Enregistrement Comportement multicellulaire en Myxococcus xanthus Les biofilms en utilisant Time-lapse microcinématographie

L’objectif global de l’expérience suivante est de développer un test de cinématographie micros time-lapse bon marché avec suffisamment de rigueur pour générer des résultats reproductibles et quantifiables. Ceci est réalisé en utilisant l’utilisation de joints en silicone réutilisables peu coûteux pour construire des plaques agros media ou des lames de microscope. On obtient des résultats qui montrent que ces complexes de plaques restent hydratés et suffisamment oxygénés pendant plus d’une semaine sur une variété de types de milieux et de concentrations de gélose.

De plus, comme la microcinématographie time-lapse est un processus lent, l’utilisation de huit microscopes peu coûteux permet d’accélérer l’acquisition de données. Bonjour, je suis Ryan Taylor du laboratoire du Dr Roy Welch du Département de biologie de l’Université de Syracuse. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure pour réaliser des films en accéléré de biofilms bactériens dans notre laboratoire, nous utiliserons cette procédure pour étudier le comportement multicellulaire des biofilms MTI.

Alors commençons. Pour commencer cette procédure, mesurez la densité cellulaire d’une culture d’Occus sanus mélangée pendant la nuit avec un clutmètre, transférez un millilitre de la culture dans un tube à centrifuger de 2,5 millilitres et remettez en suspension les bactéries dans un milieu TPM comme décrit dans le protocole écrit ci-joint, une pipette et un vortex pour remettre complètement la pastille en suspension, ce qui peut prendre un certain temps. Ensuite, ajoutez 0,5 gramme d’aros à 50 millilitres de TPM, qui est le milieu de dosage.

Ajoutez également 0,5 gramme d’aros à 50 millilitres de C-T-T-Y-E, qui est l’autoclave nutritif à stériliser. Maintenez ensuite le milieu à 55 degrés Celsius dans un incubateur ou un bain-marie. Lors de la construction du test de suivi.

Les complexes de plaques procèdent à la construction du microscope en verre de stérilisateur à flamme de disque nutritif. Faites glisser et placez un joint stérile en caoutchouc de silicone de 0,5 millimètre d’épaisseur sur le dessus de la glissière. Pipettes d’environ 300 microlitres de support C TT YE dans le puits créé par le joint sur la lame.

Le média agro C-T-T-Y-E doit accumuler les flammes, stériliser une autre lame et la déposer à un angle au-dessus des aros du média C-T-T-Y-E. Le fait de placer la glissière à un angle empêche la formation de bulles. Une fois la diapositive en place, gonflez le complexe avec des mini-pinces à reliure une de chaque côté.

Placez le complexe clipsé à quatre degrés Celsius et laissez le média C-T-T-Y-E AGRO prendre. Cela prend généralement environ cinq minutes. Une fois l’agro pris, on peut préparer les complexes de plaques utilisés dans le dosage de suivi.

Commencez par préparer les lames pour la construction des complexes d’essai. Pour chaque flamme complexe, deux lames de microscope en verre ont été stérilisées. Placez un joint d’autoclave sur l’une des lames pour former le fond du test.

L’autre glissière est utilisée pour aplatir les agros et comme glissière de support. Le haut du test est une lamelle. Enveloppez d’abord une lame de microscope avec du ruban adhésif d’étiquetage, puis une lamelle en verre de stérilisateur à flamme et placez-la sur la lame emballée stérilisée.

Faites glisser la glissière enveloppée qui soutient la lamelle de couverture, l’empêchant de se fissurer. Placez un joint d’autoclave sur la lamelle de protection stérilisée à la flamme à l’aide d’une pince. Appuyez sur les joints de la glissière inférieure et sur la lamelle pour vous assurer qu’ils forment un joint avec le verre.

Sinon, les matrices de supports peuvent se dessécher. Mettez de côté le joint de glissière et le joint de recouvrement avec les côtés stérilisés vers le haut à partir de maintenant, ne travaillez que sur un complexe à la fois pour éviter que les agros médiatiques ne se solidifient, ce qui entraînerait une mauvaise qualité de film. Commencez par placer le disque nutritif.

Retirez le complexe du disque nutritif de quatre degrés Celsius. Retirez l’éclipse de liaison et la partie précédente des lames exposant les aros C-T-T-Y-E maintenant solidifiés à l’aide d’une pipette de micro-échantillonnage avec un embout jetable en verre de 100 microlitres. Retirez également un disque nutritif d’un millimètre de diamètre du média C-T-T-Y-E et placez-le dans le puits créé par le joint sur la lamelle.

Ensuite, récupérez les agros de milieu TPM de l’incubateur et pipetez 300 microlitres dans le puits créé par le joint sur la lamelle et contenant le disque nutritif. Le média TPM Agros doit être monté en butte pour aplatir le média T-P-M-S-A Placez l’une des lames stérilisées à la flamme sans joint à un angle au-dessus du média TPM aros. Placer la glissière à un angle permet d’éviter la formation de bulles.

Fixez le complexe à l’aide de mini-pinces à reliure une de chaque côté. Placez le complexe clipsé à quatre degrés Celsius et laissez le support se lever pour prendre. Cela prend généralement environ cinq minutes.

