Name: Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) pour doser modification des histones dynamique dans lexpression génique dans les cellules humaines Activé (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-29T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 20 s
Description: Découvrez la technique ChIP pour étudier les modifications dynamiques des histones lors de l'activation de l'expression génique par le signal STAT1 dans les cellules humaines. Cette méthode permet de quantifier l'occupation des facteurs de transcription.

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Ce travail est soutenu par l&#39;Université de Virginie, l&#39;Université de Virginie Cancer Center et The F. Thomas et Kate Miller Jeffress Memorial Trust. Nous remercions le James E. Darnell Lab (Rockefeller University), le Laboratoire de Robert Ross (Université Fordham) pour les lignées cellulaires.

PLANIFICATION La veille d'une expérience de ChIP est prévu, les cellules doivent être cultivées de sorte qu'un nombre suffisant est disponible. Supposons que chaque dosage, il faudra ChIP ~ 1 à 1,5 x 10 7 cellules. Prévoyez toujours de faire les deux contrôles négatifs (IgG) et positifs (anticorps pan histones) et des expériences en double. Astuce - Pour les cellules 2FTGH, chaque dosage puce nécessite environ une boîte de culture 15 cm de tissu à 80% de confluence. PARTIE 1: PRÉPARER ET EFFECTUER CHROMATINE ChIP <ol><li> Retirez les milieux de culture et d'induire les cellules pour le temps nécessaire avec 20 ml de 10% de sérum de veau cosmique (CSC) / DMEM contenant de l'IFN-gamma à 5 ng / mL. Remplacez le support sur les plaques non induite avec 20 ml de 10% CCS / DMEM ainsi. </li><li> Dans une hotte, ajouter 540 uL de formaldéhyde 37% à 20 mL de médias (1% en concentration finale) dans le plat de 15 cm. Astuce - plaque inclinable et ajouter le formaldéhyde à la piscine des médias -, puis la plaque de roche pour l'étendre uniformément. </li><li> Permettre la réticulation se dérouler pendant 10 minutes à température ambiante. </li><li> Ajouter à la glycine 0,125 M concentration finale de cesser de réticulation. </li><li> Vide aspirer les médias et laver les cellules une fois avec 10 ml de phosphate de glace froide saline tamponnée (PBS). </li><li> Recueillir les cellules avec un racleur de cellules dans ~ PBS 7 ml et combiner des cellules (à partir de 6 plaques) qui ont été traités de manière identique dans 50 ml tube conique sur la glace. </li><li> Centrifugeuse (Beckman Coutler Allegra 12-R Centrifugeuse) à 1800 rpm à 4 ° C pendant 5 minutes et aspirer le PBS. Astuce - Snap geler la cellule si arrêtant ici et conserver à -80 ° C à granulés </li><li> Reprendre le culot cellulaire dans 4 ml de tampon Gonflement (25 mM HEPES pH 7,8, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0,1% NP40. Ajouter 1 mM de DTT, les inhibiteurs de protéase complète et refroidir sur glace avant utilisation) et le transfert à un 15 ml tube conique. Astuce - Ce volume tampon gonflement est approprié pour une mise en commun 6 plaques (~ 6-9 x 10 7 cellules). Tampon plus ou moins pourrait changer l'efficacité douncing. </li><li> Incuber la suspension cellulaire sur la glace pendant 10 minutes. </li><li> Transfert de suspension pour une pré-réfrigérée douncer 15 ml (Wheaton) et Dounce 20 coups avec son pilon A. </li><li> Transfert dounced cellules vers un tube 15 ml conique sur la glace. </li><li> Centrifuger à 2500 rpm pendant 5 minutes à 4 ° C et jeter le surnageant. </li><li> Reprendre le nucléaire culot (~ 200 uL de 6 plaques) dans 3 ml (15 volumes granulés) de tampon de sonication (50 mM HEPES pH 7,9, NaCl 140 mM, EDTA 1 mM, 1% Triton X-100, le désoxycholate de sodium à 0,1%, 0,1% SDS. Ajouter les inhibiteurs de protéase complète et refroidir sur glace juste avant l'utilisation). Astuce - Ce volume tampon de sonication est approprié pour une mise en commun 6 plaques (~ 6-9 x 10 7 cellules). Tampon plus ou moins pourrait changer l'efficacité sonication. </li><li> Soniquer suspension de noyaux sur la glace pendant 10 