Name: IP-FCM: immunoprécipitation détectée par cytométrie en flux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-02T10:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: Découvrez la méthode IP-FCM pour analyser les interactions protéine-protéine natives par immunoprécipitation et cytométrie en flux. Cette technique sensible fonctionne avec de petits échantillons sans génie génétique.

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Ce travail a été soutenu par le prix de l&#39;innovation Eagles (Ordre Fraternel des Aigles) et par la Fondation Mayo.

** Ce protocole vidéo est basée sur une publication associée 1: haute sensibilité de détection et d'analyse quantitative de la maternelle interactions protéine-protéine et de complexes multiprotéiques par cytométrie en flux. Adam G. Schrum, Diana Gil, Elaine P. Dopfer, David L. Wiest, Laurence A. Turka, Wolfgang WA Schamel, Ed Palmer. STKE Science 2007 (389): PL2 5 Juin 2007, [DOI: 10.1126/stke.3892007pl2]. <a href="http://stke.sciencemag.org/cgi/content/abstract/2007/389/pl2">S'il vous plaît cliquer ici pour voir cette publication</a> . Avant de partir, Préparer les solutions suivantes Stock aqueux: <table><tbody><tr><td> MES tampon de couplage: </td><td> Conserver à 25 ° C </td></tr><tr><td> MES, pH 6,0 </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> Trempe / Blocage / Stockage (SBQ) Tampon: </td><td> Conserver à 4 ° C </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 1% </td></tr><tr><td> L'azide de sodium </td><td> 0,02% </td></tr><tr><td> PBS, pH 7,4 </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Tampon FCM: </td><td> Conserver à 4 ° C </td></tr><tr><td> Tris, pH 7,4 </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> L'azide de sodium </td><td> 0,02% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 5% </td></tr><tr><td> PBS, pH 7,4 </td><td> 1x </td></tr></tbody></table> Préparer immédiatement avant l'utilisation: <table><tbody><tr><td> EDAC-MES: </td><td> Dissoudre 50 mg / mL dans la poudre EDAC MES tampon de couplage </td></tr><tr><td> Digitonine solution (2% p / v): </td><td> Dissoudre la poudre digitonine en DH 2 O par chauffage à 95 ° C pendant 5min puis refroidir sur glace </td></tr><tr><td> Tampon de lyse: </td><td></td></tr><tr><td> Tris, pH 7,4 </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 150 mm </td></tr><tr><td> Solution de digitonine </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Inhibiteurs de protéase </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Restez sur la glace </td><td></td></tr></tbody></table> 1. Couplage des mAb aux Perles <ol><li> Déterminer la concentration de perles à partir du stock acheté par dilution dans du PBS et de compter avec un hématimètre. Commencez avec une dilution 1:10000 de perles pour le comptage. </li><li> Pipeter 18 x 10 6 billes dans un microtube de 1,5 ml. </li><li> Laver les billes 2 à 3 fois dans 0,5 à 1,0 ml de tampon de couplage MES, centrifugation à 20.000 g pendant 3 minutes à 25 ° C après chaque lavage. </li><li> Resuspendre les perles dans 50 uL tampon de couplage MES. </li><li> Activer les groupes carboxyle sur les billes en ajoutant 20 uL d'fraîchement préparés EDAC-MES. </li><li> Mélanger doucement pendant 15 min à 25 ° C manuellement en aspiration et refoulement. </li><li> Laver les billes activées 2 à 3 fois dans 0,5 à 1,0 ml de PBS, la centrifugation à 20.000 g pendant 3 minutes à 25 ° C après chaque lavage. </li><li> Resuspendre les perles activé dans 50 ul de PBS. </li><li> Ajouter 50 uL de la propriété intellectuelle mAb (à 0.2 à 1.0 de concentration mg / ml) à la solution activée perle. </li><li> Mélanger pendant 3 à 4 heures à 25 ° C en plaçant le tube sur un vibrant shaker. Agiter suffisamment pour empêcher la sédimentation des perles sur le fond du tube. </li><li> Lavez-mAb couplée perles 2 à 3 fois dans 0,5 à 1,0 ml de PBS, la centrifugation à 20.000 g pendant 3 minutes à 25 ° C après chaque lavage. </li><li> Resuspendre les perles dans 100 uL de tampon QBS. Ceux-ci peuvent être conservés à 4 ° C. </li><li> Suspension des billes ainsi, diluer 1:200-1:10,000 dans du PBS et compter avec un hématimètre. La concentration doit être mesurée pour chaque lot de préparation, de sorte que le nombre de billes utilisées dans chaque expérience IP ou pull-down peut être contrôlée avec précision. </li></ol> 2. Préparation lysat post-nucléaire et Ip La méthode de lyse et les conditions de lyse optimale dépendra du type cellulaire et interactions protéine-protéine à l'étude. Un certain nombre de protocoles existent et peuvent être modifiés à votre application. <ol><li> Lyse 20 x 10 6 «petites» cellules, comme les lymphocytes, ou 5 x 10 6 «grandes» cellules, telles que les macrophages ou les cellules tumorales, dans 100 uL de tampon de lyse frais dans un microtube de 1,5 mL pour 20min sur la glace. Échelle du volume lyse des besoins. </li><li> Pour retirer les noyaux et débris cellulaires insolubles, centrifuger le lysat à 20.000 g pendant 10 min à 4 ° C. Gardez le surnageant et jeter le culot. </li><li> Ajouter 0,5 x 