Isolement des kératinocytes de la peau humaine : une méthode de culture des kératinocytes primaires à partir d’échantillons de peau

- Les kératinocytes sont les cellules les plus proéminentes présentes dans l’épiderme, ou la couche la plus externe de la peau. Ils s’organisent en plusieurs couches sur le derme, associés à divers autres types de cellules telles que les mélanocytes, les cellules dendritiques et les cellules de Merkel.

Pour isoler les kératinocytes, commencez par prélever le tissu épidermique de la peau humaine. Ensuite, traitez avec un tampon de digestion enzymatique. Les enzymes du tampon dégradent les protéines de la matrice extracellulaire présentes dans le tissu épidermique, initiant ainsi la dissociation cellulaire. Maintenant, ajoutez un média approprié et perturbez mécaniquement le tissu.

Pour libérer les cellules dissociées en suspension, filtrez la suspension de cellules épidermiques à travers une passoire pour éliminer tout amas ou débris cellulaires. Centrifugeuse pour granuler les cellules épidermiques et les séparer du surnageant contenant l’enzyme. Retirez le surnageant et remettez les cellules en suspension à l’aide d’un milieu de croissance kératinocytaire préféré. Cultivez les cellules pendant la durée souhaitée.

Au cours de la culture, les milieux optimisés enrichissent l’expansion des kératinocytes en favorisant leur croissance sélective par rapport aux autres types de cellules épidermiques. Dans le protocole suivant, nous montrerons l’isolement des kératinocytes à partir de tissus cutanés humains adultes.

- Prélevez des échantillons de peau de 10 centimètres sur 15 centimètres de volontaires adultes en bonne santé subissant une chirurgie plastique. Gardez la peau fraîche en transportant les échantillons de peau dans une boîte en polystyrène contenant un élément réfrigérant. Si nécessaire, conservez l’échantillon de peau à 4 degrés Celsius pendant la nuit. À l’aide de ciseaux, de scalpels et de pinces stérilisés, retirez la graisse sous la section de la peau.

Ensuite, à l’aide d’aiguilles, bouclez la section de peau sur un couvercle stérile sur une plaque. À l’aide d’un tampon de gaze sec et stérilisé, nettoyez la peau. Ensuite, appliquez de l’éthanol à 70 % sur un tampon de gaze stérilisé. Ensuite, à l’aide d’un raboteur à pied, coupez la couche supérieure de l’épiderme de la section de la peau et transférez-la dans une boîte de Pétri de 9 centimètres.

Ensuite, ajoutez immédiatement 25 millilitres de la solution DPBS/trypsine/glucose préalablement préparée dans la boîte de Pétri. Incuber les échantillons à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. À l’aide d’une pipette, retirez la solution DPBS/trypsine/glucose de la boîte de Pétri et ajoutez 10 millilitres de RPMI-1640 plus 2 % de FBS pour inactiver la trypsine.

Maintenant, à l’aide de deux pinces, libérez les cellules épidermiques dans le milieu en grattant et en agitant doucement l’épiderme et le compartiment dermique des sections cutanées. Filtrez la suspension de cellules épidermiques à travers un filtre métallique et collectez le filtrat dans un tube de 50 millilitres. Ajoutez les sections de peau restantes dans un tube de 50 millilitres contenant 10 millilitres de RPMI-1640 sans FBS et vortex pendant 10 secondes.

Filtrez cette suspension à travers le filtre métallique dans un tube de 50 millilitres contenant la suspension de cellules épidermiques. Ensuite, ajoutez DPBS à un volume total de 50 millilitres. Centrifugez la suspension cellulaire à 450 x g à température ambiante pendant 10 minutes. Ensuite, retirez le surnageant et, selon la taille de la pastille cellulaire, remettez en suspension la pastille de cellules épidermiques dans environ 10 millilitres de 37 degrés Celsius KSFM.

À l’aide de la méthode de coloration au bleu de trypan, comptez les cellules au microscope. Ensuite, dans chaque flacon de culture de 75 centimètres carrés, transférez 8 fois 10 dans les sixièmes cellules avec 12 millilitres de 37 degrés Celsius KSFM. Agitez doucement les flacons de culture pour assurer une répartition uniforme des cellules. Incuber les kératinocytes dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 100 % d’humidité et 5 % de CO₂. Changez de support après deux jours, puis 3 fois par semaine.