cycles (20 secondes on/40 secondes off / réglage de l'amplitude 8) en utilisant un sonicateur Misonix 3000 équipé de la micropointe. Ce se traduit généralement par des fragments de chromatine en moyenne 200-1000 pb en taille. Astuce - Parce sonicateurs varient, l'efficacité sonication doit être déterminée empiriquement. Pour ce faire, de prendre des aliquotes de 20 uL avant sonication et après chaque cycle de sonication. La chaleur de ces échantillons à 65 ° C pendant 4 heures. Ajouter tampon de chargement de l'ADN et exécuter un standard de 1% d'agarose / TBE gel de visualiser les fragments d'ADN.) </li><li> Transfert soniqué matériel à un tube à centrifuger et centrifuger SS34 pendant 20 minutes à 4 ° C à 13000 rpm dans un rotor SS34 (Sorvall Centrifugeuse RC6 plus) pour obtenir un culot ce qui est habituellement une petite quantité de débris cellulaires. </li><li> Soigneusement transférer le surnageant dans un tube de 15 ml conique sur la glace. </li><li> Pré-clairement en ajoutant 360 uL de sperme de saumon ADN / protéine A ou G agarose perles lisier et bascule à 4 ° C pendant au moins 30 minutes. Astuce - Cette étape réduit le bruit dans le test qui résulterait de la non-événements spécifiques contraignantes. </li><li> Centrifuger à 1000 rpm à 4 ° C pendant 5 minutes pour sédimenter les billes d'agarose. </li><li> Transfert prédédouanés surnageant dans un autre tube de 15 ml conique sur la glace. </li><li> Mesurer la A260 unités de la chromatine prédédouanés et ajuster le volume avec le tampon de sonication à quatre (4) unités A260 (0,2 mg / ml en supposant une unité = 0.050 A260 mg / ml) Astuce - Pour mesurer l'A260 unités, diluer 10 uL d'prédédouanés chromatine dans 190 uL DDW; vierge spectrophotomètre avec 10 uL dans tampon de sonication DDW 190 uL. </li><li> Economisez 75 uL de la chromatine (à 4 unités A260) que l'échantillon d'entrée et de stocker à 20 ° C jusqu'au moment de renverser réticule. Astuce - Cette étape est cruciale pour l'analyse des données. Ne négligez pas de prendre la partie aliquote d'entrée. </li><li> Aliquoter la chromatine préparées à 1,7 ml microtubes de sur iCE que aliquotes de 1 ml. Astuce - Si l'arrêt ici, snap geler la chromatine préparées sur glace sèche et stocker à -80 ° C. NB: la chromatine stockées peuvent se dégrader, produisant moins de résultats optimaux, afin d'éviter si possible. </li><li> Ajouter les anticorps ChIP-grade aux échantillons induits et non induits jeux en double. Ajouter IgG (2 mg) et d'anticorps pan Histone H3 (15 uL) que les contrôles positifs et négatifs induits et non induits aux séries d'échantillons. Astuce - La quantité d'anticorps à utiliser doit être déterminée de manière empirique ou voir la fiche produit du fournisseur pour des montants proposés. Typiquement 1-2 mg d'un anticorps ChIP-grade qui fonctionne bien. Le volume approprié doit être déterminée empiriquement pour des anticorps qui sont fournis que le sérum. </li><li> Tous les tubes rock la nuit à 4 ° C. </li></ol> PARTIE 2: COLLECT immunocomplexes <ol><li> Ajouter 60 ul de sperme de saumon ADN / protéine A ou protéine G billes d'agarose coulis à tous les tubes. Protéines Astuce Utilisez A pour les anticorps polyclonaux de lapin et de protéines G pour les anticorps monoclonaux de souris. </li><li> Rock à 4 ° C pendant au moins 60 minutes. </li><li> Pellet les complexes immuns (billes d'agarose) par microfuging délicatement à 2000 rpm à 4 ° C pendant 3 minutes. </li><li> Aspirer le surnageant. </li><li> Laver les immunocomplexes avec 1 ml de chacun des tampons de lavage suivants pendant 10 minutes avec bascule à 4 ° C. Microfuge pendant 3 minutes à 2000 rpm à 4 ° C entre chaque lavage et aspirer le surnageant. Conserver les échantillons refroidis sur la glace. Ajouter PMSF juste avant l'utilisation. <ul><li> Lavez faible teneur en sel - 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM de Tris-Cl, pH 8,0, NaCl 150 mM, PMSF 1 mM </li><li> Laver en sel élevée - 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM de Tris-Cl, pH 8,0, NaCl 500 mM, PMSF 1 mM </li><li> LiCl