Name: Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) pour doser modification des histones dynamique dans lexpression génique dans les cellules humaines Activé (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-29T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 20 s
Description: Découvrez la technique ChIP pour étudier les modifications dynamiques des histones lors de l'activation de l'expression génique par le signal STAT1 dans les cellules humaines. Cette méthode permet de quantifier l'occupation des facteurs de transcription.

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Ce travail est soutenu par l&#39;Université de Virginie, l&#39;Université de Virginie Cancer Center et The F. Thomas et Kate Miller Jeffress Memorial Trust. Nous remercions le James E. Darnell Lab (Rockefeller University), le Laboratoire de Robert Ross (Université Fordham) pour les lignées cellulaires.

PLANIFICATION La veille d'une expérience de ChIP est prévu, les cellules doivent être cultivées de sorte qu'un nombre suffisant est disponible. Supposons que chaque dosage, il faudra ChIP ~ 1 à 1,5 x 10 7 cellules. Prévoyez toujours de faire les deux contrôles négatifs (IgG) et positifs (anticorps pan histones) et des expériences en double. Astuce - Pour les cellules 2FTGH, chaque dosage puce nécessite environ une boîte de culture 15 cm de tissu à 80% de confluence. PARTIE 1: PRÉPARER ET EFFECTUER CHROMATINE ChIP <ol><li> Retirez les milieux de culture et d'induire les cellules pour le temps nécessaire avec 20 ml de 10% de sérum de veau cosmique (CSC) / DMEM contenant de l'IFN-gamma à 5 ng / mL. Remplacez le support sur les plaques non induite avec 20 ml de 10% CCS / DMEM ainsi. </li><li> Dans une hotte, ajouter 540 uL de formaldéhyde 37% à 20 mL de médias (1% en concentration finale) dans le plat de 15 cm. Astuce - plaque inclinable et ajouter le formaldéhyde à la piscine des médias -, puis la plaque de roche pour l'étendre uniformément. </li><li> Permettre la réticulation se dérouler pendant 10 minutes à température ambiante. </li><li> Ajouter à la glycine 0,125 M concentration finale de cesser de réticulation. </li><li> Vide aspirer les médias et laver les cellules une fois avec 10 ml de phosphate de glace froide saline tamponnée (PBS). </li><li> Recueillir les cellules avec un racleur de cellules dans ~ PBS 7 ml et combiner des cellules (à partir de 6 plaques) qui ont été traités de manière identique dans 50 ml tube conique sur la glace. </li><li> Centrifugeuse (Beckman Coutler Allegra 12-R Centrifugeuse) à 1800 rpm à 4 ° C pendant 5 minutes et aspirer le PBS. Astuce - Snap geler la cellule si arrêtant ici et conserver à -80 ° C à granulés </li><li> Reprendre le culot cellulaire dans 4 ml de tampon Gonflement (25 mM HEPES pH 7,8, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0,1% NP40. Ajouter 1 mM de DTT, les inhibiteurs de protéase complète et refroidir sur glace avant utilisation) et le transfert à un 15 ml tube conique. Astuce - Ce volume tampon gonflement est approprié pour une mise en commun 6 plaques (~ 6-9 x 10 7 cellules). Tampon plus ou moins pourrait changer l'efficacité douncing. </li><li> Incuber la suspension cellulaire sur la glace pendant 10 minutes. </li><li> Transfert de suspension pour une pré-réfrigérée douncer 15 ml (Wheaton) et Dounce 20 coups avec son pilon A. </li><li> Transfert dounced cellules vers un tube 15 ml conique sur la glace. </li><li> Centrifuger à 2500 rpm pendant 5 minutes à 4 ° C et jeter le surnageant. </li><li> Reprendre le nucléaire culot (~ 200 uL de 6 plaques) dans 3 ml (15 volumes granulés) de tampon de sonication (50 mM HEPES pH 7,9, NaCl 140 mM, EDTA 1 mM, 1% Triton X-100, le désoxycholate de sodium à 0,1%, 0,1% SDS. Ajouter les inhibiteurs de protéase complète et refroidir sur glace juste avant l'utilisation). Astuce - Ce volume tampon de sonication est approprié pour une mise en commun 6 plaques (~ 6-9 x 10 7 cellules). Tampon plus ou moins pourrait changer l'efficacité sonication. </li><li> Soniquer suspension de noyaux sur la glace pendant 10 cycles (20 secondes on/40 secondes off / réglage de l'amplitude 8) en utilisant un sonicateur Misonix 3000 équipé de la micropointe. Ce se traduit généralement par des fragments de chromatine en moyenne 200-1000 pb en taille. Astuce - Parce sonicateurs