Name: Comment la culture, denregistrement et stimuler les réseaux neuronaux sur les micro-électrodes Arrays (AME) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Apprenez à cultiver, enregistrer et stimuler des réseaux neuronaux sur des matrices de microélectrodes (MEA) avec des neurones corticaux de rat. Cette méthode permet d'étudier l'activité réseau, l'apprentissage et la mémoire in vitro sur le long terme.

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Nous tenons à remercier les membres du groupe de Potter pour fournir des commentaires précieux sur le protocole. Ce travail a été financé par une bourse de formation en recherche clinique de l&#39;American Academy of Neurology Foundation pour la CMH, une bourse de l&#39;Institut national des sciences médicales générales (NIGMS; <a href="http://www.nigms.nih.gov/">http://www.nigms.nih.gov/</a> ) à JDR (GM08169 ), une subvention de l&#39;Institut national du NIH des troubles neurologiques et des maladies (NS054809), une Ruth L. Kirschstein National Service Award de la recherche à JDR (NS060392), une provision EFRI subvention (0.836.017), le Prix de la Fondation de recherche translationnelle Coulter, et un bourse de recherche translationnelle au JDR (NS007480).

<ol><li>Potter, S. M., DeMarse, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+neural+cell+culture+for+long-term+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A new approach to neural cell culture for long-term studies.</a> J Neurosci Methods. 110, 1-2 (2001).</li>
<li>Rambani, K., Vukasinovic, J., Glezer, A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+thick+brain+slices%3A+an+interstitial+3D+microperfusion+system+for+enhanced+viability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Culturing thick brain slices: an interstitial 3D microperfusion system for enhanced viability.</a> J Neurosci Methods. 180, 243-254 (2009).</li>
<li>Bakkum, D. J., Chao, Z. C., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporal+electrical+stimuli+shape+behavior+of+an+embodied+cortical+network+in+a+goal-directed+learning+task%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporal electrical stimuli shape behavior of an embodied cortical network in a goal-directed learning task.</a> J Neural Eng. 5, 310-323 (2008).</li>
<li>Shahaf, G., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+in+networks+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Learning in networks of cortical neurons.</a> J Neurosci. 21, 8782-8788 (2001).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Nadasdy, Z., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+dynamic+attractors+in+activity+patterns+of+cultured+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+E+Stat+Nonlin+Soft+Matter+Phys%22%5BJournal%5D)">Persistent dynamic attractors in activity patterns of cultured neuronal networks.</a> Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 73, 051907-05 (2006).</li>
<li>Esposti, F., Signorini, M. G., Potter, S. M., Cerutti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+long-term+correlations+in+dissociated+cortical+neuron+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Neural+Syst+Rehabil+Eng%22%5BJournal%5D)">Statistical long-term correlations in dissociated cortical neuron recordings.</a> IEEE Trans Neural Syst Rehabil Eng. 17, 364-369 (2009).</li>
<li>Madhavan, R., Chao, Z. C., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+recurring+spatiotemporal+activity+patterns+in+cortical+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasticity of recurring spatiotemporal activity patterns in cortical networks.</a> Phys Biol. 4, 181-193 (2007).</li>
<li>Chiappalone, M., Massobrio, P., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+plasticity+in+cortical+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Network plasticity in cortical assemblies.</a> Eur J Neurosci. 28, 221-237 (2008).</li>
<li>Hofmann, F., Bading, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term+recordings+with+microelectrode+arrays%3A+studies+of+transcription-dependent+neuronal+plasticity+and+axonal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+Paris%22%5BJournal%5D)">Long term recordings with microelectrode arrays: studies of transcription-dependent neuronal plasticity and axonal regeneration.</a> J Physiol Paris. 99, 2-3 (2006).</li>
<li>Gortz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+reduction+of+spontaneous+neuronal+network+activity+by+sublethal+amyloid+beta+%281-42%29+peptide+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Transm%22%5BJournal%5D)">Transient reduction of spontaneous neuronal network activity by sublethal amyloid beta (1-42) peptide concentrations.</a> J Neural Transm. 116, 351-355 (2009).</li>
<li>Koito, H., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+rat+brain+aggregate+cultures+for+neuron+and+glia+development+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of rat brain aggregate cultures for neuron and glia development studies.</a> J Vis Exp. 31, (2009).</li>
<li>Brewer, G. J., Cotman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+growth+of+hippocampal+neurons+in+defined+medium+at+low+density%3A+advantages+of+a+sandwich+culture+technique+or+low+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Survival and growth of hippocampal neurons in defined medium at low density: advantages of a sandwich culture technique or low oxygen.</a> Brain Res. 494, 65-74 (1989).</li>
<li>Lelong, I. H., Petegnief, V., Rebel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+cells+mature+faster+on+polyethyleneimine+coated+plates+than+on+polylysine+coated+plates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Neuronal cells mature faster on polyethyleneimine coated plates than on polylysine coated plates.</a> J Neurosci Res. 32, 562-568 (1992).</li>
<li>Potter, S. M., Pine, J., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+transplant+staining+with+DiI+and+vital+imaging+by+2-photon+laser-scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning+Microsc+Suppl%22%5BJournal%5D)">Neural transplant staining with DiI and vital imaging by 2-photon laser-scanning microscopy.</a> Scanning Microsc Suppl. 10, 189-199 (1996).</li>
<li>Rolston, J. D., Gross, R. E., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+low-cost+multielectrode+system+for+data+acquisition+enabling+real-time+closed-loop+processing+with+rapid+recovery+from+stimulation+artifacts%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroengineering%22%5BJournal%5D)">A low-cost multielectrode system for data acquisition enabling real-time closed-loop processing with rapid recovery from stimulation artifacts.</a> Front Neuroengineering. 2, (2009).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+all-channel+stimulator+for+electrode+arrays%2C+with+real-time+control%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">A versatile all-channel stimulator for electrode arrays, with real-time control.</a> J Neural Eng. 1, 39-45 (2004).</li>
<li>van Pelt, J., Wolters, P. S., Corner, M. A., Rutten, W. L., Ramakers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+characterization+of+firing+dynamics+of+spontaneous+bursts+in+cultured+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Long-term characterization of firing dynamics of spontaneous bursts in cultured neural networks.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 51, 2051-2062 (2004).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Pine, J., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extremely+rich+repertoire+of+bursting+patterns+during+the+development+of+cortical+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An extremely rich repertoire of bursting patterns during the development of cortical cultures.</a> BMC Neurosci. 7, (2006).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+multi-channel+stimulus+artifact+suppression+by+local+curve+fitting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time multi-channel stimulus artifact suppression by local curve fitting.</a> J Neurosci Methods. 120, 113-120 (2002).</li>
<li>Bakkum, D. J., Chao, Z. C., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+activity-dependent+plasticity+of+action+potential+propagation+delay+and+amplitude+in+cortical+networks%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Long-term activity-dependent plasticity of action potential propagation delay and amplitude in cortical networks.</a> PLoS One. 3 (5), e2088-e2088 (2008).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+bursting+in+cortical+cultures+with+closed-loop+multi-electrode+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Controlling bursting in cortical cultures with closed-loop multi-electrode stimulation.</a> J Neurosci. 25 (3), 680-688 (2005).</li>
<li>Jimbo, Y., Tateno, T., Robinson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+induction+of+pathway-specific+potentiation+and+depression+in+networks+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Simultaneous induction of pathway-specific potentiation and depression in networks of cortical neurons.</a> Biophys J. 76 (2), 670-678 (1999).</li>
<li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBanker%2C+G+%22Culturing+nerve+cells%22">Culturing nerve cells</a>. , 2nd ed, MIT Press. Cambridge, Mass. (1998).</li>
</ol>

CMH a rien à révéler.<br /&gt; JDR et SMP sont des consultants payés par Axion Biosystems.<br /&gt; Les frais de soumission et les frais de traitement vidéo pour cet article et la vidéo ont été gracieusement parrainée par systèmes multi-canaux.

