Name: Lidentification des gènes induite par une dysrégulation de Kaposi associé au sarcome de Herpesvirus (KSHV) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Découvrez l'immunohistochimie à double marquage pour identifier les protéines virales et cellulaires dans les tissus tumoraux du sarcome de Kaposi. Cette méthode permet de localiser les agents infectieux et les gènes cellulaires dysrégulés.

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Nous remercions James EK Hildreth, Meharry Medical College, pour ses conseils et de l&#39;examen de ce manuscrit. Nous remercions également Diana Marver pour l&#39;édition du manuscrit. Ce travail a été soutenu par le Centre Meharry Vanderbilt for AIDS Research (NIH P30 AI054999-05), le Centre de santé Disparités recherche sur le sida, NIH 5U54 RR019192-05, le Centre pour la recherche clinique Meharry, des subventions du NIH P20RR011792, et par le NIH subventions P01 CA113239. JAA a été partiellement financé par des subventions pilotes à partir du Centre Vanderbilt-Meharry recherche sur le sida (CFAR) et le Centre pour la recherche clinique Meharry (CRC).

<ol><li>Sitas, F., Newton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+sarcoma+in+South+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst+Monogr%22%5BJournal%5D)">Kaposi's sarcoma in South Africa.</a> J Natl Cancer Inst Monogr. 28, 1-4 (2001).</li>
<li>Moore, P. S., Chang, Y. Kaposi's sarcoma associated herpesvirus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoore%2C+PS+%22Field%27s+Virology%22">Field's Virology</a>. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Lippincott Williams and Wilkins. Philadelphia, PA. 2803-2833 (2002).</li>
<li>Chang, Y., Cesarman, E., Pessin, M. S., Lee, F., Culpepper, J., Knowles, D. M., Moore, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+herpesvirus-like+DNA+sequences+in+AIDS-associated+Kaposi%27s+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma.</a> Science. 266, 1865-1869 (1994).</li>
<li>Cesarman, E., Chang, Y., Moore, P., Said, J. W., Knowles, D. M., M, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus-like+DNA+sequences+in+AIDS-related+body-cavity-based+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-related body-cavity-based lymphomas.</a> N Engl J Med. 18, 1186-1191 (1995).</li>
<li>Cesarman, E., Knowles, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus%3A+a+lymphotropic+human+herpesvirus+associated+with+Kaposi%27s+sarcoma%2C+primary+effusion+lymphoma%2C+and+multicentric+Castleman%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Diagn+Pathol%22%5BJournal%5D)">Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus: a lymphotropic human herpesvirus associated with Kaposi's sarcoma, primary effusion lymphoma, and multicentric Castleman's disease.</a> Semin Diagn Pathol. 14, 54-66 (1997).</li>
<li>Chiou, C. J., Poole, L. J., Kim, P. S., Ciufo, D. M., Cannon, J. S., ap Rhys, C. M., Alcendor, D. J., Zong, J. C., Ambinder, R. F., Hayward, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+gene+expression+and+a+transactivation+function+exhibited+by+the+vGCR+%28ORF74%29+chemokine+receptor+protein+of+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Patterns of gene expression and a transactivation function exhibited by the vGCR (ORF74) chemokine receptor protein of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus.</a> J Virol. 76, 3421-3439 (2002).</li>
<li>Staskus, K. A., Zhong, W., Gebhard, K., Herndier, B., Wang, H., Renne, R., Beneke, J., Pudney, J., Anderson, D. J., Ganem, D., Haase, A. T., T, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus+gene+expression+in+endothelial+%28spindle%29+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus gene expression in endothelial (spindle) tumor cells.</a> J Virol. 71, 715-719 (1997).</li>
<li>Alcendor, D. J., Zhu, W. Q., Desai, P., Vigil, H. E., Hayward, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KSHV+downregulation+of+galectin-3+in+kaposi%27s+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">KSHV downregulation of galectin-3 in kaposi's sarcoma.</a> Glycobiology. , (2009).</li>
<li>Ciufo, D. M., Cannon, J. S., Poole, L. J., Wu, F. Y., Murray, P., Ambinder, R. F., Hayward, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spindle+cell+conversion+by+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus%3A+formation+of+colonies+and+plaques+with+mixed+lytic+and+latent+gene+expression+in+infected+primary+dermal+microvascular+endothelial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Spindle cell conversion by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus: formation of colonies and plaques with mixed lytic and latent gene expression in infected primary dermal microvascular endothelial cell cultures.</a> J Virol. 75, 5614-5626 (2001).</li>
<li>Long, E., Ilie, M., Hofman, V., Havet, K., Selva, E., Butori, C., Lacour, J. P., Nelson, A. M., Cathomas, G., Hofman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LANA-1%2C+Bcl-2%2C+Mcl-1+and+HIF-1alpha+protein+expression+in+HIV-associated+Kaposi+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Arch%22%5BJournal%5D)">LANA-1, Bcl-2, Mcl-1 and HIF-1alpha protein expression in HIV-associated Kaposi sarcoma.</a> Virchows Arch. 2, 159-170 (2009).</li>
</ol>