varient, l'efficacité sonication doit être déterminée empiriquement. Pour ce faire, de prendre des aliquotes de 20 uL avant sonication et après chaque cycle de sonication. La chaleur de ces échantillons à 65 ° C pendant 4 heures. Ajouter tampon de chargement de l'ADN et exécuter un standard de 1% d'agarose / TBE gel de visualiser les fragments d'ADN.) </li><li> Transfert soniqué matériel à un tube à centrifuger et centrifuger SS34 pendant 20 minutes à 4 ° C à 13000 rpm dans un rotor SS34 (Sorvall Centrifugeuse RC6 plus) pour obtenir un culot ce qui est habituellement une petite quantité de débris cellulaires. </li><li> Soigneusement transférer le surnageant dans un tube de 15 ml conique sur la glace. </li><li> Pré-clairement en ajoutant 360 uL de sperme de saumon ADN / protéine A ou G agarose perles lisier et bascule à 4 ° C pendant au moins 30 minutes. Astuce - Cette étape réduit le bruit dans le test qui résulterait de la non-événements spécifiques contraignantes. </li><li> Centrifuger à 1000 rpm à 4 ° C pendant 5 minutes pour sédimenter les billes d'agarose. </li><li> Transfert prédédouanés surnageant dans un autre tube de 15 ml conique sur la glace. </li><li> Mesurer la A260 unités de la chromatine prédédouanés et ajuster le volume avec le tampon de sonication à quatre (4) unités A260 (0,2 mg / ml en supposant une unité = 0.050 A260 mg / ml) Astuce - Pour mesurer l'A260 unités, diluer 10 uL d'prédédouanés chromatine dans 190 uL DDW; vierge spectrophotomètre avec 10 uL dans tampon de sonication DDW 190 uL. </li><li> Economisez 75 uL de la chromatine (à 4 unités A260) que l'échantillon d'entrée et de stocker à 20 ° C jusqu'au moment de renverser réticule. Astuce - Cette étape est cruciale pour l'analyse des données. Ne négligez pas de prendre la partie aliquote d'entrée. </li><li> Aliquoter la chromatine préparées à 1,7 ml microtubes de sur iCE que aliquotes de 1 ml. Astuce - Si l'arrêt ici, snap geler la chromatine préparées sur glace sèche et stocker à -80 ° C. NB: la chromatine stockées peuvent se dégrader, produisant moins de résultats optimaux, afin d'éviter si possible. </li><li> Ajouter les anticorps ChIP-grade aux échantillons induits et non induits jeux en double. Ajouter IgG (2 mg) et d'anticorps pan Histone H3 (15 uL) que les contrôles positifs et négatifs induits et non induits aux séries d'échantillons. Astuce - La quantité d'anticorps à utiliser doit être déterminée de manière empirique ou voir la fiche produit du fournisseur pour des montants proposés. Typiquement 1-2 mg d'un anticorps ChIP-grade qui fonctionne bien. Le volume approprié doit être déterminée empiriquement pour des anticorps qui sont fournis que le sérum. </li><li> Tous les tubes rock la nuit à 4 ° C. </li></ol> PARTIE 2: COLLECT immunocomplexes <ol><li> Ajouter 60 ul de sperme de saumon ADN / protéine A ou protéine G billes d'agarose coulis à tous les tubes. Protéines Astuce Utilisez A pour les anticorps polyclonaux de lapin et de protéines G pour les anticorps monoclonaux de souris. </li><li> Rock à 4 ° C pendant au moins 60 minutes. </li><li> Pellet les complexes immuns (billes d'agarose) par microfuging délicatement à 2000 rpm à 4 ° C pendant 3 minutes. </li><li> Aspirer le surnageant. </li><li> Laver les immunocomplexes avec 1 ml de chacun des tampons de lavage suivants pendant 10 minutes avec bascule à 4 ° C. Microfuge pendant 3 minutes à 2000 rpm à 4 ° C entre chaque lavage et aspirer le surnageant. Conserver les échantillons refroidis sur la glace. Ajouter PMSF juste avant l'utilisation. <ul><li> Lavez faible teneur en sel - 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM de Tris-Cl, pH 8,0, NaCl 150 mM, PMSF 1 mM </li><li> Laver en sel élevée - 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM de Tris-Cl, pH 8,0, NaCl 500 mM, PMSF 1 mM </li><li> LiCl Laver - 0,25 M LiCl, 1% NP-40, le désoxycholate de sodium à 1%, EDTA 1 mM, 10 mM de Tris-Cl, pH 8,0, 1 mM de PMSF </li><li> Lavez TE - deux lavages avec du tampon TE -10 mM de Tris-Cl, pH 8,0, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM </li></ul></li><li> Retirez le tampon de lavage finale TE et aux billes, ajouter 500 uL de tampon d'élution (50 mM Tris-Cl, pH 8,0, EDTA 10 mM, SDS 1%). Astuce - Le tampon d'élution doit être préparée fraîchement. </li><li> Vortex à mélanger des