Ce protocole indique des instructions sur la façon de la culture et maintenir des réseaux neuronaux sur des micro-électrodes sont aussi des tableaux comme une introduction à l&#39;enregistrement et la stimulation des réseaux neuronaux. Quelques-uns des problèmes les plus courants lors de l&#39;enregistrement d&#39;AME ont également été discutés dans la section MEA dépannage. Il ya des variations occasionnelles dans le protocole tel que discuté tout au long et souvent ces changements sont utilisées pour optimiser les conditions spécifiques prévues par certains modèles expérimentaux. Bien que le système d&#39;enregistrement et stimulantes présentées ici se compose de notre personnalisées conçues NeuroRighter 15 avec le préampli MCS, il existe plusieurs autres systèmes qui peuvent fournir une interface avec les réseaux neuronaux. Choisir une configuration particulière dépendra des besoins spécifiques d&#39;expérimentation. L&#39;enregistrement et des exemples simplistes de stimulation ont été fournis dans le présent protocole Cependant ces cultures sur les AME peuvent être utilisés pour fournir un aperçu des questions complexes sur l&#39;activité synaptique et la connectivité réseau neuronal. Comme mentionné ci-dessus, le travail en cours est l&#39;utilisation de cette technologie pour étudier les processus comme la plasticité cellulaire, le développement, l&#39;excitotoxicité et la neurodégénérescence. 6-10 Par exemple, une publication récente de notre laboratoire ont montré l&#39;objectif reproductibles apprentissage dirigé in vitro, en temps réel la stimulation en boucle fermée en réponse à l&#39;activité actuelle du réseau neuronal 3. Bien que les cultures sont souvent capricieux MEA et délicat, grâce à leur simplicité et leur accessibilité (par rapport aux animaux intacts), ils fournissent un puissant modèle pour étudier l&#39;activité neuronale au niveau du réseau.