10 5 à 2,5 x 10 5 mAb couplée perles au lysat clarifié, pipetage doucement pour mélanger. Le volume minimal que nous utilisons poureffectuer une seule adresse IP est de 5 ul. </li><li> Placer sur une roue de rotation vertical 4 heures pour une nuit dans une chambre froide. Réglez la vitesse suffisante pour empêcher les perles de s'installer. Il est acceptable pour le liquide de faible volume IP de rester dans le fond du tube pendant la rotation. </li></ol> 3. Sondage du talon-capturé des protéines avec des anticorps conjugués au fluorochrome <ol><li> Laver les billes IP deux fois dans 0,2 à 1,0 ml de tampon glacé de la FCM, centrifugation à 20000 g à 4 ° C pendant 3 min après chaque lavage. </li><li> Resuspendre les billes en 100 FCM tampon et aliquot uL 20 uL dans chacune des cinq ou plus des microtubes de 1,5 ml ou puits d'une plaque de cheminée à fond. </li><li> Ajouter fluorochrome conjugués anticorps monoclonaux aux échantillons. Effectuez la FCM tache selon les instructions du vendeur ou en fonction de la concentration déterminée empiriquement. Comme point de départ, ajouter 0,2 à 1 microlitre de solution d'anticorps de stock (à 0,2 à 1,0 mg / mL) par tube ou un puits, et incuber pendant 40 min sur la glace. </li><li> Lavez sondé perles dans des tubes de 1,5 ml deux fois dans 1,0 ml de tampon FCM glacée, centrifugation à 20000 g à 4 ° C pendant 3 min après chaque lavage. Retirer délicatement le surnageant après chaque lavage, en prenant soin de ne pas déranger les perles. Pour une plaque de cheminée à fond, se laver deux fois avec 0,2 ml de tampon glacé de la FCM, centrifugation à 1000g pendant 5 min à 4 ° C après chaque lavage. Une pipette multicanaux est utile pour cette étape. Pour retirer le surnageant à partir de perles dans une plaque de cheminée à fond, «flick» la plaque une fois, puis, tout à l'envers, éponger les gouttes sur les bords du puits. Le volume résiduel dans chaque puits, contenant les billes, sera d'environ 20 pl. </li><li> Resuspendre les perles dans 200 uL de tampon de la FCM par échantillon. Transfert à l'étiquetage des tubes FACS. Les échantillons sont maintenant prêts pour la FCM. </li></ol> 4. Acquisition de la FCM Les perles de LMC décrite dans ce protocole sont de 3 à 5 microns de diamètre, soit environ la moitié du diamètre d'un lymphocyte de souris au repos. Par conséquent, il peut être nécessaire d'augmenter manuellement le Forward Scatter (FSC) et le gain de l'ampli Side Scatter (SSC) de tension pour que la population d'événements billes de s'inscrire sur une échelle. Individuels perles IP devraient former une seule population étroitement groupés. Les réglages et les portes doivent être ajustées afin d'exclure doublets billes et des débris. <ol><li> Avant de perles course ou normes perle, retirer le manchon de confinement qui entoure la goutte d'entrée d'échantillon sur certains cytomètres. Laisser le liquide de gaine goutte à goutte entre les échantillons, comme cela sera clair d'entrée et de prévenir les perles d'être reportés d'un échantillon à l'autre. </li><li> Utilisez des perles sans étiquette, un contrôle négatif de la fluorescence, et des particules d'étalonnage Rainbow (PCR), un contrôle positif de la fluorescence, d'ajuster les réglages de sorte que les deux extrêmes négatifs et positifs de fluorescence apparaissent simultanément sur le journal échelle axe des abscisses. Cela garantit que la fluorescence à partir des échantillons expérimentaux seront également sur l'échelle. Notez que les PCR sont plus petits que les grains atteints de LMC, alors FSC et SSC paramètres, ainsi que la position de grille, peut-être besoin d'être modifié temporairement pour cet échantillon. </li><li> Retour au sans étiquette-billes paramètres une fois l'étalonnage avec PCR est terminée. Si une seule sonde fluorescente par échantillon est utilisée, aucune compensation de fluorescence est nécessaire. En général, nous sondons complexes multiprotéiques avec un seul fluorochrome conjugués AcM par échantillon de la FCM, et nous examinons les partenaires d'interaction de plusieurs échantillons en parallèle par une coloration perle avec des Acm spécifiques pour les sous-unités différentes. </li><li> Acquérir et enregistrer la fluorescence des fichiers de données. L'analyse peut ensuite être effectuée en utilisant un logiciel de cytométrie en flux tels que CellQuest, FlowJo ou cflow. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/2066/2066fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. IP-FCM pour TCR/CD3 complexe multiprotéique. Lymphocytes T de la souche de souris Balb / c ont été lysées dans digitonine à 1%, et le lysat a été soumis à IP-FCM utilisant des anticorps anti-CD3ε perles. Les complexes capturé contenait des quantités importantes de TCR-β (région violet) et co-associé CD3-ε (vert), mais à proximité de niveaux de fond (défini par la sonde d'immunoglobulines non pertinents, rose trace) d'autres protéines telles que Thy1.2, CD45, ou H-2K (d) (marron, orange, et des traces bleues, respectivement). Voir similaires résultats publiés antérieurement 1-6.