Laver - 0,25 M LiCl, 1% NP-40, le désoxycholate de sodium à 1%, EDTA 1 mM, 10 mM de Tris-Cl, pH 8,0, 1 mM de PMSF </li><li> Lavez TE - deux lavages avec du tampon TE -10 mM de Tris-Cl, pH 8,0, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM </li></ul></li><li> Retirez le tampon de lavage finale TE et aux billes, ajouter 500 uL de tampon d'élution (50 mM Tris-Cl, pH 8,0, EDTA 10 mM, SDS 1%). Astuce - Le tampon d'élution doit être préparée fraîchement. </li><li> Vortex à mélanger des billes d'agarose dans un tampon d'élution et de la chaleur pendant 30 minutes à 65 ° C. Astuce - Vortex chaque tube au moins toutes les 10 minutes au cours de cette 30 minutes. </li><li> Microfuge pendant 30 secondes à 2000 tpm et le transfert de l'éluant à un tube de centrifugeuse de nouvelles. Astuce - Lors de l'élution, décongeler vos échantillons d'entrée et ajouter 500 uL de tampon d'élution à chacun. Inclure ces échantillons à toutes les étapes à venir. </li><li> Ajouter 5 M de NaCl à une concentration finale de 200 mM à tous les échantillons et les vortex. </li><li> Incuber à 65 ° C pendant une nuit (ou au moins 4 heures). </li></ol> PARTIE 3: ChIP'd purifier et l'ADN ENTRÉE <ol><li> Microfuge tous les échantillons pendant 30 secondes pour recueillir la condensation sur les paupières. </li><li> Ajouter 1 microlitre de RNAse A (10 U / uL) à chaque tube et incuber à température ambiante pendant 15 minutes. </li><li> Ajouter 10 uL d'EDTA 0,5 M, 40 uL 0,5 M de Tris-Cl pH 6,5, 2 pl protéinase K (10 mg / ml) et incuber à 45 ° C pendant 60 minutes. Astuce Préparer un master mix de ces réactifs et ajouter 52 uL dans chaque tube. </li><li> Extrait d'alcool phénol / chloroforme / alcool isoamylique puis chloroforme / alcool isoamylique extraire les échantillons. </li><li> Ajouter 2 glycogène uL (25 ug / uL) et 0,1 volumes de pH 3M acétate de Na 5,2 et vortex. </li><li> Ajouter 2,5 volumes d'éthanol 100% et le vortex. </li><li> Incuber à 20 ° C la nuit. </li></ol> PARTIE 4: ChIP'd purifier et l'ADN apport continu <ol><li> Échantillons Microfuge pour un minimum de 20 minutes à 13000 rpm à 4 ° C pour précipiter l'ADN / glycogène pellets. </li><li> Laver avec de l'ADN / glycogène boulettes avec 1 ml d'éthanol à 70%. </li><li> Air sec les granulés secs ou rapidement dans l'ADN Savant centrifugeuse sous vide vitesse. Astuce - Ne pas trop sécher les ADN. </li><li> Resuspendre l'ADN / glycogène granulés dans 200 ul de tampon TE. </li><li> L'ADN (1 pi) est prêt pour la quantification par PCR en temps réel. L'ADN magasin reste à 20 ° C. Astuce - Utiliser plus de 1 pl d'ADN peuvent inhiber les réactions PCR en temps réel, afin d'échelle avec prudence. </li></ol> Partie 5: résultats représentatifs: Les échantillons d'ADN et de ChIP entrée sont quantifiées avec Real-Time PCR 7,8 (Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System) utilisant des amorces spécifiques pour le locus du gène d'intérêt. Amorces qui séquence génomique cible connue pour être enrichi ou manquant de la modification des histones être testés peuvent être utilisés comme contrôles positifs et négatifs ainsi. Les données sont présentées comme pourcentage de l'entrée. La procédure de puce devrait être entièrement repeated avec trois biologiques réplique à s'assurer que les changements signalés dans les modifications des histones sont statistiquement significatives. Il ya plusieurs questions importantes à considérer lors de l'utilisation PCR en temps réel pour quantifier l'ADN, y compris la conception d'apprêt, efficacité de la PCR, et la manière appropriée pour calculer les pour cent des procédures d'entrée et de normalisation. Lorsque profilage Occupation modification des histones sur un gène, l'efficacité de PCR doit être cohérente entre tous les couples d'amorces. Le fabricant en temps réel du système de PCR peuvent fournir les informations nécessaires et la formation. La figure 1 montre des résultats représentatifs de la chromatine au cours immunoprécipité STAT1 activation du gène IRF1 9, déclenchée par l'IFN-γ. <img