HCR-DNA FISH : une technique d’hybridation in situ en fluorescence pour détecter l’ADN viral dans les cellules infectées

- HCR-FISH, ou hybridation in situ par réaction en chaîne d’hybridation-fluorescence, détecte les séquences d’acides nucléiques viraux dans le génome des cellules infectées par le virus. Pour commencer, fixez une culture adhérente de cellules infectées par le virus et perméabilisez leur membrane cellulaire. Incuber les cellules avec un tampon d’hybridation pour réduire tout signal de fond. Traiter les cellules avec des sondes initiatrices porteuses d’une séquence initiatrice HCR et d’une séquence complémentaire ciblant l’ADN viral. Chauffez l’échantillon pour dénaturer l’ADN double brin de l’hôte en ADN simple brin. Incuber l’échantillon pour permettre à la sonde de se lier à sa séquence d’ADN viral cible complémentaire.

Ensuite, traitez avec un tampon d’amplification contenant deux ensembles de sondes en épingle à cheveux oligonucléotidiques marquées par fluorescence, H1 et H2. Incuber pour faciliter l’hybridation en chaîne. La séquence initiatrice non appariée se lie à sa queue H1 complémentaire, linéarisant la structure en épingle à cheveux. La séquence H1 exposée se lie de la même manière à sa queue H2 complémentaire. Le H2 arrière continue de se lier à une queue H1. De cette façon, les sondes marquées fluorescentes amplifient autour du site cible, émettant un signal fort. Traitez l’échantillon avec du DAPI pour colorer les noyaux cellulaires.

Utilisez un microscope à fluorescence pour détecter la fluorescence brillante des foyers de réplication dans les noyaux des cellules infectées. Dans le protocole suivant, nous montrerons in situ HCR-DNA FISH pour détecter le génome du polyomavirus à cellules de Merkel dans les cellules primaires de la peau humaine infectées.

- Tout d’abord, fixez les cellules sur des lamelles avec 4 % de PFA dans du PBS pendant 10 minutes. Ensuite, lavez les lamelles deux fois avec du PBS et traitez-les avec de l’éthanol à 70 % à 4 degrés Celsius pendant la nuit pour perméabiliser les cellules. Le lendemain, remplacez l’éthanol par un tampon d’hydratation de sonde et incubez à température ambiante pendant 60 minutes pour pré-hybrider les échantillons. 30 minutes avant la fin de l’incubation de pré-hybridation, diluer les sondes dans une solution d’hybridation par sonde à une dilution de 1:500 et incuber à 45 degrés Celsius.

Une fois les incubations terminées, pipeter environ 10 microlitres du mélange de sonde dilué sur une lame de microscope pour chaque lamelle. Placez chaque lamelle, côté cellulaire vers le bas, sur sa gouttelette respective de mélange d’hybridation. À l’aide d’une quantité généreuse de ciment en caoutchouc, scellez les bords et le dos de chaque lamelle de recouvrement à sa glissière. Placez les lames sur le côté plat d’un bloc chauffant et chauffez-les à 94 degrés Celsius pendant 3 minutes. Après cela, transférez les lames dans une chambre humidifiée et incubez-les à 45 degrés Celsius pendant la nuit.

Le lendemain, à l’aide d’une pince, retirez soigneusement le ciment en caoutchouc. Placez les lamelles, côté cellule vers le haut, dans les puits d’une plaque à 24 puits et lavez-les trois fois à température ambiante avec un tampon de lavage de sonde. Ajoutez 200 microlitres de tampon d’amplification dans chaque puits contenant une lamelle et incubez à température ambiante pendant 30 à 60 minutes. Pendant ce temps, recuire chacune des deux épingles à cheveux oligonucléotidiques marquées en reconnaissant les sondes dans des tubes PCR séparés en les chauffant à 95 degrés Celsius pendant 90 secondes, puis en les refroidissant à température ambiante pendant 30 minutes. Mélangez les épingles à cheveux dans un tampon d’amplification à une dilution de 1:50.

Ensuite, étirez un film de paraffine sur la face ouverte d’un couvercle à plaque à 12 puits pour créer une surface pour la réaction d’amplification. Pipeter des gouttelettes de 50 à 100 microlitres du mélange en épingle à cheveux sur le film de paraffine pour chaque lamelle. À l’aide d’une pince, retirez soigneusement chaque lamelle de la solution de préamplification et touchez le bord pour en faire sécher une lingette poreuse et jetable. Placez chaque lamelle séchée, côté cellule vers le bas, sur une gouttelette d’amplification. Transférez le couvercle de la plaque dans une chambre humidifiée et incubez toute la nuit à température ambiante et dans l’obscurité.

Le lendemain, retournez les lamelles dans les puits de la plaque à 24 puits. Ajouter 5 DAPI contenant du SSCT à une concentration de 0,5 microgramme par millilitre dans chaque puits et incuber à température ambiante pendant une heure. Après cela, lavez les échantillons deux fois avec 5x SSCT à température ambiante. Montez les lamelles sur des lames de microscope et utilisez un microscope à fluorescence inversée pour analyser les cellules et imager les échantillons.