<ol><li>Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-sensitivity+detection+and+quantitative+analysis+of+native+protein-protein+interactions+and+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Sci STKE. , pl2-pl2 (2007).</li>
<li>Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Visualization of multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 5, 9-9 (2009).</li>
<li>Teixeiro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+division+and+death+are+segregated+by+mutation+of+TCRbeta+chain+constant+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">T cell division and death are segregated by mutation of TCRbeta chain constant domains.</a> Immunity. 21, 515-526 (2004).</li>
<li>Teixeiro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+T+Cell+receptor+signals+determine+CD8%2B+memory+versus+effector+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Different T Cell receptor signals determine CD8+ memory versus effector development.</a> Science. 323, 502-505 (2009).</li>
<li>Treves, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Junctate+is+a+key+element+in+calcium+entry+induced+by+activation+of+InsP3+receptors+and%2For+calcium+store+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Junctate is a key element in calcium entry induced by activation of InsP3 receptors and/or calcium store depletion.</a> J Cell Biol. 166, 537-548 (2004).</li>
<li>Gil, D., Schrum, A. G., Alarcon, B., Palmer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+engagement+by+peptide-MHC+ligands+induces+a+conformational+change+in+the+CD3+complex+of+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">T cell receptor engagement by peptide-MHC ligands induces a conformational change in the CD3 complex of thymocytes.</a> J Exp Med. 201, 517-522 (2005).</li>
</ol>