Les méthodologies utilisées dans ce rapport peuvent être effectuées dans une variété de paramètres de laboratoire. Ils exigent un équipement spécial ou d&#39;accès aux installations de base. Précautions appropriées doivent être prises lorsque vous faites des expériences impliquant des agents pathogènes viraux tels infectieuses KSHV qui peut nécessiter l&#39;utilisation d&#39;un niveau biosaftey 3 (BSL-3) des installations. Acquisitions de tissus doivent également être approuvée par les conseils appropriés d&#39;examen i...

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>05-0001DJ</td><td></td></tr><tr><td>TPA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7,4</td><td>Invitrogen</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Butyrate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19364 (FLUKA)</td><td></td></tr><tr><td>Milieu EBM-2</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-3156</td><td>+ supplément du kit bullet</td></tr><tr><td>Cellules DMVEC (HMVEC)</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC2543</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Hyclone</td><td>SH30066.03</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Lames à chambre</td><td>Nalge Nunc international</td><td>154461</td><td></td></tr><tr><td>Ac. mon. KSHV LANA</td><td>Vector Laboratories</td><td>VP-H913</td><td>1:50 dilution/IFA</td></tr><tr><td>Galectine-3, Ac. pol. caprin</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AF1154</td><td></td></tr><tr><td>Anti-caprin FITC, âne</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-095-1</td><td></td></tr><tr><td>Anti-caprin Rho, âne</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-295-003</td><td>1:100 dilution/IFA</td></tr><tr><td>Milieu de montage</td><td>Vector Laboratories</td><td>H 1500</td><td>Vectashield avec DAPI</td></tr><tr><td>Kit d'analyse des protéines BCA</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0112</td><td></td></tr><tr><td>Anti-caprin conjugué, âne</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC 2020</td><td></td></tr><tr><td>Substrat pour western</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>34075</td><td></td></tr><tr><td>Biotine-lapin-anti caprin</td><td>Dako</td><td>305-065-045</td><td></td></tr><tr><td>Conjugué AP-streptavidine</td><td>Dako</td><td>K 0492 (kit)</td><td></td></tr><tr><td>Jeu RNase sans DNase</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Cycleur MJ Mini</td><td>Bio-Rad</td><td>PTC-1148C</td><td></td></tr><tr><td>Bio-photomètre</td><td>Eppendorf</td><td>952000006</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse RC 6 Plus</td><td>Sorvall, Thermo Scientific</td><td>46910</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifugeuse Coulter Optima L-90K</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>392052</td><td></td></tr><tr><td>Système de détection en temps réel PCR MYiQ iCycler</td><td>Bio-Rad</td><td>170-9770</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence TE 2000S</td><td>Nikon Instruments</td><td>TE2000S</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2938C</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse E 200</td><td>Nikon Instruments</td><td>E 200</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse Sorvall Legend RT</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>75004377</td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;identification des gènes induite par une dysrégulation de kaposi associé au sarcome de herpesvirus (kshv)