Une fois que le média s’est levé a pris, retirez le complexe de quatre degrés Celsius. Retirez les pinces à reliure et pressez l’extrémité du complexe. Pour desserrer la glissière enveloppée de ruban adhésif, retirez-la et placez-la sur le banc pour une utilisation ultérieure.

Ensuite, à l’aide d’une paire de pinces comme coin. Séparez le joint de recouvrement du complexe media agros de la glissière de support et jetez la glissière de support. N’utilisez pas de mouvement de levier pour séparer le complexe de joint de lamelle, car cela pourrait entraîner le freinage de la glissière de recouvrement et/ou l’adhérence du support à la glissière de support.

Après avoir retiré la glissière de support, placez le joint de couverture du complexe de support aray sur la glissière enveloppée de ruban adhésif avec le joint vers le haut. Placez ce complexe à côté d’un brûleur pour permettre à toute l’humidité visible de s’évaporer de la surface du média agros nouvellement exposée. Ne laissez pas le média agros sécher plus d’une minute.

Comme cela pourrait avoir un impact sur le comportement en essaim de M Zant, procédez au placage des cellules sur le complexe de test nouvellement préparé. Une fois que l’excès d’humidité s’est évaporé du support d’étanchéité de la lamelle, le complexe agros aspire 0,5 microlitre des cellules concentrées pour les déposer sur le support. Les aéros enfoncent la pointe de la pipette avant de s’approcher des agros de support.

Une goutte de cellules apparaît au bas de la pointe de la pipette, ce qui facilite le dépôt des cellules sans que la pointe ne touche les agros du milieu. Une dépression à la surface de l’agros peut modifier le comportement de l’essaim. Déplacez la pipette vers le bas pour distribuer les cellules à environ un millimètre du disque nutritif intégré.

Tirez ensuite la pipette vers le haut. De cette façon, on s’assure que l’essaim est circulaire. Une fois les cellules déposées, placez le complexe à côté du brûleur pour permettre aux cellules de sécher pendant 20 secondes maximum.

Après séchage, alignez l’ensemble de joint coulissant formant le fond du complexe avec le joint sur le couvercle. Complexe de cellules acro de support de joint coulissant formant le sommet du complexe. Appuyez doucement ensemble pour former un joint.

Nettoyez les surfaces de la glissière dans la lamelle avec une lingette Kim pour enlever tout résidu afin d’éviter la condensation. Placez le complexe sur la platine de microscope chauffée immédiatement après avoir nettoyé les lames avec la lame vers le bas et le couvercle vers le haut. Si de la condensation s’est formée, laissez le complexe de lames reposer sur la platine chauffée pendant plusieurs secondes avant de démarrer le logiciel d’acquisition d’images.

Afin de préparer le film, choisissez l’objectif approprié, deux x quatre x ou 10 x au microscope. Allumez l’appareil photo et le microscope et vérifiez les niveaux de lumière pour vous assurer que la lumière n’est pas trop intense. Démarrez l’ordinateur et ouvrez le programme d’acquisition d’images.

Cliquez sur la fenêtre d’image en direct et faites la mise au point du microscope. L’image semble similaire à celle montrée ici. Commencez à acquérir des images.

Assurez-vous de vérifier régulièrement la mise au point pendant la première heure, car la gélose médiatique a tendance à se stabiliser, ce qui entraîne une dérive de la mise au point. Une fois l’acquisition de l’image terminée, transférez les images acquises pour le stockage. Décomposez le complexe de toboggans en trempant dans de l’éthanol à 90 % pendant la nuit ou TOLA les joints pour les réutiliser.

Cette vidéo en accéléré les montre soumis au test de suivi décrit ici. La cadence de capture est d’une image par minute avec un grossissement de 20 x, la cadence de lecture est de 60 images par seconde. Ce film en accéléré montre une population d’autres cellules où 1 % des cellules expriment la GFP.

Le film a été compilé en fusionnant le contraste de phase alternatif et les images fluorescentes. Le test a été réalisé sur C-T-T-Y-E à 1 % La vitesse de capture est d’une image par minute avec un grossissement de 100 x. Cette vidéo en accéléré montre la motilité planée de M Anthes.

Ce test a été réalisé sur C-T-T-Y-E à 1 %La vitesse de capture est d’une image par minute à un grossissement de 100 x. Cette vidéo TimeLapse montre la motilité des contractions de P OSA. Ce test a été réalisé sur LB à 1 %Le taux de capture d’Aros est d’une image par minute.

À un grossissement de 20x, la vitesse de lecture est de 60 images par seconde. Ce film en accéléré montre que Smar ressent une motilité grouillante. Ce test a été réalisé sur LB et le taux de capture de 1 % d’Aris est d’une image par minute.

À un grossissement de 20x, la vitesse de lecture est de 60 images par seconde. Cette vidéo en accéléré montre la motilité de glissement EGT. Ce test a été réalisé sur LB à 0,5 % Le taux de capture de la rose de l’étiquette est d’une image par minute alors qu’un grossissement de 20 x la vitesse de lecture est de 120 images par seconde en raison de la fragilité de 0,5 % apparu en lv.

Ce test utilise l’utilisation des joints plus grands vus dans la figure B.Nous venons de vous montrer comment générer des films en accéléré de biofilms bactériens. Lors de cette procédure. Il est important de ne pas oublier de prendre son temps et d’être le plus précis possible pour obtenir des résultats cohérents.

Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.