src="/files/ftp_upload/2053/2053fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Occupation de STAT1, l'ARN polymérase II et H3K36me3 est dynamique lors de STAT1 activation du gène IRF1. (A, B, C) ​​à copeaux avec α-H3K36me3, α-α-STAT1 et Pol II de la chromatine recueillies à partir des cellules 2FTGH induite par l'IFN-γ pour 30 minutes (carrés rouges), de 1,5 heures (cercles bleus), 5 heures ( triangles verts) ou non induits (losanges noirs). IgG est le contrôle négatif (gris croix). (D) Pan H3 est le contrôle positif et montre l'occupation des histones dans le locus dans l'induit (cercles bleus) et les conditions non induits (losanges noirs). La baisse de -5 pb est dû à l'épuisement des nucléosomes qui se trouve sur les sites de démarrage de la transcription.

<ol><li>Levy, D., Darnell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling%3A+Stats%3A+transcriptional+control+and+biological+impact%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Signalling: Stats: transcriptional control and biological impact.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3, 651-662 (2002).</li>
<li>Bromberg, J., Darnell, J. E. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+STATs+in+transcriptional+control+and+their+impact+on+cellular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The role of STATs in transcriptional control and their impact on cellular function.</a> Oncogene. 19, 2468-2473 (2000).</li>
<li>Hu, X., Ivashkiv, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-regulation+of+signaling+pathways+by+interferon-gamma%3A+implications+for+immune+responses+and+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cross-regulation of signaling pathways by interferon-gamma: implications for immune responses and autoimmune diseases.</a> Immunity. 31, 539-550 (2009).</li>
<li>Campos, E. I., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histones%3A+annotating+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Histones: annotating chromatin.</a> Annu Rev Genet. 43, 559-599 (2009).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+Modifications+and+Their+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin Modifications and Their Function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li>
<li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293, 1074-1080 (2001).</li>
<li>Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A., Rasmussen, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+fluorescence+monitoring+of+rapid+cycle+DNA+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification.</a> Biotechniques. 22 (130-131), 134-138 (1997).</li>
<li>Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P. S., Griffith, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+amplification+and+detection+of+specific+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%28N+Y%29%22%5BJournal%5D)">Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences.</a> Biotechnology (N Y). 10, 413-417 (1992).</li>
<li>Kroger, A., Koster, M., Schroeder, K., Hauser, H., Mueller, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activities+of+IRF-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Interferon+Cytokine+Res%22%5BJournal%5D)">Activities of IRF-1.</a> J Interferon Cytokine Res. 22, 5-14 (2002).</li>
<li>Ross, R. A., Spengler, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neuroblastoma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cancer+biology%22%5BJournal%5D)">Human neuroblastoma stem cells.</a> Seminars in cancer biology. 17, 241-247 (2007).</li>
</ol>

Le protocole décrit ChIP a été utilisé avec succès dans le laboratoire d&#39;essai de plus de vingt différentes modifications des histones. En outre, nous avons caractérisé les changements dans l&#39;occupation des facteurs de transcription, enzymes de modification des histones, protéines qui reconnaissent modifications des histones et la transcription de l&#39;ARN polymérase II machines, à l&#39;IFN-γ de plusieurs gènes induits. Nous avons également utilisé la procédure de caractériser les changements dans les modifica...

