettes avec du PBS pour récolter les sphéroïdes. Récupérez-les dans une boîte de culture non adhésive.
Dans le protocole suivant, nous démontrerons la génération de sphéroïdes tridimensionnels de cellules de mélanome 451-LU via la méthode de la goutte suspendue.
- Pour commencer, cultivez des cellules de mélanome 451-LU à l’aide d’un milieu RPMI contenant 10 % de FCS, selon les protocoles généraux de culture cellulaire. Pour générer des sphéroïdes de mélanome, lavez les cellules de mélanome cultivées dans du PBS. Ensuite, ajoutez 5 millilitres de 1x Trypsine-EDTA dans du PBS. Incuber 3 à 5 minutes à température ambiante. Ajouter 5 millilitres de RPMI contenant 10 % de FCS pour neutraliser la trypsine. Ensuite, transférez la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger. Centrifuger à 200 x g pendant 5 minutes pour récolter les cellules. Remettre en suspension la pastille de cellule dans un IPRP contenant 10 % de FCS.
Ensuite, comptez les cellules et diluez la suspension cellulaire jusqu’à une concentration finale de 10 000 cellules par millilitre. À l’aide d’une multipipette électronique, faites des taches de 40 x 25 microlitres de suspension cellulaire sur la surface intérieure du couvercle d’une boîte de culture cellulaire stérile et non adhésive de 10 centimètres.
Ensuite, retournez le couvercle d’un mouvement rapide et fluide et placez-le sur la boîte de culture cellulaire contenant 5 millilitres de PBS. Cultivez les plats suspendus à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone pendant 10 à 14 jours.
Cinq jours après le repérage initial des gouttes, utilisez un distributeur électronique pour ajouter 10 microlitres de RPMI contenant 10 % de FCS à chaque goutte. Après 10 à 15 jours, récoltez les sphéroïdes en les rinçant doucement du couvercle avec du PBS. Récupérez les sphéroïdes dans une boîte de culture cellulaire fraîche et non adhésive.
Aperçu
Cet article décrit la formation de sphéroïdes tridimensionnels de cellules de mélanome par la méthode de la goutte pendante. Les sphéroïdes imitent l'architecture tumorale in vivo et facilitent l'étude des interactions intra-tumorales.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Techniques de culture cellulaire
- Recherche sur le mélanome
- Modélisation in vitro
Contexte
- Les sphéroïdes sont des modèles tridimensionnels qui reproduisent les environnements tumoraux.
- Ils sont utiles pour étudier les interactions cellulaires au sein des tumeurs.
- La méthode de la goutte suspendue permet la formation de sphéroïdes sans adhérence.
- Le mélanome est un type de cancer de la peau qui peut être étudié à l’aide de ces modèles.
Objectif de l'étude
- Démontrer la formation de sphéroïdes de mélanome.
- Fournir un protocole permettant aux chercheurs de reproduire la méthode.
- Approfondir la compréhension de la biologie tumorale grâce à des modèles tridimensionnels.
Méthodes utilisées
- Préparation d'une suspension unicellulaire de cellules de mélanome.
- Utilisation de boîtes de culture non adhésives pour la formation de sphéroïdes.
- Incubation dans des conditions spécifiques afin de favoriser la croissance des sphéroïdes.
- Récupération des sphéroïdes pour des analyses ultérieures.
Résultats principaux
- Des sphéroïdes ont été formés avec succès à partir de cellules de mélanome 451-LU.
- La méthode de la goutte suspendue a permis de maintenir la forme sphérique des gouttes.
- Les cellules se sont agrégées pour former des structures tridimensionnelles.
- La récolte a été réalisée sans endommager les sphéroïdes.
Conclusions
- La méthode de la goutte suspendue est efficace pour générer des sphéroïdes de mélanome.
- Ce modèle peut être utilisé pour étudier la biologie tumorale et les réponses aux médicaments.
- De futures recherches pourront s'appuyer sur cette méthode afin d'explorer diverses thérapies anticancéreuses.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
Les sphéroïdes de mélanome tridimensionnels générés par la méthode de la goutte pendante fournissent un modèle in vitro physiologiquement pertinent qui imite étroitement l'architecture tumorale in vivo. Ce système permet une interrogation plus prédictive des interactions intratumorales et soutient la validation précoce de cibles ainsi que la réduction des risques mécanistiques dans les voies de découverte en oncologie. L'approche améliore la continuité translationnelle en comblant l'écart entre les cultures traditionnelles en 2D et les modèles in vivo complexes.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet l'évaluation fonctionnelle du comportement des cellules de mélanome dans un contexte tridimensionnel.
- Permet de réduire les risques mécanistiques en modélisant les interactions avec le microenvironnement tumoral.
- Facilite des études fondées sur des hypothèses concernant la signalisation intratumorale et l'agrégation cellulaire.
Développement de tests et criblage
- Offre une plateforme reproductible pour la préparation de cultures standardisées de sphéroïdes tridimensionnels.
- Améliore la pertinence des tests en reflétant une architecture tumorale proche de celle observée in vivo.
- Permet une évaluation quantitative des effets des composés sur la formation et l'intégrité des sphéroïdes.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne les résultats in vitro à la biologie tumorale pertinente pour la maladie, afin d'explorer des biomarqueurs translationnels.
- Permet une continuité allant de la découverte à la validation préclinique en modélisant la complexité tumorale.
- Réduit le risque de translation en offrant un système de modèle préclinique plus prédictif.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode du sphéroïde en goutte suspendue s'inscrit dans le continuum entre la découverte précoce et le développement préclinique, permettant une validation solide des cibles et le développement d'essais avant les études in vivo.
- Biologie de la découverte : Facilite la vérification d'hypothèses et la clarification des voies biologiques dans un contexte tumoral tridimensionnel.
- Criblage : Permet d'obtenir des cultures de sphéroïdes reproductibles et évolutives pour l'évaluation de composés.
- Analytique : Permet la mesure quantitative de la formation et de la morphologie des sphéroïdes.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre les modèles in vitro et in vivo afin d'améliorer l'alignement des biomarqueurs.
- Réutilisation en entreprise : Offre une plateforme standardisée et réutilisable aux équipes de recherche et développement en oncologie.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Augmente la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la modélisation des tumeurs.
- Valeur opérationnelle : Améliore la standardisation, la reproductibilité et l'évolutivité des protocoles de culture 3D.
- Valeur stratégique : Améliore la qualité des décisions d'avancement ou d'abandon et l'efficacité du capital dans les phases précoces des pipelines en oncologie.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation et un développement ajustés au risque des actifs en oncologie.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture cellulaire en 3D et en manipulation de sphéroïdes.
- Suppose l'accès à des matériel de culture non adhésif et à des outils précis de manipulation des liquides.
- Exige une standardisation entre équipes pour une génération reproductible de sphéroïdes.
- Peut nécessiter des adaptations selon les lignées cellulaires ou les types de tumeurs.
- Limité à la modélisation in vitro ; ne reproduit pas entièrement la complexité in vivo.
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Dernière mise à jour : 22 août 2026