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus (KSHV)

Actuellement KS est le plus prédominant du VIH / sida cancer liés à l&#39;Afrique australe et par conséquent le monde 1,2. Elle se caractérise comme une tumeur angioproliferative des cellules endothéliales vasculaires et produit les maladies rares cellules B lymphoprolifératifs sous la forme de lymphomes épanchement pleural (PEL) et certaines formes de maladie de Castleman multicentrique. 3-5 seulement 1-5% des cellules dans les lésions KS soutenir activement la réplication lytique du sarcome de Kaposi associé herpèsvirus (KSHV), l&#39;agent étiologique associé à KS, et il est clair que des facteurs cellulaires doivent interagissent avec des facteurs viraux dans le processus d&#39;oncogenèse et la progression tumorale. Identifier 6,7 roman hôte facteur déterminants qui contribuent à la pathologie KS est essentiel pour le développement de marqueurs pronostiques de la progression tumorale et les métastases, ainsi que pour développer de nouvelles thérapies pour le traitement de KS 8. Les détails vidéo d&#39;accompagnement des méthodes que nous utilisons pour identifier l&#39;hôte cellulaire programmes d&#39;expression génique altérée dans les cellules endothéliales microvasculaires dermiques (DMVEC) après l&#39;infection KSHV et dans le tissu tumoral KS. 9 fois gènes dérégulé sont identifiés par l&#39;analyse des microréseaux, des changements dans l&#39;expression des protéines sont confirmée par immunoblot et double immunofluorescence étiquetés. Les changements dans l&#39;expression transcriptionnelle de gènes dérégulé sont confirmés in vitro par quantitative en temps réel la réaction en chaîne polymérase (PCR qRT). Validation des résultats in vitro en utilisant des archives tissu tumoral KS est également effectuée par immunochimie étiquetés double et tissue microarrays. 8,10 Notre approche pour identifier les gènes dérégulé dans le microenvironnement KS tissu tumoral permettra le développement d&#39;études in vitro et par la suite dans des systèmes modèles in vivo pour découverte et l&#39;évaluation des thérapeutiques nouvelles potentielles pour le traitement du sarcome de Kaposi.

Facteurs de la cellule hôte jouent un rôle essentiel dans la création et l&#39;entretien du sarcome de Kaposi (SK). Nous présentons des méthodes pour identifier les facteurs de la cellule hôte modifiée en KSHV cellules infectées DMVEC, et dans le tissu tumoral KS. Gènes cellulaires altérés par le virus de se servir de cible potentielle (s) pour de nouveaux traitements.

L&#39;identification des gènes induite par une dysrégulation de Kaposi associé au sarcome de Herpesvirus (KSHV)

Actuellement, le SK est la tumeur maligne liée au VIH/SIDA la plus prédominante en Afrique australe et, par conséquent, dans le monde.1,2 Il se caractérise comme une pathologie angioproliférative...