billes d'agarose dans un tampon d'élution et de la chaleur pendant 30 minutes à 65 ° C. Astuce - Vortex chaque tube au moins toutes les 10 minutes au cours de cette 30 minutes. </li><li> Microfuge pendant 30 secondes à 2000 tpm et le transfert de l'éluant à un tube de centrifugeuse de nouvelles. Astuce - Lors de l'élution, décongeler vos échantillons d'entrée et ajouter 500 uL de tampon d'élution à chacun. Inclure ces échantillons à toutes les étapes à venir. </li><li> Ajouter 5 M de NaCl à une concentration finale de 200 mM à tous les échantillons et les vortex. </li><li> Incuber à 65 ° C pendant une nuit (ou au moins 4 heures). </li></ol> PARTIE 3: ChIP'd purifier et l'ADN ENTRÉE <ol><li> Microfuge tous les échantillons pendant 30 secondes pour recueillir la condensation sur les paupières. </li><li> Ajouter 1 microlitre de RNAse A (10 U / uL) à chaque tube et incuber à température ambiante pendant 15 minutes. </li><li> Ajouter 10 uL d'EDTA 0,5 M, 40 uL 0,5 M de Tris-Cl pH 6,5, 2 pl protéinase K (10 mg / ml) et incuber à 45 ° C pendant 60 minutes. Astuce Préparer un master mix de ces réactifs et ajouter 52 uL dans chaque tube. </li><li> Extrait d'alcool phénol / chloroforme / alcool isoamylique puis chloroforme / alcool isoamylique extraire les échantillons. </li><li> Ajouter 2 glycogène uL (25 ug / uL) et 0,1 volumes de pH 3M acétate de Na 5,2 et vortex. </li><li> Ajouter 2,5 volumes d'éthanol 100% et le vortex. </li><li> Incuber à 20 ° C la nuit. </li></ol> PARTIE 4: ChIP'd purifier et l'ADN apport continu <ol><li> Échantillons Microfuge pour un minimum de 20 minutes à 13000 rpm à 4 ° C pour précipiter l'ADN / glycogène pellets. </li><li> Laver avec de l'ADN / glycogène boulettes avec 1 ml d'éthanol à 70%. </li><li> Air sec les granulés secs ou rapidement dans l'ADN Savant centrifugeuse sous vide vitesse. Astuce - Ne pas trop sécher les ADN. </li><li> Resuspendre l'ADN / glycogène granulés dans 200 ul de tampon TE. </li><li> L'ADN (1 pi) est prêt pour la quantification par PCR en temps réel. L'ADN magasin reste à 20 ° C. Astuce - Utiliser plus de 1 pl d'ADN peuvent inhiber les réactions PCR en temps réel, afin d'échelle avec prudence. </li></ol> Partie 5: résultats représentatifs: Les échantillons d'ADN et de ChIP entrée sont quantifiées avec Real-Time PCR 7,8 (Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System) utilisant des amorces spécifiques pour le locus du gène d'intérêt. Amorces qui séquence génomique cible connue pour être enrichi ou manquant de la modification des histones être testés peuvent être utilisés comme contrôles positifs et négatifs ainsi. Les données sont présentées comme pourcentage de l'entrée. La procédure de puce devrait être entièrement repeated avec trois biologiques réplique à s'assurer que les changements signalés dans les modifications des histones sont statistiquement significatives. Il ya plusieurs questions importantes à considérer lors de l'utilisation PCR en temps réel pour quantifier l'ADN, y compris la conception d'apprêt, efficacité de la PCR, et la manière appropriée pour calculer les pour cent des procédures d'entrée et de normalisation. Lorsque profilage Occupation modification des histones sur un gène, l'efficacité de PCR doit être cohérente entre tous les couples d'amorces. Le fabricant en temps réel du système de PCR peuvent fournir les informations nécessaires et la formation. La figure 1 montre des résultats représentatifs de la chromatine au cours immunoprécipité STAT1 activation du gène IRF1 9, déclenchée par l'IFN-γ. <img src="/files/ftp_upload/2053/2053fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Occupation de STAT1, l'ARN polymérase II et H3K36me3 est dynamique lors de STAT1 activation du gène IRF1. (A, B, C) ​​à copeaux avec α-H3K36me3, α-α-STAT1 et Pol II de la chromatine recueillies à partir des cellules 2FTGH induite par l'IFN-γ pour 30 minutes (carrés rouges), de 1,5 heures (cercles bleus), 5 heures ( triangles verts) ou non induits (losanges noirs). IgG est le contrôle négatif (gris croix). (D) Pan H3 est le contrôle positif et montre l'occupation des histones dans le locus dans l'induit (cercles bleus) et les conditions non induits (losanges noirs). La baisse de -5 pb est dû à l'épuisement des nucléosomes qui se trouve sur les sites de démarrage de la transcription.