<table><tbody><tr><td>Formaldéhyde à 37 %</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme/alcool isoamylique</td><td>Acros Organics</td><td>AC32715-5000</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteurs complets de protéase, format mini</td><td>Roche Group</td><td>1836153</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau cosmique</td><td>Hyclone</td><td>SH30087.04N</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone</td><td>SH30243</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP118-500</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Pharmco Products, Inc.</td><td>zp1110EP</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Roche Group</td><td>100149</td><td></td></tr><tr><td>Glycogène</td><td>Roche Group</td><td>901393</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>IFN-gamma</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>285-IF-100</td><td></td></tr><tr><td>IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-005-003</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>MP Biomedicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4408</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Acétate de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de désoxycholate de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP349-100</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>US Biological</td><td>N3500</td><td></td></tr><tr><td>Anti-histone H3, CT, pan</td><td>EMD Millipore</td><td>07-690</td><td></td></tr><tr><td>Phénol/chloroforme/isoamyl</td><td>Fisher Scientific</td><td>108-95-2</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>EMD Millipore</td><td>50-230-0316</td><td></td></tr><tr><td>Protéinase K</td><td>5 PRIME</td><td>2500140</td><td></td></tr><tr><td>ARNase A</td><td>5 PRIME</td><td>2500130</td><td></td></tr><tr><td>ADN de sperme de saumon/agarose liée à la protéine A</td><td>EMD Millipore</td><td>16-157</td><td></td></tr><tr><td>ADN de sperme de saumon/agarose liée à la protéine G</td><td>EMD Millipore</td><td>16-201</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Cl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Acros Organics</td><td>327372500</td><td></td></tr><tr><td>Anti-K36me3</td><td>Abcam</td><td>ab9050</td><td></td></tr><tr><td>Anti-STAT1</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-345X</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ARN polymérase II</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-899</td><td></td></tr></tbody></table>

immunoprécipitation de la chromatine (chip) pour doser modification des histones dynamique dans l&#39;expression génique dans les cellules humaines activé

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

En réponse à une variété de ligands extracellulaires, la STAT (transducteur de signal et activateur de la transcription) des facteurs de transcription sont rapidement recrutés dans leur état ​​latent dans le cytoplasme aux récepteurs de surface cellulaire où ils sont activés par la phosphorylation d&#39;un seul résidu tyrosine 1. Ils ont ensuite dimériser et translocation vers le noyau de conduire la transcription de gènes cibles, affectant la croissance, la différenciation, l&#39;homéostasie et la réponse immunitaire. Il n&#39;est pas surprenant, étant donné leur implication dans les processus généralisé de cellules normales, dérèglement de la fonction STAT contribue à la maladie humaine, en particulier pour les cancers et les maladies auto-immunes 2 3. Il est bien établi que la transcription est régulée par des modifications au modèle de la chromatine 4,5. Ces modifications comprennent les activités de l&#39;ATP-dépendant de complexes, ainsi que covalentes modifications des histones et la méthylation de l&#39;ADN 6. Parce que l&#39;activation de l&#39;expression génique STAT est à la fois rapide et transitoire, elle nécessite des mécanismes spécifiques permettant de moduler le modèle chromatine au locus du gène STAT-dépendante. Pour définir ces mécanismes, nous caractérisons les modifications des histones et les activités enzymatiques qui les génèrent à des loci génétiques qui répondent à STAT. Ce protocole décrit immunoprécipitation de la chromatine, une méthode qui est précieux pour l&#39;étude de la STAT à la chromatine dans l&#39;expression des gènes activés.

Ce protocole décrit comment la chromatine immunoprécipitation (ChIP) est utilisée pour étudier les altérations dynamiques du modèle de la chromatine qui régulent la transcription induite par une voie de transduction du signal.

Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) pour doser modification des histones dynamique dans l&#39;expression génique dans les cellules humaines Activé

En réponse à divers ligands extracellulaires, les facteurs de transcription STAT (signal transducer and activator of transcription) sont rapidement recrutés...