Fournitures <ul><li> Bouchon de bouteille jetable filtre (150ml, la taille des pores 0,2 um; Nalgene # 565-0020) </li><li> Embryonic jour 18 chronométrés enceintes rat femelle </li><li> Matrices de microélectrodes (voir description dans le protocole, B1) </li><li> Couvercles matrice de microélectrodes (voir description dans le protocole, B3) </li><li> Cellulaire Nylon crépine (40μm, BD Falcon, # 352340) </li><li> Polypropylène fioles coniques (stérile, 15ml) </li><li> Polystyrène boîtes de Pétri (stérile, 35mm et 100x15mm) </li><li> Embouts de pipettes (stérile, 20 pi, 200 pl et 1000μl) </li><li> Pipettes sérologiques (5ml) </li></ul> Equipement: <ul><li> Hotte à flux biologiques de sécurité armoire / laminaire </li><li> Compteur de cellules </li><li> Centrifugeuse </li><li> Conteneur de glace </li><li> Des ciseaux et des pinces à disséquer (stérilisés) </li><li> Dissection microscope dans une hotte à flux laminaire </li><li> Handheld électriques Pipetman </li><li> Hémacytomètre </li><li> Isofluorane et la chambre à gaz </li><li> Microscope à lumière </li><li> Handheld Pipetman (P-20 (20 pi), P-200 (200 pl), P-1000 (1000μl)) </li><li> Système d&#39;enregistrement AME (voir description dans le protocole, D1) </li><li> Guillotine rongeurs </li><li> Tri-Gas incubateur (voir description dans le protocole, B15) </li><li> Fiole à vide avec aspirateur attaché dans la hotte </li><li> Vortex </li><li> Bain-marie (35-37 ° C) </li></ul> Solutions et réactifs: Solution de BSA: Faites 5% de BSA (Sigma A-9418) dans un tampon phosphate salin pH de 7,4 et filtrée à 0,2 um. Cette solution peut être préparée à l&#39;avance et stocké à 4 ° C pendant plusieurs mois. Milieu cellulaire: Combinez 90 ml de milieu de Dulbecco modifié Eagle (Irvine Scientific 9024), 10 ml de sérum de cheval (Gibco 16050), le pyruvate de sodium 1 ml (100mm, Gibco 11360), 250 pi glutamax (Gibco 35050) et l&#39;insuline (concentration finale 2,5 pg / ml, Sigma I-5500), puis passer à travers une épaisseur de 0,2 um filter.22 chaud et équilibrer le milieu cellulaire dans l&#39;incubateur avant de l&#39;utiliser. Solution de dissection pour préparer la solution de papaïne: 23 <table border="1"><tr><td> Solution de dissection (100ml stock) </td><td> Mélanger dans l&#39;ordre, filtre de 0,22 um et stocker à 4 ° C. </td><td></td></tr><tr><td> Composante </td><td> Volume ml </td><td> Concentration finale (mM) </td></tr><tr><td> Eau bidistillée </td><td> 91.175 </td><td></td></tr><tr><td> 1 M MgCl 2 </td><td> 0,58 </td><td> 5,8 mm </td></tr><tr><td> 1 M de CaCl 2 </td><td> 0,025 </td><td> 0,25 mM </td></tr><tr><td> 0,5 M HEPES </td><td> 0,32 </td><td> 1,6 mM </td></tr><tr><td> 0,5% de rouge de phénol </td><td> 0.2 </td><td> (0,001%) </td></tr><tr><td> NaOH 0,1 N </td><td> 0.2 </td><td> 0,2 mM </td></tr><tr><td> 2 M Na2SO4 </td><td> 4.5 </td><td> 90 mM </td></tr><tr><td> 1 M K2SO4 </td><td> 3.0 </td><td> 30 mM </td></tr><tr><td> 0,1 M d&#39;acide Kynurenic </td><td> 1.0 </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> 5 mM APV </td><td> 1.0 </td><td> 0,05 mM </td></tr></table> Cette solution peut être préparée à l&#39;avance et stocké à 4 ° C pendant plusieurs mois. DNAse I: Invitrogen (# 18047019). Aliquotes 50 pl sont surgelés et conservés à -80 ° C. Un aliquot est décongelé dans la hotte à flux laminaire avant de commencer le processus de dissociation cellulaire. Hank solution salée équilibrée: Sigma (# 4891). Une solution 1X est préparé dans de l&#39;eau déminéralisée, stérile filtré à 0,2 um et stocké à 4 ° C. Solution de Hibernate: Préparer le jour de culture. Combinez 98 ml milieu L-15 (Invitrogen 11415) avec 2 ml B-27 supplément (50X, Invitrogen # 17504) et le filtre à 0,2 um. Solution de laminine: Préparer le jour de culture. Diluer 20 pi de la laminine (1mg/ml, Sigma L-2020) dans le milieu cellulaire 980 ul pour une concentration finale de 0.02mg/ml. Aliquotes de 20 pl de la laminine (1mg/ml) sont stockés à -80 ° C et décongelées juste avant utilisation. La décongélation doit se faire sur la paillasse et non pas dans le bain d&#39;eau aussi rapide dégel peut parfois conduire à une gélification de la laminine. Solution de papaïne: 23 Chaude 10 ml de solution de dissection (ci-dessus) à 30-32 ° C. Ajouter 200 unités papaïne (Sigma P-4762) et 1,6 mg de L-cystéine (Sigma C-7880). Ajuster le pH à 7,4 avec environ 14 ul de 0,1 N NaOH. Incuber pendant 30 minutes environ jusqu&#39;à ce que la solution cloreilles, filtre de 0,2 um, gel flash avec l&#39;azote liquide dans aliquots de 2 ml dans 15 ml polypropylène stériles fioles coniques et stocker à -80 ° C. Dégeler une aliquote à 35-37 ° C avant de commencer le protocole. Polyéthylèneimine (PEI) solution: 13 100 ul de PEI (50% p / v, Sigma P-3143) est dilué dans 100 ml de tampon borate de sodium (0,1 M pH 8,4, Sigma B-9876) pour une concentration finale de 0,05% p / v. Filtre stérile à 0,2 um. Ceci peut être préparé à l&#39;avance et stocké à 4 ° C pendant des mois. Stérile de l&#39;eau déminéralisée: Autoclave et laisser refroidir à température ambiante avant utilisation. La trypsine (0,25% avec de l&#39;EDTA, Gibco 25200): Aliquotes de 1ml sont surgelés et conservés à -80 ° C. Aliquotes sont décongelés dans le bain 35-37 ° C l&#39;eau avant utilisation.

comment la culture, d&#39;enregistrement et stimuler les réseaux neuronaux sur les micro-électrodes arrays (ame)

How to Culture, Record and Stimulate Neuronal Networks on Micro-electrode Arrays (MEAs)