<ol><li>Levy, D., Darnell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling%3A+Stats%3A+transcriptional+control+and+biological+impact%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Signalling: Stats: transcriptional control and biological impact.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3, 651-662 (2002).</li>
<li>Bromberg, J., Darnell, J. E. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+STATs+in+transcriptional+control+and+their+impact+on+cellular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The role of STATs in transcriptional control and their impact on cellular function.</a> Oncogene. 19, 2468-2473 (2000).</li>
<li>Hu, X., Ivashkiv, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-regulation+of+signaling+pathways+by+interferon-gamma%3A+implications+for+immune+responses+and+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cross-regulation of signaling pathways by interferon-gamma: implications for immune responses and autoimmune diseases.</a> Immunity. 31, 539-550 (2009).</li>
<li>Campos, E. I., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histones%3A+annotating+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Histones: annotating chromatin.</a> Annu Rev Genet. 43, 559-599 (2009).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+Modifications+and+Their+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin Modifications and Their Function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li>
<li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293, 1074-1080 (2001).</li>
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<li>Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P. S., Griffith, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+amplification+and+detection+of+specific+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%28N+Y%29%22%5BJournal%5D)">Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences.</a> Biotechnology (N Y). 10, 413-417 (1992).</li>
<li>Kroger, A., Koster, M., Schroeder, K., Hauser, H., Mueller, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activities+of+IRF-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Interferon+Cytokine+Res%22%5BJournal%5D)">Activities of IRF-1.</a> J Interferon Cytokine Res. 22, 5-14 (2002).</li>
<li>Ross, R. A., Spengler, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neuroblastoma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cancer+biology%22%5BJournal%5D)">Human neuroblastoma stem cells.</a> Seminars in cancer biology. 17, 241-247 (2007).</li>
</ol>