Informations sur les interactions protéine-protéine est très pertinente pour l&#39;analyse de nombreux processus cellulaires tels que la transduction du signal, la maturation lignée, progression du cycle cellulaire, l&#39;apoptose et de cascades. IP-FCM offre un moyen rapide, quantitative, et sensible à examiner l&#39;interaction de protéines et de définir les membres de complexes multiprotéiques dans leur conformation native. Perles peuvent être couplés et incubées avec des lysats de cellules en une seule journée et peut être sondé et analysé le lendemain. Un format de plaque de 96 puits permet un grand nombre d&#39;échantillons à analyser à la fois pour fournir efficacement la collecte des données à des fins statistiques ou de dépistage. Utiliser fluorescents standards perle, le nombre de protéines capturées par chaque perle peut être estimé. Très peu d&#39;matériel source est nécessaire pour la capture et la détection, afin d&#39;échantillons limités et rares analytes peuvent encore être analysés pour de multiples interactions. Bien que IP-FCM n&#39;a pas besoin du génie génétique, épitope-tagging, la dénaturation, ou in vitro de mélange de protéines dans un environnement non-physiologique, il peut être couplé avec ces techniques et d&#39;autres, ce qui en fait un outil précieux et accessible avec applicabilité à de nombreux systèmes biologiques. Dépannage: Beaucoup IP FCM expériences génèrent des données utiles interaction protéine la première fois qu&#39;ils sont tentées. Cependant, l&#39;optimisation de la PI-FCM peut améliorer la conjugaison d&#39;anticorps à des perles, la capture des protéines complexes et sonde fluorescente contraignant. L&#39;efficacité de la conjugaison d&#39;anticorps IP peuvent être déterminées en sondant billes couplées directement avec un anticorps anti-immunoglobulines. Si ce rendement est faible, ce qui augmente la concentration d&#39;anticorps lors de la réaction de couplage peut permettre anticorps plus IP à attacher à chaque bille. Cela peut augmenter la capacité de liaison des lots IP perle, entraînant la capture améliorée et la détection des analytes. Autres primaires-amine contenant des molécules (par exemple Tris, sérum albumine bovine) ne devraient pas être présents lors de la réaction de couplage, car ils peuvent rivaliser avec les mAb pour fixation de perles et entraîner des mAb faible couplage. Si la conjugaison de mAb à des billes s&#39;avère problématique pour d&#39;autres raisons, les perles peuvent plutôt être couplé à l&#39;avidine / streptavidine, et des anticorps biotinylés peuvent ensuite être non covalente et utilisé pour immunprecipitation. Malgré une bonne conjugaison d&#39;anticorps, la détection initiale des billes associées à fluorescence peut être faible. Premièrement, la capture complexe lui-même peut être faible. Parce que IP-FCM dépend de la concentration des analytes, l&#39;augmentation du nombre de cellules lysées par volume unité de lyse peut augmenter la capture et la détection analyte. De plus, la capture peut être améliorée en diminuant le nombre de billes IP incubées avec le lysat, qui distribue les complexes capturés dans moins de perles, et les résultats de la fluorescence moyenne a augmenté par bille lorsque sondé. Deuxièmement, il est possible que l&#39;accès de l&#39;anticorps sonde pour les complexes capturée est stériquement encombrés par l&#39;anticorps immunoprécipiter. Dans ce cas, le problème peut être résolu en utilisant des anticorps différents pour capturer et / ou de la sonde.

<table><tbody><tr><td>billes de latex de polystyrène modifiées par des groupes carboxylate (CML) (5 mm, sans tensioactif)</td><td>Réactif</td><td>Interfacial Dynamics</td><td>2-5000</td><td>Conserver à 4&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>Particules de calibration Rainbow</td><td>Réactif</td><td>Spherotech, Inc.</td><td>RCP-30-5A</td><td>Conserver à 4&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>acide 2-[N-morpholino]éthanesulfonique (MES)</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-5287</td><td></td></tr><tr><td>chlorhydrate de 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide (EDAC)</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22980 E-6383</td><td>Conserver à -20&amp;#x00B0;C dans des conditions anhydres.</td></tr><tr><td>Cocktail général d'inhibiteurs de protéases, contenant AEBSF, Bestatine, Aprotinine, EDTA, E-64 et Leupeptine</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-2714</td><td>Préparer une solution mère 100x dans de l'H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. Aliquoter et conserver à -20&amp;#x00B0;C. Manipuler avec des gants.</td></tr><tr><td>Plaques PCR, 96 puits, 0,2 mL, naturelles, à parois hautes</td><td>Réactif</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-408-230</td><td>À utiliser à la place des tubes microcentrifuges lors de la coloration en cytométrie en flux (FCM)</td></tr></tbody></table>