Pour le siècle dernier, les neuroscientifiques nombreuses régions du monde ont consacré leur vie à comprendre comment les réseaux de neurones fonctionnent et pourquoi ils arrêtent de travailler dans diverses maladies. Des études ont inclus l&#39;observation neuropathologique, la microscopie fluorescente avec marquage génétique, et l&#39;enregistrement intracellulaire dans les deux neurones dissociés et préparations tranche. Ce protocole traite d&#39;une autre technologie, qui consiste à cultiver des cultures dissociées de neurones sur la micro-électrode tableaux (également appelé réseau d&#39;électrodes multiples, AME). Il ya de multiples avantages à utiliser ce système sur d&#39;autres technologies. Dissocié cultures neuronales sur les AME fournissent un modèle simplifié dans lequel l&#39;activité du réseau peut être manipulé avec des séquences de stimulation électrique par électrodes multiples du tableau. Parce que le réseau est faible, l&#39;impact de la stimulation est limitée aux zones observables, ce qui n&#39;est pas le cas dans les préparations intactes. Les cellules se développent dans une monocouche faire des changements dans la morphologie facile à suivre avec les diverses techniques d&#39;imagerie. Enfin, les cultures sur les AME peuvent survivre pendant plus d&#39;un an in vitro, ce qui supprime toute limite temporelle claire inhérents aux techniques de culture d&#39;autres 1. Notre laboratoire et d&#39;autres autour du globe utilisent cette technologie pour poser des questions importantes au sujet des réseaux neuronaux. Le but de ce protocole est de fournir les informations nécessaires à la mise en place, le soin, l&#39;enregistrement à partir et à stimuler électriquement les cultures sur les AME. Dans les réseaux in vitro fournissent un moyen pour poser des questions pertinentes physiologiquement au niveau du réseau et des niveaux cellulaires conduisant à une meilleure compréhension des la fonction cérébrale et un dysfonctionnement.

Ce protocole fournit les informations nécessaires à la mise en place, le soin, l&#39;enregistrement à partir et à stimuler électriquement les cultures sur les AME.<em&gt; In vitro</em&gt; Les réseaux constituent un moyen de poser des questions pertinentes physiologiquement au niveau du réseau et des niveaux cellulaires conduisant à une meilleure compréhension du fonctionnement du cerveau et de dysfonctionnement.

Comment la culture, d&#39;enregistrement et stimuler les réseaux neuronaux sur les micro-électrodes Arrays (AME)

For the last century, many neuroscientists around the world have dedicated their lives to understanding how neuronal networks work and why they stop ...

