Essai de transplantation sous-cutanée : une méthode de transplantation de cellules de mélanome d’un donneur à un modèle de poisson-zèbre receveur

- Au cours du test de transplantation de mélanome, des cellules cancéreuses de poissons-zèbres porteurs de tumeurs sont transplantées dans un modèle de receveur immunodéprimé pour étudier le développement de la tumeur. Commencez par prélever un poisson-zèbre euthanasié porteur d’une tumeur et réséquez chirurgicalement la tumeur de son corps. Transférez la tumeur dans une boîte de Pétri contenant un tampon approprié et coupez-la en petits morceaux.

Ensuite, triturez les fragments de tumeur à l’aide d’une pipette. Cela dissocie les morceaux de tumeur en cellules individuelles. Maintenant, chargez la suspension de cellules tumorales dans une seringue. Par la suite, préparez un poisson-zèbre Casper receveur immunodéprimé sur un papier filtre. Cette variante mutante du poisson-zèbre, déficiente en pigmentation, est dépourvue de mélanocytes et d’iriophres, ce qui la rend transparente et polyvalente pour les expériences d’imagerie et de transplantation.

Ensuite, injectez la suspension de cellules de mélanome préchargée par voie sous-cutanée dans la région au-dessus de la cavité péritonéale, à mi-chemin entre le cerveau postérieur et la nageoire dorsale du poisson-zèbre Casper. Maintenant, transférez le poisson récepteur dans l’eau et surveillez-le pour observer le développement de la tumeur. Le corps transparent du poisson-zèbre aide à la visualisation facile des tumeurs développées.

Dans le protocole suivant, nous montrerons la transplantation de cellules de mélanome d’un donneur de poisson-zèbre porteur d’une tumeur transgénique à un modèle de poisson Casper receveur immunodéprimé.

- Après avoir irradié le poisson Casper receveur de 2 à 3 mois avec une irradiation gamma de 25 Gy un jour avant la transplantation, laissez le poisson se rétablir dans l’eau du poisson. Utilisez de la tricaïne pour euthanasier un poisson porteur d’une tumeur. Coupez la tumeur et mettez-la dans une boîte de Pétri avec environ 5 millilitres de filtre stérilisé 0,9x PBS avec 5 % FPS. Avec un rasoir, coupez la tumeur en dés pendant qu’elle est en solution.

En travaillant à température ambiante et avec une pipette P1000, triturer pour produire des cellules uniques. Augmentez le volume à 25 millilitres. Filtrez la solution à travers un filtre à mailles de 40 micromètres et faites-la tourner dans une centrifugeuse de table à 453 rcf pendant 10 minutes. Remettre le granulé en suspension dans 0,9 % PBS 5 % FBS à la concentration souhaitée.

À l’aide d’un hémocytomètre, calculez le nombre exact de cellules et diluez la suspension cellulaire de manière à ce que le volume final d’injection soit d’environ 5 microlitres. Par exemple, si 50 000 cellules doivent être injectées, la suspension cellulaire doit être diluée à une concentration finale de 10 000 cellules par microlitre. Agitez le tube contenant la suspension cellulaire toutes les quelques minutes pour éviter l’agglutination des cellules.

Avec 100 % d’éthanol et 0,9x PBS, laver une seringue Hamilton 701 N 10 microlitres de calibre 26s (pointe biseautée) 2 à 3 fois avant de charger la seringue avec 5 microlitres de suspension cellulaire. Après avoir anesthésié le poisson récepteur irradié dans de la tricaïne, placez-le sur le côté sur un Kimwipe humide.

Stabilisez le poisson d’une main et insérez l’aiguille avec le biseau vers le haut à un angle de 45 degrés dans le flanc du poisson au-dessus de la cavité péritonéale à mi-chemin entre la limite postérieure du cerveau postérieur et le bord intérieur de la nageoire dorsale. Appuyez doucement sur le piston. Laissez les poissons se rétablir dans l’eau douce des poissons et observez les poissons quotidiennement pour la greffe tumorale. Si une greffe a eu lieu, une croissance continue et le développement de la maladie peuvent également être observés.