Le protocole décrit ChIP a été utilisé avec succès dans le laboratoire d&#39;essai de plus de vingt différentes modifications des histones. En outre, nous avons caractérisé les changements dans l&#39;occupation des facteurs de transcription, enzymes de modification des histones, protéines qui reconnaissent modifications des histones et la transcription de l&#39;ARN polymérase II machines, à l&#39;IFN-γ de plusieurs gènes induits. Nous avons également utilisé la procédure de caractériser les changements dans les modifica...

<table><tbody><tr><td>Formaldéhyde à 37 %</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme/alcool isoamylique</td><td>Acros Organics</td><td>AC32715-5000</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteurs complets de protéase, format mini</td><td>Roche Group</td><td>1836153</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau cosmique</td><td>Hyclone</td><td>SH30087.04N</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone</td><td>SH30243</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP118-500</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Pharmco Products, Inc.</td><td>zp1110EP</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Roche Group</td><td>100149</td><td></td></tr><tr><td>Glycogène</td><td>Roche Group</td><td>901393</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>IFN-gamma</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>285-IF-100</td><td></td></tr><tr><td>IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-005-003</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>MP Biomedicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4408</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Acétate de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de désoxycholate de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP349-100</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>US Biological</td><td>N3500</td><td></td></tr><tr><td>Anti-histone H3, CT, pan</td><td>EMD Millipore</td><td>07-690</td><td></td></tr><tr><td>Phénol/chloroforme/isoamyl</td><td>Fisher Scientific</td><td>108-95-2</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>EMD Millipore</td><td>50-230-0316</td><td></td></tr><tr><td>Protéinase K</td><td>5 PRIME</td><td>2500140</td><td></td></tr><tr><td>ARNase A</td><td>5 PRIME</td><td>2500130</td><td></td></tr><tr><td>ADN de sperme de saumon/agarose liée à la protéine A</td><td>EMD Millipore</td><td>16-157</td><td></td></tr><tr><td>ADN de sperme de saumon/agarose liée à la protéine G</td><td>EMD Millipore</td><td>16-201</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Cl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Acros Organics</td><td>327372500</td><td></td></tr><tr><td>Anti-K36me3</td><td>Abcam</td><td>ab9050</td><td></td></tr><tr><td>Anti-STAT1</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-345X</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ARN polymérase II</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-899</td><td></td></tr></tbody></table>

immunoprécipitation de la chromatine (chip) pour doser modification des histones dynamique dans l&#39;expression génique dans les cellules humaines activé

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

En réponse à une variété de ligands extracellulaires, la STAT (transducteur de signal et activateur de la transcription) des facteurs de transcription sont rapidement recrutés dans leur état ​​latent dans le cytoplasme aux récepteurs de surface cellulaire où ils sont activés par la phosphorylation d&#39;un seul résidu tyrosine 1. Ils ont ensuite dimériser et translocation vers le noyau de conduire la transcription de gènes cibles, affectant la croissance, la différenciation, l&#39;homéostasie et la réponse immunitaire. Il n&#39;est pas surprenant, étant donné leur implication dans les processus généralisé de cellules normales, dérèglement de la fonction STAT contribue à la maladie humaine, en particulier pour les cancers et les maladies auto-immunes 2 3. Il est bien établi que la transcription est régulée par des modifications au modèle de la chromatine 4,5. Ces modifications comprennent les activités de l&#39;ATP-dépendant de complexes, ainsi que covalentes modifications des histones et la méthylation de l&#39;ADN 6. Parce que l&#39;activation de l&#39;expression génique STAT est à la fois rapide et transitoire, elle nécessite des mécanismes spécifiques permettant de moduler le modèle chromatine au locus du gène STAT-dépendante. Pour définir ces mécanismes, nous caractérisons les modifications des histones et les activités enzymatiques qui les génèrent à des loci génétiques qui répondent à STAT. Ce protocole décrit immunoprécipitation de la chromatine, une méthode qui est précieux pour l&#39;étude de la STAT à la chromatine dans l&#39;expression des gènes activés.

Ce protocole décrit comment la chromatine immunoprécipitation (ChIP) est utilisée pour étudier les altérations dynamiques du modèle de la chromatine qui régulent la transcription induite par une voie de transduction du signal.

Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) pour doser modification des histones dynamique dans l&#39;expression génique dans les cellules humaines Activé

En réponse à divers ligands extracellulaires, les facteurs de transcription STAT (signal transducer and activator of transcription) sont rapidement recrutés...

L'expérience de puces permet de surveiller les changements dynamiques des modifications d'histones qui se produisent lors de l'expression génique activée par STAT1. Les variations d'occupation des facteurs de transcription, des complexes modificateurs d'histones et du mécanisme transcriptionnel lui-même peuvent également être analysées de cette manière. Pour commencer le dosage, les cellules sont induites par l'interféron gamma afin d'activer la signalisation STAT1, puis fixées au moyen de formaldéhyde et collectées. Ensuite, procéder à l'isolement des noyaux et à la sonication, qui fragmente la chromatine en morceaux d'environ 200 à 1000 paires de bases. Ajouter ensuite un anticorps ciblant la protéine ou la modification d'histone d'intérêt, puis précipiter les complexes immuns.Les complexes immuno sont lavés, les liaisons croisées sont inversées et l'ADN est purifié. Les modifications histologiques ou le recrutement de protéines vers des régions spécifiques d'un gène peuvent être déterminés par une analyse en PCR quantitative en temps réel de l'ADN immunoprécipité. Bonjour, je m'appelle Lauren Borow du laboratoire de la Dre Melissa Hendrickson et du Département de biologie de l'U

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La différenciation de l'ESC coïncide avec un type de cellule des changements spécifiques dans la structure et la composition de la chromatine. La détection de ces changements fournit de précieuses indications sur les mécanismes qui définissent stemcellness et la différenciation cellulaire. Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) représente une méthode utile pour disséquer les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la différenciation des cellules souches.