L’objectif général de cette procédure est de cultiver, d’enregistrer et de stimuler des réseaux neuronaux sur des réseaux de microélectrodes. Pour ce faire, il faut d’abord préparer des réactifs et des réseaux de microélectrodes pour la culture. La deuxième étape de la procédure consiste à dissocier les neurones corticaux d’un embryon de rat du 18e jour.La troisième étape de la procédure consiste à placer les neurones sur des réseaux de microélectrodes et à les cultiver pendant deux à trois semaines. La dernière étape de la procédure consiste à expérimenter avec les réseaux neuronaux en stimulant et en enregistrant à partir des réseaux de microélectrodes. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent une activité spontanée et évoquée par stimulus dans les réseaux neuronaux avec un logiciel d’enregistrement et de stimulation grâce à une culture cellulaire méticuleuse sur des réseaux de microélectrodes.Bonjour, je suis le professeur Steve Potter. Je suis directeur du Laboratoire de neuro-ingénierie du Département de culture de génie biomédical de Georgia Tech. Ce département est partagé avec la faculté de médecine de l’Université Emory.Et je suis Chad Hales, post-doctorant dans le laboratoire du Dr Potter. Je suis également chercheur en cognitivo-comportement au département de neurologie de la faculté de médecine de l’Université Emory. Aujourd’hui, nous allons vous montrer comment cultiver et prendre soin des neurones sur des réseaux à plusieurs électrodes.Comme ceux-ci. Nous les utilisons pour étudier l’apprentissage et la mémoire in vitro et le traitement de l’information en réseau. Alors commençons : Dans une hotte à flux laminaire, commencez à préparer le réseau de micro-électrodes des systèmes multicanaux ou la pipette MEA de 100 microlitres de polyéthylène amine au centre d’un MEA propre et stérile reposant dans une boîte de Pétri de 100 millimètres pour éviter d’endommager les électrodes.Ne touchez jamais d’objets solides à la surface MEA. Couvrez légèrement le plat avec un couvercle stérile équipé d’une membrane en téflon perméable au gaz et incubez dans la hotte pendant 30 minutes. Le couvercle à membrane en téflon permet un échange gazeux avec une évaporation minimale et la possibilité de cultiver dans des environnements à faible humidité.La faible humidité permet l’utilisation d’appareils électroniques délicats dans l’incubateur et réduit les taux de contamination. Aspirez le PEI, rincez le MEA trois fois avec un à deux millilitres d’eau déminéralisée stérile. Laissez-les sécher avec le couvercle retiré dans la hotte pendant au moins 30 minutes ou jusqu’à ce qu’ils soient complètement secs.Effectuez une dissociation des neurones corticaux E 18 comme décrit dans la partie texte de ce protocole. Filtrez les cellules après avoir filtré. Transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres et amenez soigneusement le volume de suspension cellulaire à quatre millilitres avec un milieu cellulaire.Appliquez 500 microlitres d’une solution à 5 % de BSA sous la centrifugeuse à suspension de cellules à 200 G pendant six minutes. Pendant que les cellules tournent, vérifiez que le MEA est complètement sec. Pipeter soigneusement 20 microlitres de solution stratifiée au centre du MEA.Évitez d’introduire des bulles d’air et assurez-vous que toutes les électrodes sont couvertes. Placez délicatement le couvercle en téflon sur le MEA pour éviter l’évaporation de la laminine. Le MEA doit être sur une surface complètement plane lorsque le couvercle est placé.Sinon, la pression pourrait fissurer le fond en verre du réseau. Incuber le plat à 35 à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone, 9 % d’oxygène et 65 % d’humidité pendant 20 minutes. Transférez maintenant les cellules filées dans le capot.Une pastille de cellule doit être visible au fond du tube. Retirez et réservez le surnageant en cas de granulation incomplète. Remettez doucement le granulé en suspension.Comptez le nombre de cellules dans 10 microlitres de la suspension sur un hémocytomètre et diluez la suspension à la concentration souhaitée. Généralement 1000 à 3000 cellules par microlitre avec un milieu cellulaire. Lorsque l’incubation stratifiée du réseau est terminée, aspirez immédiatement la gouttelette.Pipeter 15 à 20 microlitres de la suspension de la cellule sur la zone revêtue de stratifié du MEA. Couvrez le plat avec le couvercle en téflon et placez-le dans l’incubateur pendant 30 minutes. À l’aide d’un microscope à contraste de phase, inspectez la parabole pour vous assurer que les cellules ont adhéré et recouvrent toutes les électrodes.Si la couverture est incomplète, ajoutez plus de cellules et réincubez. Inondez lentement le plat d’un millilitre de milieu cellulaire