IP-FCM: immunoprécipitation détectée par cytométrie en flux

Dans les expériences IP FCM, des complexes protéiques sont capturés sur des billes afin d’identifier et d’étudier les différentes protéines qui interagissent entre elles. Tout d’abord, un anticorps immunoprécipitant spécifique de la protéine d’intérêt est couplé de manière covalente à des billes de latex de polystyrène. Dans un deuxième temps, ces billes sont incubées avec des lysats cellulaires, ce qui permet à la protéine spécifique et aux protéines en interaction de se lier aux billes.

Les billes sont mélangées aux protéines capturées, puis lavées et sondées avec des anticorps marqués par fluorescence spécifiques de diverses molécules qui peuvent être associées à la protéine immunoprécipitée. Enfin, les billes marquées par fluorescence sont analysées par cytométrie en flux pour déterminer quelles protéines sont présentes sur lesquelles vous êtes absent des complexes capturés. L’avantage de cette technique par rapport à d’autres méthodes, telles que l’immunoprécipitation, suivie d’un western blot, est la capacité de I-P-F-C-M à permettre l’évaluation des interactions protéiques natives sans nécessiter de génie génétique ou de grandes tailles d’échantillons.

L’I-P-F-C-M peut produire un rapport signal/bruit élevé, même lorsque très peu de biomatériaux sont disponibles pour l’analyse, car il peut être réalisé avec de petits volumes et de faibles concentrations d’analytes. Pour commencer cette procédure, préparez les tampons suivants, tampon de couplage MES, tampon de stockage de blocage d’extinction de tampon, QBS abrégé et cytométrie en flux ou tampon FCM. Déterminer la concentration des billes de latex de polystyrène modifié au carboxylate ou billes de LMC en les diluant dans du PBS et en comptant à l’aide d’un hémocytomètre.

Une fois la concentration des billes déterminée, pipetez 18 fois 10 aux six billes dans un microtube à centrifuger de 1,5 millilitre. Lavez les billes deux à trois fois dans 0,5 à un millilitre de tampon de couplage MES, en centrifugeant à 20 000 fois la gravité pendant trois minutes à température ambiante. Après chaque lavage, pendant que les billes sont en centrifugation.

Préparez un tampon MES frais e dac pour l’activation des billes. Une fois les lavages terminés, conservez le tampon à température ambiante ou sur de la glace. Après le lavage final, remettez les billes en suspension dans 50 microlitres du tampon de couplage MES.

Ajoutez ensuite 20 microlitres de MES CEE à la suspension à billes. Afin d’activer les groupes carboxyle sur les billes, mélangez doucement à température ambiante en pipetant manuellement de haut en bas en continu pendant 15 minutes. Bien que cette étape demande beaucoup de main-d’œuvre, cette méthode de mélange donne les meilleurs résultats après le mélange.

Lavez les billes activées deux à trois fois dans 0,5 à un millilitre de PBS Centrifusion à 20 000 fois. Gravité pendant trois minutes à température ambiante Après chaque lavage après le lavage final, remettre en suspension les billes activées dans 50 microlitres de PBS pour coupler l’anticorps IP aux billes. Ajouter 50 microlitres de l’anticorps monoclonal IP à partir d’une concentration de stock comprise entre 0,2 et un milligramme par millilitre.

Assurez-vous qu’aucune molécule contenant une amine primaire autre que l’anticorps n’est présente. Ces molécules contenant des amines telles que le tris ou l’albumine sérique bovine entrent en compétition avec l’anticorps pour se coulier aux billes. Mélangez la suspension d’anticorps de bille sur un agitateur vibrant pendant trois à quatre heures à température ambiante.

Agitez suffisamment pour éviter que les billes ne se déposent au fond du tube. Après la reliure. Lavez les billes de morue d’anticorps deux à trois fois dans 0,5 à un millilitre de PBS par centrifugation à 20 000 fois.