Immunoprécipitation de la chromatine des cellules souches embryonnaires humaines

En combinant natif et réticulation immunoprécipitation de la chromatine à haute résolution de spectrométrie de masse, l'approche ChroP permet de disséquer l'architecture protéomique composite de modifications des histones, des variantes et des protéines non-histoniques synergie au domaines de la chromatine fonctionnellement distinctes.

L&#39;approche ChroP Combine puce et la spectrométrie de masse à Disséquer protéomiques paysages Locus spécifiques de la chromatine

Ce travail décrit un protocole pour l'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) en utilisant une ligne de cellules T mûres de souris. Ce protocole est approprié pour étudier la répartition des marques d'histones spécifiques sur des sites promoteurs spécifiques ou génométriques.

Immunoprécipitation à la chromatine (ChIP) dans les lignes de cellules T de souris

Nous décrivons ici une immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) et le protocole de préparation de bibliothèque de ChIP-seq pour générer des profils épigénomique global d’échantillons embryonnaires de poulet de faible abondance.

Chromatine protocole d’immunoprécipitation (puce) pour les échantillons embryonnaires de faible abondance

Nous décrivons ici un protocole pour l’immunoprécipitation de la chromatine des histones modifiées de la levure Saccharomyces cerevisiae. ADN immunoprécipitée est ensuite utilisé pour la PCR quantitative pour interroger l’abondance et la localisation des modifications post-traductionnelles des histones dans tout le génome.

Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) des Modifications d’Histone de Saccharomyces cerevisiae

Réglementation de l’environnement de la chromatine est un processus essentiel nécessaire pour l’expression des gènes appropriés. Nous décrivons ici une méthode pour contrôler l’expression des gènes par le recrutement de modificateurs de la chromatine machines de façon gène-spécifique et réversible.

Réprimer la Transcription du gène en redirigeant la machinerie cellulaire avec des modificateurs chimiques épigénétiques

Les auteurs décrivent un protocole étape par étape pour la chromatine tandem immunoprécipitation séquençage (tChIP-Seq) qui permet l’analyse de la modification d’histone génome cellule-spécifiques au type.

TChIP-Seq : Type-spécifiques des cellules épigénome profilage

L'immunoprécipitation de chromatine (ChIP) est un outil puissant pour comprendre les mécanismes moléculaires de la régulation génique. Cependant, la méthode implique des difficultés dans l'obtention de la fragmentation de chromatine reproductible par tonte mécanique. Ici, nous fournissons un protocole amélioré pour un jeu d'enfant en utilisant la digestion enzymatique.

Chromatin Immunoprecipitation Assay Utilisation de nucléases micrococciques dans les cellules de mammifères

Les inhibiteurs de l’hétone acétyltransférases (HATs, également connu sous le nom d’acétyltransférases de lysine), tels que CBP/p300, sont des traitements potentiels pour traiter le cancer. Cependant, des méthodes rigoureuses pour valider ces inhibiteurs sont nécessaires. Trois méthodes in vitro pour la validation incluent des essais de HAT avec des acétyltransférases recombinantes, l’immunoblotting pour l’acétylation d’histone dans la culture cellulaire, et ChIP-qPCR.

Tests de validation des inhibiteurs de l’histone d’acétyltransférase

Ce protocole se concentre sur la préparation de la chromatine à partir de tissus congelés et convient à l’immunoprécipitation de la chromatine par réticulation (X-ChIP) suivie d’une analyse PCR quantitative (X-ChIP-qPCR) ou d’approches de séquençage de nouvelle génération (X-ChIP-seq).

Extraction de chromatine à partir de tissu hépatique chimérique congelé pour l’analyse de l’immunoprécipitation de la chromatine

Découvrez la technique ChIP pour étudier les modifications dynamiques des histones lors de l'activation de l'expression génique par le signal STAT1 dans les cellules humaines. Cette méthode permet de quantifier l'occupation des facteurs de transcription.

Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) pour doser modification des histones dynamique dans lexpression génique dans les cellules humaines Activé (Vidéo) | JoVE Journal

Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) pour doser modification des histones dynamique dans l'expression génique dans les cellules humaines Activé

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