L'expérience de puces permet de surveiller les changements dynamiques des modifications d'histones qui se produisent lors de l'expression génique activée par STAT1. Les variations d'occupation des facteurs de transcription, des complexes modificateurs d'histones et du mécanisme transcriptionnel lui-même peuvent également être analysées de cette manière. Pour commencer le dosage, les cellules sont induites par l'interféron gamma afin d'activer la signalisation STAT1, puis fixées au moyen de formaldéhyde et collectées. Ensuite, procéder à l'isolement des noyaux et à la sonication, qui fragmente la chromatine en morceaux d'environ 200 à 1000 paires de bases. Ajouter ensuite un anticorps ciblant la protéine ou la modification d'histone d'intérêt, puis précipiter les complexes immuns.Les complexes immuno sont lavés, les liaisons croisées sont inversées et l'ADN est purifié. Les modifications histologiques ou le recrutement de protéines vers des régions spécifiques d'un gène peuvent être déterminés par une analyse en PCR quantitative en temps réel de l'ADN immunoprécipité. Bonjour, je m'appelle Lauren Borow du laboratoire de la Dre Melissa Hendrickson et du Département de biologie de l'Université de Virginie.Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure d'immunoprécipitation de la chromatine. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les modifications histones dynamiques qui se produisent pendant la transcription en aval de la signalisation de STAT1. Commençons donc.Un jour avant de commencer cette procédure, cultiver les cellules afin qu'un nombre suffisant soit disponible pour les deux cellules FTGH utilisées ici. Préparer une boîte de culture tissulaire de 15 centimètres à 80 % de confluence pour chaque essai sur puce. Inclure dans chaque expérience un contrôle négatif IgG, un contrôle positif d'anticorps pan-histone et des doublons.Pour commencer cette procédure, retirez le milieu de culture. Remplacez-le par 20 millilitres de DMEM supplémenté avec 10 % de sérum de veau cosmique et contenant de l'interféron gamma à cinq nanogrammes par millilitre. Remplacez également le milieu des plaques non induites par 20 millilitres de C-C-S-D-M-E-M à 10 %.Ensuite, travailler sous une hotte. Incliner la boîte de culture tissulaire de 15 centimètres et ajouter 540 microlitres d'une solution de formaldéhyde à 37 % à 20 millilitres de milieu. Puis agiter doucement la plaque pour répartir uniformément.Laisser la réaction de réticulation se produire pendant 10 minutes à température ambiante. Ajouter ensuite de la glycine à une concentration finale de 125 millimolaire pour arrêter la réaction de réticulation. Aspirer le milieu sous vide et laver les cellules une fois avec 10 millilitres de PBS glacé en utilisant un grattoir à cellules, recueillir les cellules dans environ sept millilitres de PBS et regrouper les cellules traitées de manière identique provenant de six plaques de 15 centimètres dans un tube conique de 50 millilitres placé sur de la glace.Finalement, centrifuger les cellules recueillies à 1 800 tr/min pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et aspirer le PBS. Si l'on s'arrête ici, congeler rapidement la pastille cellulaire et la conserver à moins 80 degrés Celsius après la réticulation. L'étape suivante consiste à préparer la chromatine.Commencez par ajouter du DTT à une concentration finale de un millimolaire et des inhibiteurs complets de protéases au tampon de gonflement préalablement refroidi sur glace. Resuspendez le culot provenant de six plaques dans quatre millilitres de tampon de gonflement et transférez dans un tube conique de 15 millilitres. L'utilisation d'une quantité de tampon supérieure ou inférieure pourrait modifier l'efficacité du dansage.Incuber la suspension cellulaire sur de la glace pendant 10 minutes. Une fois l'incubation sur glice terminée, transférer la suspension dans un tube conique de 15 millilitres prérefroidi et homogénéiser. Effectuer 20 mouvements avec le piston A. Après homogénéisation, transférer les cellules dans un tube conique de 15 millilitres et centrifuger sur glace à 2 500 tr/min pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius, puis