L'objectif général de cette procédure est de démontrer le double marquage de tissu tumoral de sarcome de Kaposi par immunohistochimie pour des protéines virales et cellulaires hôtes. Cela est réalisé en exposant d'abord les antigènes par chaleur. La deuxième étape de la procédure consiste à appliquer un anticorps primaire conjugué à la biotine.La troisième étape de la procédure consiste à ajouter le conjugué enzymatique strep din. La dernière étape de la procédure consiste à ajouter le substrat de l'enzyme au tissu pour le développement de la couleur. En fin de compte, on peut obtenir des résultats montrant la localisation des protéines virales et cellulaires hôtes dans le tissu tumoral par coloration immunohistochimique.Cette méthode peut répondre à des questions clés dans le domaine de la pathologie, comme l'identification d'agents infectieux ainsi que de gènes cellulaires dysrégulés sur le même échantillon. Sous une hotte, placer jusqu'à huit lames chem eight contenant des sections de cinq micromètres de tissu fixé inclus en paraffine dans un bocal Coplin rempli de xylène. Incuber pendant 10 minutes pour déparaffiner et préparer les lames à une immunohistochimie doublement marquée.Réhydratez le tissu dans une série d'alcools à 100 %, 95 % et 70 % pendant cinq minutes chacun. Transférez les lames dans l'eau pendant au moins 10 minutes avant le démasquage des antigènes, également appelé récupération des antigènes pour le démasquage des antigènes. Plongez les lames dans un récipient en plastique contenant une solution fraîchement préparée à 95 degrés Celsius.Chauffer le tampon citrate 50 millimolaire dans un four à micro-ondes pour maintenir l'ébullition à 95 degrés Celsius pendant 15 minutes. Transférer immédiatement les lames dans un récipient coplanaire rempli d'eau distillée à température ambiante. Transférer les lames dans un bocal coplanaire propre rempli de solution d'extinction fraîchement préparée.Incuber à température ambiante pendant 30 minutes pour bloquer la peroxydase endogène. Laver trois fois à température ambiante avec du PBS 1X pendant cinq minutes par lavage. Retirer les lames du lavage au PBS et secouer l'excédent, puis recouvrir le tissu avec 200 microlitres de solution de blocage glacée et couvrir avec une bande de paraffine pour éviter le dessèchement.Placer les lames dans une chambre humidifiée et incuber à température ambiante pendant une heure. Retirer la bande de paraffine et éliminer l'excès de solution de blocage en secouant la lame, puis ajouter 50 à 100 microlitres d'anticorps primaire anti-Lana du VHSK, prélevé à froid sur glace, dilué dans la solution de blocage afin de recouvrir le tissu. Recouvrir le tissu avec une bande fraîche de paraffine et incuber dans la chambre humidifiée pendant une à deux heures.Lavez les lames trois fois dans du PBS 1X pendant cinq minutes. À chaque lavage, ajoutez 50 à 100 microlitres d'anticorps secondaire biotinylé dilué dans du PBS 1X, puis incubez dans une chambre humide à température ambiante pendant 30 à 45 minutes. Pendant l'incubation des lames, préparez la streptavidine conjuguée à la peroxydase.À l'aide du kit d'animation duet daco, ajouter 10 microlitres de solution A à un millilitre de PBS 1X dans un tube einor de 1,5 millilitre et vortexer pour homogénéiser. Ajouter 10 microlitres de solution B et vortexer à nouveau, puis incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Laver les lames dans du PBS 1X, 3 fois pendant cinq minutes pour chaque lavage.Comme précédemment, ajoutez 100 à 200 microlitres de streptavidine conjuguée à la peroxydase de raifort sur les lames. Incubez pendant 30 à 45 minutes à température ambiante dans une chambre humidifiée. Là encore, lavez les lames trois fois dans du X PBS pendant cinq minutes par lavage.Cinq minutes avant la fin du lavage, déposer un comprimé de DAB dans un tube conique de 50 millilitres contenant 20 millilitres de PBS 1X et 25 microlitres de peroxyde d'hydrogène à 3 %. Filtrer la solution de DAB à l’aide d’un filtre à seringue de 0,45 micromètre, en travaillant un porte-objet à la fois. Recouvrir le tissu d’un millilitre de solution de DAB sous éclairage en champ clair au microscope optique.Surveiller le développement de la coloration pour KSHV LANA dans les cellules infectées jusqu'à l'obtention du degré de coloration souhaité. Plonger les lames dans de l'eau distillée pendant cinq minutes afin d'arrêter la réaction en cas d'étiquetage double. Reprendre à l'étape du démasquage de l'antigène dans un tampon citrate à 95 degrés Celsius, comme décrit dans le texte accompagnant, puis effectuer la coloration.À l’aide de la même procédure, monter le tissu avec un milieu de montage Permount et recouvrir d’une lame couvre-objet. Il est souvent souhaitable d’envoyer de nombreux échantillons individuels inclus dans des blocs de paraffine afin qu’ils soient perforés et organisés en une matrice de tissus pour une analyse statistique ultérieure ici. Les cellules brunes positives pour la protéine cellulaire PCAM-1 (CD31), indiquées par une flèche grise, s’agglomèrent autour des vaisseaux sanguins.Des cellules rouges positives pour la protéine virale. Les cellules marquées par des flèches noires indiquent des cellules infectées par le virus d'herpès associé au sarcome de Kaposi. Voici une image à plus faible grossissement de cellules brunes positives pour la protéine cellulaire pcam.Un CD 31 indiqué par des flèches grises dans une région autour des vaisseaux sanguins. Les cellules rouges positives pour la protéine virale. Les cellules marquées d'une flèche noire et indiquant Lana sont infectées par le virus d'herpès associé au sarcome de Kaposi.Voici une biopsie de tissu tumoral de sarcome de Kaposi sur une matrice microstructurée de tissu tumoral, avec des cellules brunes positives pour la protéine virale. Lana indique les cellules infectées par l'herpèsvirus associé au sarcome de Kaposi et présentant une certaine formation de cellules fusiformes. Voici une autre biopsie de tissu tumoral de sarcome de Kaposi sur une matrice microstructurée de tissu tumoral, avec des cellules brunes positives pour la protéine virale.Lana indique les cellules infectées par le virus d'herpès associé au sarcome de Kaposi présentant un degré élevé de formation de cellules fusiformes. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer une immunohistochimie double marquage sur des tissus fixés dans du formol et inclus en paraffine. Lors de la réalisation de cette expérience, il est très important de surveiller le développement de la coloration au microscope et d'arrêter la réaction dans l'eau.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Nous décrivons un protocole pour identifier les rôles clés des molécules de l'hôte de signalisation dans la réplication lytique d'un virus de l'herpès modèle, gamma herpèsvirus 68 (γHV68). L'utilisation de lignées de souris génétiquement modifiées et des fibroblastes embryonnaires de γHV68 réplication lytique, le protocole permet à la fois la caractérisation phénotypique et moléculaire de l'interrogatoire interactions virus-hôte dans la réplication virale lytique.