ip-fcm: immunoprécipitation détectée par cytométrie en flux

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

Immunoprécipitation détectée par cytométrie en flux (IP-FCM) est une méthode efficace pour détecter et quantifier les interactions entre protéines. Le principe de base vaut celle d&#39;ELISA en sandwich, dans lequel l&#39;analyte capturé primaire peut être détecté avec d&#39;autres molécules physiquement associés au sein de complexes multiprotéiques. La procédure implique le couplage covalent de microbilles de latex de polystyrène avec immunoprécipiter anticorps monoclonaux (mAb) spécifique pour une protéine d&#39;intérêt, l&#39;incubation de ces perles avec des lysats cellulaires, sondant les complexes protéiques capturé avec fluorochrome conjugués des sondes, et l&#39;analyse des billes associées à fluorescence par cytométrie en flux. IP-FCM est extrêmement sensible, permet l&#39;analyse des protéines dans leur langue maternelle (non dénaturé) État, et est susceptible d&#39;être soit l&#39;analyse semi-quantitative ou quantitative. Comme autres avantages, IP-FCM ne nécessite pas de génie génétique ou de l&#39;équipement spécialisé, sauf un cytomètre en flux, et il peut être facilement adapté pour applications à haut débit.

La méthode IP-FCM est présenté, ce qui permet un sensible, robuste, l&#39;évaluation biochimique de la maternelle interactions protéine-protéine, sans exiger le génie génétique ou échantillons de grande taille.

IP-FCM: immunoprécipitation détectée par cytométrie en flux

L'immunoprécipitation détectée par cytométrie en flux (IP-FCM) est une méthode efficace pour détecter et quantifier les interactions protéine-protéine. Le principe...