d’équilibrage réchauffé. Remettez le couvercle en téflon et remettez le plat dans l’incubateur pendant 24 heures.Le lendemain. Sous le microscope à contraste de phase, vérifiez que les cellules cultivées adhèrent et que la quantité de débris et la mort cellulaire sont limitées avec les soins et l’alimentation appropriés. Comme expliqué dans le texte d’accompagnement, les neurones cultivés de cette manière peuvent survivre plus d’un an.Après deux à trois semaines, les cultures ont atteint un état d’activité stable et peuvent être enregistrées à partir de cette vidéo sera maintenant une démonstration d’enregistrement avec le programme d’écriture neurologique personnalisé. Transférez à nouveau la parabole dans l’incubateur d’enregistrement, maintenue à une température de 35 à 37 degrés Celsius, à 5 % de dioxyde de carbone, à 9 % d’oxygène et à 65 % d’humidité. Pour maintenir une température et un pH idéaux, lorsque vous déplacez la parabole, portez-la parallèlement au sol et évitez les mouvements rapides qui pourraient déloger les cellules du substrat.Soulevez le MEA de la parabole et placez-le dans les systèmes multicanaux. Enregistrement de l’amplificateur Preem, en s’assurant de bien faire correspondre la masse interne avec la masse de l’amplificateur Preem. Le préamplificateur est assis sur un dispositif à fourrure, qui fonctionne pour dissiper la chaleur comme décrit dans le texte d’accompagnement ici, le préamplificateur a été déplacé hors de l’incubateur.Mieux vaut montrer la bonne position du plat. Utilisez une lingette imbibée d’éthanol à 70 % pour nettoyer les contacts autour du périmètre du réseau. Assurez-vous que le MEA est correctement installé, abaissez et verrouillez le couvercle.Utilisez un coton-tige pour aligner les contacts de la matrice si nécessaire. Dans neuro writer, choisissez les paramètres appropriés pour l’expérience. Le commutateur d’enregistrement doit être relevé.Pour écrire les données dans un fichier, cliquez sur le bouton Démarrer pour commencer l’enregistrement. L’écran de pointe affichera désormais des traces d’activité et de bruit de fond avec des potentiels d’action occasionnels et des rafales d’activité. Si une électrode affiche trop de bruit, il se peut qu’il y ait une broche mal alignée sur le couvercle du préamplificateur, un petit déchet, une goutte de fluide, une surface d’électrode dégradée ou une membrane transparente chevauchant le couvercle perturbant le contact.Vérifiez la goupille de contact et ajustez avec un coton-tige imbibé d’éthanol à 70 % si nécessaire. Cliquez sur l’onglet Forme d’onde de pointe pour passer de l’affichage à l’écran en mode de détection de pointe, où les potentiels d’action sont affichés dans des fenêtres statiques de trois millisecondes. Pour stimuler le réseau neuronal sur le MEA, entraînez l’algorithme salpa sous l’onglet des paramètres d’enregistrement, pour limiter l’artefact de stimulation, activez salpa dans l’onglet des paramètres en ligne.Une fois l’enregistrement lancé, cliquez sur l’onglet STEM pour configurer un paradigme de stimulation approprié afin d’utiliser le programme en boucle ouverte pour stimuler une électrode et observer les réponses dans la parabole. Choisissez les paramètres appropriés dans la section en boucle ouverte, puis appuyez sur Démarrer. Visualisez les réponses dans l’onglet principal des pics et l’onglet des formes d’onde des pics.Ce film dépeint le développement in vitro des neurones et des cellules gliales au septième jour alors qu’ils se développent et forment un réseau connecté sur un MEA pour que les micro-électrodes soient visibles. Il s’agit d’un tracé matriciel de deux minutes d’activité spontanée à partir d’un réseau neuronal. Chaque point noir représente un potentiel d’action.Deux pics d’activité sont indiqués par les flèches bleues. La réponse sur plusieurs électrodes est fonction de la connectivité réseau. Voici un graphique matriciel de 16 secondes d’activité évoquée par stimulus.Les étoiles rouges représentent des stimuli. Les flèches rouges montrent cinq stimuli qui ont réussi à induire des poussées d’activité synaptique à travers plusieurs électrodes. Parfois, un stimulus ne produit pas d’explosion.Ici, à la flèche bleue, nous venons de vous montrer comment cultiver, enregistrer et stimuler des réseaux neuronaux sur des réseaux de micro-électrodes. La chose la plus importante est probablement d’empêcher les cultures d’être infectées et de réduire l’évaporation. Si vous utilisez des couvercles avec des membranes semi-perméables comme celle-ci, ils sont scellés et ils empêchent l’évaporation et l’infection, et vous pourrez peut-être cultiver les cultures pendant des mois, peut-être même plus d’un an.Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.

