Méthode de la goutte suspendue : une technique pour générer des sphéroïdes de mélanome en 3D

- Les sphéroïdes sont des modèles tridimensionnels de culture cellulaire in vitro qui imitent l’architecture tumorale in vivo et aident à étudier les interactions intra-tumorales. Pour mettre en place la culture, préparez d’abord une suspension unicellulaire de cellules de mélanome dans leur milieu approprié. Ensuite, repérez de petits volumes de cette suspension cellulaire, suffisamment écartés sur la surface intérieure du couvercle d’une boîte de culture stérile et non adhésive. Retournez soigneusement le couvercle et placez-le sur la base de la boîte de culture contenant du PBS pour créer une chambre d’hydratation. Incuber la plaque dans des conditions appropriées.

L’humidité du PBS empêche l’évaporation du média des gouttes suspendues. Rafraîchissez les gouttes en remplaçant quelques microlitres de média. En raison de la tension superficielle, les gouttelettes conservent leur forme sphérique et restent suspendues à la surface intérieure de la plaque. Les forces gravitationnelles permettent aux cellules de rester en suspension sans se propager, mais s’agrègent pour former des sphéroïdes tridimensionnels dans les gouttelettes. Enfin, rincez les gouttelettes avec du PBS pour récolter les sphéroïdes. Récupérez-les dans une boîte de culture non adhésive.

Dans le protocole suivant, nous démontrerons la génération de sphéroïdes tridimensionnels de cellules de mélanome 451-LU via la méthode de la goutte suspendue.

- Pour commencer, cultivez des cellules de mélanome 451-LU à l’aide d’un milieu RPMI contenant 10 % de FCS, selon les protocoles généraux de culture cellulaire. Pour générer des sphéroïdes de mélanome, lavez les cellules de mélanome cultivées dans du PBS. Ensuite, ajoutez 5 millilitres de 1x Trypsine-EDTA dans du PBS. Incuber 3 à 5 minutes à température ambiante. Ajouter 5 millilitres de RPMI contenant 10 % de FCS pour neutraliser la trypsine. Ensuite, transférez la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger. Centrifuger à 200 x g pendant 5 minutes pour récolter les cellules. Remettre en suspension la pastille de cellule dans un IPRP contenant 10 % de FCS.

Ensuite, comptez les cellules et diluez la suspension cellulaire jusqu’à une concentration finale de 10 000 cellules par millilitre. À l’aide d’une multipipette électronique, faites des taches de 40 x 25 microlitres de suspension cellulaire sur la surface intérieure du couvercle d’une boîte de culture cellulaire stérile et non adhésive de 10 centimètres.

Ensuite, retournez le couvercle d’un mouvement rapide et fluide et placez-le sur la boîte de culture cellulaire contenant 5 millilitres de PBS. Cultivez les plats suspendus à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone pendant 10 à 14 jours.

Cinq jours après le repérage initial des gouttes, utilisez un distributeur électronique pour ajouter 10 microlitres de RPMI contenant 10 % de FCS à chaque goutte. Après 10 à 15 jours, récoltez les sphéroïdes en les rinçant doucement du couvercle avec du PBS. Récupérez les sphéroïdes dans une boîte de culture cellulaire fraîche et non adhésive.