Dissection hôte-virus interaction dans la réplication lytique d&#39;un virus de l&#39;herpès modèle

Procédé d'observation des molécules d'ADN dans des cellules vivantes individuelles est décrit. La technique est basée sur la liaison d'une protéine répresseur lac marqué par fluorescence à des sites de liaison d'ingénierie dans l'ADN d'intérêt. Ce procédé peut être adapté pour suivre plusieurs ADNs recombinants dans des cellules vivantes dans le temps.

Surveillance de la réplication plasmidique dans les cellules de mammifères en direct sur plusieurs générations par microscopie à fluorescence

Rétrovirus endogènes humains (HERV), qui occupent 8% du génome humain, conservent les capacités de codage rares mais une centaine de milliers de longues répétitions terminales (LTR). Une coutume Affymetrix microarray a été conçu pour identifier les individus expression du locus HERV et a été utilisé sur les tissus de cancer de la prostate comme une preuve de concept pour de futures études cliniques.

Identification à base de microréseaux de HERV individuelle Loci Expression: Demande de Découverte de biomarqueurs dans le cancer de la prostate

Nous décrivons un protocole pour mesurer la production de cytokine antivirale chez les souris infectées par un virus de l'herpès modèle murin gamma herpèsvirus 68 (γ HV68) qui est étroitement liée à associé au sarcome de virus de l'herpès de Kaposi humain (KSHV) et le virus d'Epstein-Barr (EBV). L'utilisation de souches de souris génétiquement modifiées et les fibroblastes embryonnaires de souris (MEF), nous avons évalué la production de cytokines antivirales la fois in vivo et ex vivo.