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JoVE Journal

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Biologie

Une manière robuste à l'étude des avalanches neuronale, c'est à dire invariante d'échelle éclate l'activité spatio-temporelle, indicative de la dynamique de l'état critique dans le cortex. Avalanches émergent spontanément dans le développement de couches superficielles du cortex culture qui permet de mesures à long terme de l'activité avec des tableaux intégrés planaires multi-électrodes (MEA) dans des conditions contrôlées avec précision.

Enregistrements tableau multi-électrodes des Avalanches neuronale dans des cultures organotypiques

Cette vidéo démontre le développement d’une culture neuronale 3D couplée à un réseau de microélectrodes planes avec des neurones de l’hippocampe. Les neurones isolés forment un réseau 2D sur la zone active du réseau de microélectrodes et adhèrent aux microbilles de verre dans une plaque multipuits avec un insert de membrane. Lors du transfert de ces microbilles enrobées de neurones dans l’électrode, elles s’organisent en un réseau neuronal 3D interconnecté.

Construire des réseaux neuronaux tridimensionnels couplés à des réseaux de micro-électrodes

La vidéo montre comment utiliser un réseau de microélectrodes (MEA) pour enregistrer l’activité électrophysiologique des neurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC). L’activité électrophysiologique d’un MEA multipuits contenant une co-culture neurone-astrocytes est enregistrée pour détecter les potentiels d’action de plusieurs neurones du réseau, confirmant ainsi la différenciation réussie des hiPSC en neurones.