Dans les expériences de cytométrie en flux après immunoprécipitation (IP FCM), les complexes protéiques sont capturés sur des billes afin d'identifier et d'étudier les différentes protéines interagissant entre elles. Premièrement, un anticorps d'immunoprécipitation spécifique de la protéine d'intérêt est couplé de manière covalente à des billes de latex en polystyrène. Dans un deuxième temps, ces billes sont incubées avec des lysats cellulaires, permettant à la protéine ciblée et aux protéines interagissant avec elle de se lier aux billes.Les billes, accompagnées des protéines capturées, sont ensuite lavées et incubées avec des anticorps marqués par fluorescence, spécifiques de diverses molécules pouvant être associées à la protéine immunoprécipitée. Enfin, les billes marquées par fluorescence sont analysées par cytométrie en flux afin de déterminer quelles protéines sont présentes ou absentes des complexes capturés. Les avantages de cette technique par rapport à d'autres méthodes, telles que l'immunoprécipitation suivie d'un immunoblot, résident dans la capacité de la cytométrie en flux après immunoprécipitation (I-P-F-C-M) à évaluer les interactions natives entre protéines sans nécessiter de génie génétique ni de grandes quantités d'échantillon.I-P-F-C-M peut produire un rapport signal sur bruit élevé, même lorsque la quantité de biomatériau disponible pour l'analyse est très faible, car cette méthode peut être réalisée avec de petits volumes et de faibles concentrations d'analytes. Pour commencer cette procédure, préparez les tampons suivants : tampon de couplage au MES, tampon d'arrêt du couplage, tampon de blocage et de stockage (abrévié QBS) et tampon pour cytométrie en flux ou FCM. Déterminez la concentration des billes de latex en polystyrène modifiées par des groupements carboxylate, ou billes CML, en diluant dans du PBS et en effectuant un dénombrement à l'aide d'un hémocytomètre.Une fois la concentration des billes déterminée, pipetez 18 fois 10 à la puissance 6 billes dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Lavez les billes deux à trois fois dans 0,5 à un millilitre de tampon de couplage MES en centrifugeant à 20 000 fois la gravité pendant trois minutes à température ambiante. Après chaque lavage, pendant que les billes sont en centrifugation.Préparez un tampon MES frais pour l'activation des billes. Une fois les lavages terminés, conservez le tampon à température ambiante ou sur de la glace. Après le dernier lavage, resuspendez les billes dans 50 microlitres de tampon de couplage MES.Ensuite, ajouter 20 microlitres de MES EEC à la suspension de billes. Afin d'activer les groupes carboxyles sur les billes, mélanger doucement à température ambiante en pipetant manuellement vers le haut et vers le bas de manière continue pendant 15 minutes. Bien que cette étape soit laborieuse, cette méthode de mélange donne les meilleurs résultats après le mélange.Lavez les billes activées deux à trois fois dans 0,5 à un millilitre de PBS Centrifusion à 20 000 × g pendant trois minutes à température ambiante. Après chaque lavage, et après le lavage final, remettez en suspension les billes activées dans 50 microlitres de PBS afin de coupler l'anticorps IP aux billes. Ajoutez 50 microlitres de l'anticorps monoclonal IP à partir d'une solution mère dont la concentration est comprise entre 0,2 et un milligramme par millilitre.Veillez à ce qu'aucune molécule contenant une amine primaire autre que l'anticorps ne soit présente. Ces molécules contenant des amines, telles que le tris ou l'albumine sérique bovine, entrent en compétition avec l'anticorps pour la fixation sur les billes. Mélangez la suspension d'anticorps sur billes à l'aide d'un agitateur vibrant pendant trois à quatre heures à température ambiante.Agiter suffisamment pour éviter que les billes ne sédimentent au fond du tube. Après la liaison, laver les billes couplées à l'anticorps deux à trois fois dans 0,5 à un millilitre de PBS en centrifugeant à 20 000 ×g.Centrifuger par gravité pendant trois minutes à température ambiante après chaque lavage. Enfin, resuspendre les billes dans 100 microlitres de tampon QBS. Le couplage des anticorps monoclonaux aux billes CML peut être vérifié en colorant les billes avec des anticorps conjugués à un fluorochrome dirigés contre l'IgG.Après l'analyse par CMF, les billes revêtues d'anticorps monoclonal peuvent être conservées à quatre degrés Celsius jusqu'à leur utilisation dans une expérience d'IP. Tout d'abord, bien resuspendre les billes, les diluer d'un à 200 à un à 10 000 dans du PBS et les compter à l'aide d'un hémocytomètre. La concentration doit être mesurée pour chaque lot préparatif afin que le nombre de billes utilisé dans chaque expérience d'IP puisse être précisément contrôlé.Ensuite, préparez une solution fraîche de dig à 2 % poids par volume dans l'eau. Chauffez à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes. Puis refroidissez sur de la glace.Diluez, puis ajoutez à 1 % en poids par volume dans un tampon de lyse fraîchement préparé, et maintenez sur glace. Déterminez le nombre de cellules à lysér à l’aide du tableau présenté comme guide. Toutefois, le nombre de cellules requis dépend de la protéine d’intérêt et doit être déterminé empiriquement.Ici, 30 fois 10 à la puissance six cellules provenant d'une lignée cellulaire de tumeur lymphocytaire petite sont utilisées. Transférez le volume requis de suspension cellulaire dans un tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre. Faites précipiter les cellules à 20 000 fois.Centrifuger pendant 30 secondes à quatre degrés Celsius et aspirer le milieu. Ajouter la quantité appropriée de tampon de lyse Dig fraîchement préparé au culot, en mélangeant délicatement par pipetage ascendant et descendant.Ensuite, laissez les cellules lyser pendant 20 minutes sur de la glace. Notez que, selon le type cellulaire et les interactions protéine-protéine étudiées, les conditions