Dissection Innate Immune signalisation Evasion virale de la production de cytokines

Nous avons établi un protocole fluorescent in situ d'hybridation pour la détection dans un génome de virus de la persistance de l'ADN dans des coupes de tissus de modèles animaux. Ce protocole permet l'étude de processus de l'infection par co-détection du génome viral, de ses produits d'ARN, et les protéines virales ou cellulaires à l'intérieur des cellules individuelles.

Détection du génome et des transcriptions d&#39;un virus à ADN persistant dans neuronaux tissus par fluorescence In situ L&#39;hybridation combinée avec immunocoloration

Le sarcome de Kaposi (KS) est une tumeur induite par l’infection par l’herpèsvirus virus oncogènes de KS-8/herpesvirus humain (HHV-8/KSHV). Le modèle de culture de cellules endothéliales décrit ici est particulièrement bien adapté pour étudier les mécanismes par lesquels KSHV transforme les cellules hôtes.

Un modèle In Vitro pour étudier la Transformation cellulaire par Herpesvirus sarcome de Kaposi

Usines de transcriptionnelles virales sont des structures discrètes qui sont enrichis de RNA polymérase cellulaire II pour augmenter la transcription de gènes viraux durant la réactivation. Ici, on décrit une méthode pour localiser les sites de la retranscription activement chromatine virale dans un espace 3D nucléaire par une combinaison de l’hybridation d’immunofluorescence souillant et in situ de RNA.

Imagerie fonctionnelle des usines de Transcription virale à l’aide de la microscopie en Fluorescence 3D

Nous décrivons ici un protocole pour l’emploi des Arni criblage à haut débit pour découvrir des cibles de l’hôte qui peuvent être manipulés pour améliorer virales oncolytiques, traitement de virus rhabodvirus et Vaccine spécifiquement, mais il peut être facilement adaptée aux autres oncolytiques plates-formes de virus ou pour découvrir les gènes hôtes qui modulent la réplication du virus en général.

Genome-wide Arni dépistage pour identifier les facteurs de l’hôte qui modulent les Virus ONCOLYTIQUE thérapie

Nous décrivons un protocole utilisant l'hybridation in situ de fluorescence (FISH) pour visualiser les ARN herpèsvirs multiples dans les cellules humaines lytically infectées, en suspension ou adhérentes. Ce protocole comprend la quantification de la fluorescence produisant un rapport nucléocytoplasmique et peut être étendu pour la visualisation simultanée des protéines hôtes et virales avec immunofluorescence (IF).

Fluorescence quantitative In Situ Hybridization (FISH) et Immunofluorescence (IF) de produits génétiques spécifiques dans les cellules infectées par le KSHV

Ce protocole décrit un système in vitro permettant de modéliser l’infection lytique de novo de l’herpèsvirus associé au sarcome de Kaposi à l’aide de virions dérivés de BAC16. La méthode permet d’étudier la réplication et la dissémination virales précoces. La production de virus infectieux est quantifiée par des tests d’unités infectieuses basées sur la GFP et une PCR en temps réel des génomes viraux encapsidés.

Etablissement et quantification de l’infection lytique de novo par l’herpèsvirus associé au sarcome de Kaposi acellulaire

Découvrez l'immunohistochimie à double marquage pour identifier les protéines virales et cellulaires dans les tissus tumoraux du sarcome de Kaposi. Cette méthode permet de localiser les agents infectieux et les gènes cellulaires dysrégulés.

L'identification des gènes induite par une dysrégulation de Kaposi associé au sarcome de Herpesvirus (KSHV)

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