Gravité pendant trois minutes à température ambiante après chaque lavage. Enfin, remettez les billes en suspension dans 100 microlitres de tampon QBS. Le couplage des anticorps monoclonaux aux billes de LMC peut être vérifié en colorant les billes avec des anticorps conjugués fluro contre les IgG.

Après une analyse FCM, les billes recouvertes de l’anticorps monoclonal peuvent être stockées à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à être utilisées dans une expérience IP. Tout d’abord, suspendez bien les billes, diluez-les de un à 200 à un à 10 000 dans du PBS et comptez avec un hémocytomètre. La concentration doit être mesurée pour chaque lot de préparation afin que le nombre de billes utilisées dans chaque expérience IP puisse être contrôlé avec précision.

Ensuite, préparez une solution fraîche dans l’eau à 2 % poids par volume. Chauffer à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes. Puis refroidir sur de la glace.

Diluer, creuser à 1 % poids par volume dans de la lyse fraîchement préparée, tamponner et conserver sur de la glace. Déterminez le nombre de cellules à lys à l’aide du tableau présenté à titre indicatif. Cependant, le nombre de cellules nécessaires dépend de la protéine d’intérêt et doit être déterminé empiriquement.

Ici, 30 fois 10 à six cellules d’une petite lignée cellulaire tumorale lymphoïde sont utilisées. Transférez le volume de suspension cellulaire requis dans un tube à centrifuger de 1,5 millilitre. Granulez les cellules à 20 000 fois.

Gravité pendant 30 secondes à quatre degrés Celsius et aspirer le support. Ajoutez la quantité appropriée de fraîchement préparé. Creusez le tampon de lyse sur la pastille mélangée doucement en pipetant de haut en bas.

Laissez ensuite les cellules poux pendant 20 minutes sur de la glace. Notez qu’en fonction du type de cellule et des interactions protéiques étudiées, les conditions de lyse cellulaire peuvent varier et doivent être déterminées empiriquement lorsque la lyse est terminée. Retirez les noyaux et les débris cellulaires insolubles en centrifugeant le lysat à 20 000 fois.

La gravité, les 10 minutes à quatre degrés Celsius. Conservez le SNA et jetez la pastille pour lier la protéine cible aux billes enrobées d’anticorps. Ajoutez doucement 50 000 à 250 000 billes couplées à des anticorps monoclonaux dans le pipetage de lysat clarifié.

Pour mélanger, le volume minimum de lysat utilisé pour une seule IP est de cinq microlitres. Placez le mélange de lysat clarifié et de billes sur une roue verticale rotative pendant quatre heures à toute la nuit dans une chambre froide réglée à une vitesse suffisante pour éviter que les billes ne se déposent en dessous du volume ips, le liquide peut rester au fond du tube pendant la rotation. Suite à la liaison de la protéine cible à l’anticorps IP.

Procédez au marquage par fluorescence du complexe immunitaire. Lavez les billes IP deux fois dans un millilitre de glace appelé tampon FCM, en centrifugeant à 20 000 fois la gravité pendant trois minutes à quatre degrés Celsius. Après chaque lavage, suspendez à nouveau les billes dans 100 microlitres de tampon FCM et aliquotez 20 microlitres dans chacun des cinq ou plus.

Tubes de micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre ou puits d’une plaque de fond de cheminée. Les deux sont présentés ici. Ajoutez des anticorps monoclonaux conjugués au fluorochrome dans les échantillons.

Effectuer la coloration FCM en suivant les instructions du fournisseur ou selon des concentrations déterminées empiriquement comme point de départ. Ajoutez 0,2 à un microlitre de solution mère d’anticorps d’au moins 0,1 milligramme par millilitre par tube ou puits et incubez pendant 40 minutes sur de la glace. Lavez deux fois les billes sondées dans des tubes de 1,5 millilitre avec un millilitre de glacial.