éliminer le surnageant en conservant le culot nucléaire.Ajouter des inhibiteurs complets de protéase au tampon de sonication refroidi sur glace. Six plaques donnent environ 200 microlitres de culot nucléaire Resus. Suspendre le culot dans 15 volumes de culot ou dans trois millilitres de tampon de sonication.L'utilisation d'un volume différent pour cette quantité de cellules pourrait modifier l'efficacité de la sonication. L'efficacité de la sonication doit être déterminée au préalable pour l'appareil utilisé dans votre laboratoire. Ici, un sonicateur Miss Sonic 3000 équipé d'une microlame est utilisé.Soniquez la suspension de noyaux sur de la glace pendant 10 cycles de 20 secondes avec des pauses de 40 secondes entre chaque cycle, à un réglage d'amplitude de huit. Cela donne généralement des fragments de chromatine dont la taille moyenne varie entre 200 et 1000 paires de bases une fois la sonication terminée. Transférez le matériau soniqué dans un tube de centrifugeuse SS 34 et centrifugez à 13 000 tr/min pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius.Dans un rotor SS 34, faire tomber en sédiment les débris cellulaires, qui sont généralement en petite quantité. Transférer soigneusement le surnageant dans un tube conique de 15 millilitres placé sur de la glace. Passer ensuite à l'étape de fragmentation pour réduire le bruit de fond dû aux liaisons non spécifiques.Commencez par pré-clarifier la préparation de chromatine en ajoutant 360 microlitres de suspension de billes d'agarose A ou G liées à l'ADN d'espérume de saumon et en agitant doucement à quatre degrés Celsius pendant au moins 30 minutes. Centrifugez à 1 000 tr/min pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius afin de former un culot de billes d'agarose. Transférez ensuite le surnageant pré-clarifié dans un autre tube conique de 15 millilitres placé sur de la glace.Ensuite, mesurez l'absorbance à 260 nanomètres ou les unités A260 de la chromatine. Diluez 10 microlitres de chromatine préalable dans 190 microlitres d'eau doublement distillée. Pour le témoin, mélangez 10 microlitres de tampon de sonication avec 190 microlitres d'eau doublement distillée.Ajustez le volume de l'échantillon avec du tampon de sonication jusqu'à atteindre quatre unités A 260. Conservez 75 microlitres de la chromatine pré-clarifiée à quatre unités A 260 comme échantillon d'entrée et stockez à moins 20 degrés Celsius jusqu'au moment de procéder à la réversion des liaisons croisées. N'oubliez pas que cette étape est cruciale pour l'analyse des données.Ne négligez donc pas de prélever l'aliquot d'entrée et de distribuer le reste de la préparation de chromatine en aliquots d'un millilitre dans des tubes microfuges de 1,7 millilitre placés sur de la glace. Si vous vous arrêtez ici, congélez rapidement la chromatine préparée dans de la glace sèche et conservez-la à moins 80 degrés Celsius.Cependant, comme la chromatine stockée peut se dégrader, il est préférable de poursuivre avec l'IP. Ajoutez maintenant les anticorps de qualité ChIP aux jeux d'échantillons induits et non induits, en doublet.Typiquement, un à deux microgrammes d'anticorps fonctionnent bien, mais la quantité doit être déterminée empiriquement au préalable. Ajoutez deux microgrammes d'IgG et 15 microlitres d'anticorps pan histone H trois comme témoins négatif et positif aux échantillons induits et non induits. Incubez ensuite tous les tubes toute la nuit à quatre degrés Celsius avant de procéder à l'isolement des complexes immuns après l'incubation nocturne avec les anticorps.Ajouter 60 microlitres de mélange d'ADN de sperme de saumon avec des billes de protéine A ou de protéine G à tous les tubes. Incuber à quatre degrés Celsius pendant au moins 60 minutes afin de lier les complexes immuns aux billes.Centrifuger délicatement les complexes immuns liés aux billes d'agarose à 2000 tr/min pendant trois minutes à quatre degrés Celsius, puis aspirer le surnageant. Ensuite, effectuer une série de lavages avec du tampon, en commençant par un lavage à faible concentration saline, suivi d'un lavage à forte concentration saline, puis d'un lavage au chlorure de lithium.Et enfin, deux lavages