Mesure de l’activité électrophysiologique des réseaux neuronaux à l’aide de réseaux de micro-électrodes

Cette vidéo montre l’enregistrement de l’activité neuronale spontanée et dépendante de la stimulation à partir de cultures primaires de neurones murins du ganglion spiralé (SGN) sur un réseau multiélectrodes (MEA). Il s’agit de laver et de préparer le MEA, d’enregistrer l’activité neuronale spontanée et d’appliquer des stimuli électriques contrôlés pour identifier l’activité neuronale dépendante de la stimulation.

Analyse de l’activité neuronale dans les neurones ganglionnaires spiralés murins primaires à l’aide de réseaux de multiélectrodes

Cette vidéo présente des enregistrements électrophysiologiques issus de co-cultures organotypiques de coupes de moelle épinière, capturés à l’aide d’un réseau d’électrodes multiples ou d’un dispositif MEA. Ces enregistrements évaluent la régénération neuronale entre les tranches. L’activité électrique synchronisée observée confirme la réussite de la régénération neuronale.

Enregistrements électrophysiologiques pour l’évaluation des régénérations neuronales dans des coupes de moelle épinière co-cultivées

Cette vidéo montre la procédure d’utilisation du réseau de multiélectrodes (MEA) pour mesurer la physiologie synaptique dans des sphères de coculture 3D. Cette méthode permet de comprendre la dynamique des réseaux neuronaux et l’activité des rafales de réseaux synaptiques dans les sphères 3D.

Utilisation de réseaux de multiélectrodes pour mesurer la physiologie synaptique dans des sphères de coculture 3D

Cette vidéo démontre l’établissement d’une co-culture neurone-astrocytes pour enregistrer l’activité du réseau neuronal. Lors de l’établissement de la co-culture de motoneurones et d’astrocytes sur une plaque de réseau multi-électrodes (MEA), l’activité électrique rythmique synchrone du réseau neuronal a été enregistrée extracellulaire à l’aide de la MEA.

Enregistrement de l’activité électrophysiologique du réseau neuronal dans une co-culture neurone-astrocytes

Dans ce travail, un nouveau modèle expérimental dans lequel des cultures neuronales 3D sont couplées à des réseaux de micro-électrodes planes (MEA) est presented. 3D les réseaux sont construits en enracinant des neurones dans un échafaudage composé de microbilles de verre sur lesquelles les neurones se développent et forment des structures 3D interconnectées.

Cultures interface 3D Engineered neuronales à des micro-électrodes tableaux: Une innovante<em&gt; In Vitro</em&gt; Modèle expérimental

Nous présentons un protocole pour cultiver des explants primaires de neurones murins du ganglion spiralé sur des réseaux multi-électrodes afin d’étudier les profils de réponse neuronale et d’optimiser les paramètres de stimulation. Ces études visent à améliorer l’interface neurone-électrode des implants cochléaires au profit de l’audition des patients ainsi que de la consommation d’énergie du dispositif.

Spiral Ganglion Neuron Explantation Culture et électrophysiologie sur multi-électrodes Arrays

Les cellules neuronales de la souris cultivées sur des matrices multi-électrodes affichent une augmentation de la réponse suite à une stimulation électrique. Ce protocole démontre comment culture des neurones, comment enregistrer l'activité et comment établir un protocole pour former les réseaux pour répondre aux modèles de stimulation.

Augmentation de la réponse du réseau à la stimulation des cultures cellulaires neuronales sur les tableaux de microélectrodes

Ce protocole vise à démontrer comment combiner in vitro les baies de la microélectrode avec dispositifs microfluidiques pour étudier la transmission du potentiel d’action dans les cultures de neurones. Analyse des données, à savoir la détection et la caractérisation des potentiels d’action, de la multiplication est effectuée en utilisant une nouvelle avancée, pourtant facile à utiliser et disponible gratuitement, outil de calcul.

Interfaçage Microfluidics microélectrode tableaux pour étudier la Communication neuronale et la Propagation des signaux axonale

Apprenez à cultiver, enregistrer et stimuler des réseaux neuronaux sur des matrices de microélectrodes (MEA) avec des neurones corticaux de rat. Cette méthode permet d'étudier l'activité réseau, l'apprentissage et la mémoire in vitro sur le long terme.

Comment la culture, d'enregistrement et stimuler les réseaux neuronaux sur les micro-électrodes Arrays (AME)

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