Tampon FCM, centrifugation à 20 000 fois. Gravité à quatre degrés Celsius pendant trois minutes. Après chaque lavage, retirez délicatement le supinate après chaque lavage en prenant soin de ne pas déranger les billes.

Alternativement, pour une cheminée, la plaque inférieure est lavée deux fois avec 0,2 millilitre de glaçon, le tampon FCM centrifuge à 1000 fois la gravité pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Après chaque lavage, après chaque lavage. Pour retirer le surnageant des billes, retournez la plaque une fois, puis épongez les gouttes des bords des puits pendant qu’elle est encore à l’envers.

Le volume résiduel dans chaque puits contenant les billes sera d’environ 20 microlitres. Suspendez les billes dans 200 microlitres de tampon FCM par transfert d’échantillon vers des tubes de fax étiquetés. Les échantillons sont maintenant prêts pour la cytométrie en flux ou FCM sur Becton Dickens et les cytomètres en flux.

Retirez le manchon de confinement des gouttelettes qui peut entourer l’entrée ou la gorgée de l’échantillon. Laissez la gorgée s’égoutter entre les échantillons, car cela empêchera les billes d’être transportées d’un échantillon à un autre. Les billes de LMC utilisées ici ont un diamètre de trois à cinq micromètres, soit environ la moitié du diamètre d’un lymphocyte de souris quiescent.

Par conséquent, il peut être nécessaire d’augmenter manuellement le gain de l’ampli de diffusion directe et la tension de diffusion latérale afin de tenir compte de la population d’événements de billes. Pour s’inscrire sur le cytomètre ici, cela se fait à l’aide de billes non étiquetées ou vierges. Les réglages de la marche sont ajustés pour exclure les perles, les doublets et l’abri avant la lecture.

Des échantillons expérimentaux garantissent que la fluorescence sera à l’échelle. Les billes non marquées servent de contrôle négatif de la fluorescence et les particules d’étalonnage arc-en-ciel ou RCP peuvent être utilisées comme contrôle positif de la fluorescence. Étant donné que les RCP sont plus petits que les billes de CML, il peut être nécessaire de modifier temporairement les paramètres de diffusion vers l’avant et de diffusion latérale ainsi que la position de marche pour cet échantillon.

Après ces étalonnages, les extrêmes de fluorescence négatifs et positifs sont visualisés sur un axe logarithmique. Une fois l’étalonnage avec les RCP terminé, revenez aux paramètres de billes non étiquetées pour la diffusion vers l’avant et sur les côtés. Tant qu’une seule sonde fluorescente par échantillon est utilisée, comme dans l’expérience présentée ici, aucune compensation de fluorescence n’est nécessaire.

Maintenant, acquérez et enregistrez les fichiers de données de fluorescence, l’analyse est effectuée par la suite à l’aide d’un logiciel de cytométrie en flux tel que cell Quest ou FlowJo. Voici le résultat d’une analyse IP FCM de la cellule T LY de souris en toin à 1 % de chiffres. Le complexe non protéique TCR CD trois a été abattu avec des billes d’epsilon anti CD trois.

Les complexes capturés contiennent des quantités significatives de TCR bêta et de CD trois epsilon associé. Des niveaux proches du bruit de fond d’autres protéines ont été détectés, tels que déterminés à l’aide d’une sonde d’immunoglobuline non pertinente ou d’anticorps dirigés contre les protéines TH 1.2, CD 45 ou H two KD. L’avantage de cette technique par rapport à d’autres méthodes telles que l’immunoprécipitation, suivie d’un western blot, est la capacité de I-P-F-C-M à permettre l’évaluation des interactions protéiques natives sans avoir besoin de génie génétique ou d’échantillons de grande taille. L’I-P-F-C-M peut produire des rapports signal/bruit élevés, même lorsque très peu de biomatériaux sont disponibles pour l’analyse, car elle peut être réalisée avec de petits volumes et de faibles concentrations d’analytes.