TE pour chacun des tampons de lavage. Ajouter du PMSF juste avant utilisation, laver avec un millilitre de tampon pendant 10 minutes sous agitation à quatre degrés Celsius, puis centrifuger pendant trois minutes à 2000 tr/min à quatre degrés Celsius et aspirer le surnageant en maintenant les échantillons au frais sur de la glace. Après élimination du dernier lavage avec le tampon TE, ajouter 500 microlitres de tampon Lucian fraîchement préparé sur les billes, vortexer pour mélanger les billes aros dans le tampon Lucian, puis incuber 30 minutes à 65 degrés Celsius.Vortexez tous les 10 minutes pendant l'élution des échantillons, décongelez les échantillons d'entrée et ajoutez 500 microlitres de tampon d'élution à chacun. Incluez ces échantillons dans toutes les étapes suivantes. Une fois l'incubation terminée à 65 degrés Celsius, effectuez une microfusion toutes les 30 secondes à 2000 tr/min et transférez l'EENT dans un nouveau tube microfuge.Enfin, inverser la réticulation. Ajouter du chlorure de sodium à cinq molaire pour obtenir une concentration finale de 200 millimolaire dans tous les échantillons et vortexer à 65 degrés Celsius pendant au moins quatre heures, voire toute la nuit. Une fois que les réticulations des complexes immuns sont inversées, l'ADN lié peut être récupéré lorsque l'incubation à 65 degrés Celsius est terminée.Fuger les échantillons en microfuge pendant 30 secondes. Pour récupérer la condensation sur les couvercles, ajouter un microlitre de RNAses A dans chaque tube et incuber à température ambiante pendant 15 minutes après le traitement par RNAses, en ajoutant à chaque tube 10 microlitres de EDTA 0,5 M, 40 microlitres de tris chlorure 0,5 M à pH 6,5 et deux microlitres de protéinase K, soit un volume total de 52 microlitres provenant d'un mélange maître, puis incuber à 45 degrés Celsius pendant 60 minutes. Extraire les échantillons avec du phénol-chloroforme, de l'alcool isoamylique, puis avec du chloroforme et de l'alcool isoamylique.Ensuite, pour précipiter l'ADN, ajoutez deux microlitres de glycogène et 0,1 volume d'acétate de sodium trois molaire, pH 5,2, à chaque échantillon, puis vortexez. Ajoutez 2,5 volumes d'éthanol à 100 %, vortexez à nouveau et incubez à moins 20 degrés Celsius pendant la nuit. Récupérez les échantillons et centrifugez-les à 13 000 tr/min pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius.Lavez les culots de glycogène d'ADN avec un millilitre d'éthanol à 70 % et de l'air. S&eacutechez les culots ou utilisez une centrifugeuse &agrave; vide acc&eacute;l&eacute;r&eacute;. Ne pas trop dess&eacute;cher l'ADN. R&eacute;suspendez les culots dans 200 microlitres de tampon TE et quantifiez au maximum un microlitre par temps r&eacute;el.Les PCR présentées ici sont les résultats d'une expérience sur puce suivant la dynamique de H3K36me3. Lors de l'induction par l'interféron gamma du gène IRF1, un anticorps anti-H3K36me3 a été utilisé pour immunoprécipiter la chromatine collectée à partir de cellules FTGH traitées avec de l'interféron gamma pendant 30 minutes, 1,5 heure et 5 heures, avec une IgG comme témoin négatif. L'occupation de STAT1 a également été déterminée à ces différents temps, de même que l'occupation de l'ARN polymérase II.L'occupation des histones au niveau du locus du gène IRF1 a été déterminée dans des conditions non induites et induites à l'aide de l'anticorps pan-histone H3, qui sert également de contrôle positif. Le creux situé autour de moins cinq paires de bases est dû à l'appauvrissement en nucléosomes observé au niveau des sites d'initiation de la transcription. Nous venons de vous présenter la procédure de l'immunoprécipitation de la chromatine.Cet essai est utile pour observer les modifications de la chromatine qui se produisent lors de la transcription génique activée. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de déterminer au préalable le protocole de fragmentation adapté à votre chromatine avec votre inhibiteur avant de commencer une expérience de puces à ADN. N'oubliez pas non plus de prélever vos échantillons témoins.Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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