de lyse peuvent varier et doivent être déterminées empiriquement lorsque la lyse est complète. Éliminez les noyaux et les débris cellulaires insolubles par centrifugation du lysat à 20 000 ×g.Centrifuger par gravité pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Conserver le surnageant et jeter le culot afin de lier la protéine cible aux billes revêtues d'anticorps. Ajouter entre 50 000 et 250 000 billes couplées à un anticorps monoclonal au lysat clarifié en pipettant doucement.Pour mélanger, le volume minimal de lysat utilisé pour une IP unique est de cinq microlitres. Placer le mélange de lysat clarifié et de billes sur une roue verticale rotative pendant quatre heures à toute la nuit dans une chambre froide, à une vitesse suffisante pour empêcher les billes de se déposer. En dessous du volume des IP, le liquide peut rester au fond du tube pendant la rotation. Après la liaison de la protéine cible à l'anticorps d'IP.Procédez à l'étiquetage fluorescent du complexe immuno. Lavez les billes d'IP deux fois dans un millilitre de tampon FCM glacé, en centrifugeant à 20 000 ×g pendant trois minutes à quatre degrés Celsius. Après chaque lavage, resuspendez les billes dans 100 microlitres de tampon FCM et aliquotez 20 microlitres dans chacun des cinq tubes ou plus.Tubes de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre ou puits d'une plaque à fond surélevé. Les deux sont illustrés ici. Ajoutez aux échantillons des anticorps monoclonaux conjugués à un fluorochrome.Réalisez la coloration par cytométrie en flux en suivant les instructions du fabricant ou selon des concentrations déterminées empiriquement comme point de départ. Ajoutez entre 0,2 et un microlitre de solution mère d'anticorps d'au moins 0,1 milligramme par millilitre par tube ou puits et incubez pendant 40 minutes sur de la glace. Lavez les billes marquées deux fois dans des tubes de 1,5 millilitre avec un millilitre de liquide glacé.Tampon FCM, centrifuger à 20 000 fois la gravité à quatre degrés Celsius pendant trois minutes. Après chaque lavage, retirer délicatement le surnageant après chaque lavage, en prenant soin de ne pas perturber les billes.Alternativement, pour un bloc de fond de colonne, effectuez deux lavages avec 0,2 millilitre de tampon FCM glacé en centrifugeant à 1000 × g pendant cinq minutes à 4 °C. Après chaque lavage, après chaque lavage. Pour éliminer le surnageant des billes, secouez légèrement la plaque une fois, puis, tout en la maintenant à l’envers, absorbez les gouttes résiduelles sur les bords des puits à l’aide d’un papier absorbant.Le volume résiduel dans chaque puits contenant les billes sera d'environ 20 microlitres. Suspendre les billes dans 200 microlitres de tampon FCM par échantillon et transférer dans des tubes fax étiquetés. Les échantillons sont désormais prêts pour la cytométrie en flux ou FCM sur les cytomètres Becton Dickinson et autres cytomètres en flux.Retirez la gaine de confinement des gouttelettes qui pourrait entourer l'entrée d'échantillon ou le tube capillaire. Laissez le tube capillaire goutter entre les échantillons, car cela empêchera les billes d'être transférées d'un échantillon à l'autre. Les billes CML utilisées ici mesurent de trois à cinq micromètres de diamètre, soit environ la moitié du diamètre d'un lymphocyte de souris au repos.Par conséquent, il peut être nécessaire d'augmenter manuellement le gain de l'amplificateur de diffusion avant et la tension de diffusion latérale afin que la population d'événements correspondant aux billes soit détectée sur le cytomètre. Pour ce faire, on utilise des billes non marquées ou témoins. Les paramètres dans GAIT sont ajustés pour exclure les billes, les doublets et les agrégats avant la lecture.Les échantillons expérimentaux garantissent que la fluorescence sera dans l'échelle appropriée. Les billes non marquées servent de contrôle négatif pour la fluorescence, et les particules de calibration arc-en-ciel ou RCP peuvent être utilisées comme contrôle positif pour la fluorescence. Étant donné que les RCP sont plus petites que les billes CML, les paramètres de diffusion avant et de diffusion latérale, ainsi que la position du portillon, peuvent devoir être modifiés temporairement pour cet échantillon.Après ces étalonnages, les extrêmes négatifs et positifs de la fluorescence sont visualisés sur un axe logarithmique. Une fois l'étalonnage avec les RCP terminé, revenir aux paramètres des billes non marquées pour la diffusion avant et latérale. Tant qu'une seule sonde fluorescente par échantillon est utilisée, comme dans l'expérience présentée ici, aucune compensation de fluorescence n'est nécessaire.Acquérez et enregistrez maintenant les fichiers de données de fluorescence ; l'analyse est ensuite effectuée à l'aide d'un logiciel de cytométrie en flux tel que CellQuest ou FlowJo. Voici le résultat d'une analyse IP FCM des lymphocytes T murins LY en présence de 1 % de digitonine. Le complexe non protéique TCR-CD3 a été immunoprécipité à l'aide de billes anti-CD3 epsilon.Les complexes capturés contiennent des quantités importantes de la chaîne bêta du TCR et de la molécule CD3ε associée. Des niveaux proches du bruit de fond pour d'autres protéines ont été détectés, comme déterminé à l'aide d'une sonde d'immunoglobuline non spécifique ou d'anticorps dirigés contre les protéines TH1.2, CD45 ou H2-KD. Les avantages de cette technique par rapport à d'autres méthodes telles que l'immunoprécipitation suivie d'un immunoblot, résident dans la capacité de l'I-P-F-C-M à permettre l'évaluation d'interactions protéine-protéine natives sans nécessiter d'ingénierie génétique ni de grandes quantités d'échantillons. L'I-P-F-C-M peut produire des rapports signal sur bruit élevés, même lorsque très peu de biomatériau est disponible pour l'analyse, car elle peut être réalisée avec de petits volumes et de faibles concentrations d'analytes.

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