Name: Dans le protocole in situ pour Wings Nymphe papillon utilisant ribosondes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: Apprenez une technique d'hybridation in situ optimisée pour analyser l'expression génique dans les ailes de nymphes de Bicyclus anynana. Ce protocole fournit des lignes directrices pour adapter la méthode à d'autres espèces de lépidoptères.

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Nous tenons à remercier Jayne Selegue, Margaret Hollingsworth, Jin Berry, Ryo Futahashi, Najmus Sahar mahfouz, Aleksandar Popadic, Bob Reed, Roche support technique pour aider au dépannage de ce protocole. Nous remercions également Guillaume Piel pour des conseils sur le montage du film.

JOUR 1 <ol><li> Préparer les solutions suivantes: <ul><li> 10x PBS </li><li> 1x PBS </li><li> 1x PBT </li><li> ddH 2 O <ul><li> Ajouter DEPC pour un volume total de 0,1% et secouer vigoureusement solutions. </li><li> Autoclave. </li></ul></li><li> Fix paraformaldéhyde à 4% - à l&#39;aide de PBS-DEPC </li><li> Solution de protéinase K - Si un précipité apparaît, vortexer vigoureusement avant de retirer aliquote </li><li> Tampon d&#39;arrêt Digestion </li><li> Tampon de préhybridation </li><li> 50:50 PBT: tampon de préhybridation </li><li> Tampon d&#39;Hybridation <ul><li> Les solutions doivent être conservés sans RNase. Utilisez soit verrerie qui a été cuit (4 heures à 250 ° C) ou en plastique jetables. Pipettes sérologiques sont très utiles pour la confection des solutions </li></ul></li></ul></li><li> Disséquer les ailes du temps mis en scène les pupes dans le PBS </li><li> Déplacer des ailes directement à Fix Buffer dans des puits de 24 plaques de culture bien à température ambiante </li><li> Fixer les disques pendant 2 heures </li><li> Laver 5 x 5 minutes en PBT </li><li> Incuber ailes pendant 3 minutes dans la protéinase K solution </li><li> Rincer 2 x dans le tampon d&#39;arrêt Digestion </li><li> Laver 5 x 5 minutes en PBT </li><li> Lavez 2 x 5 minutes dans de 50:50 PBT: PHB </li><li> Lavez 1 x 10 minutes en PHB </li><li> Incuber dans PHB au moins 1 heure à 55 ° C. </li><li> Heat-dénaturent sonde ARN (20-50 ng par puits nécessaire) (80 ° C pendant 5 minutes) et ajouter à tampon d&#39;hybridation (100 pi par puits nécessaire) </li><li> Ajouter la sonde de puits et incuber 48 heures à 55 ° C </li></ol> JOUR 3 <ol><li> Lavez 4 x 5 minutes dans 55 ° C PHB </li><li> Incuber une nuit dans la PHB à 55 ° C </li></ol> JOUR 4 <ol><li> Préparer les solutions suivantes: <ul><li> Bloc tampon d&#39;anticorps </li></ul></li><li> Lavez 1 x 5 minutes dans de 50:50 PBT: PHB </li><li> Lavez 4 x 5 minutes en PBT </li><li> Ailes Incuber pendant 1 heure dans un tampon de bloc à 4 ° C </li><li> Incuber ailes dans une dilution 1:2000 d&#39;anticorps anti-DIG nuit à 4 ° C </li></ol> JOUR 5 <ol><li> Préparer les solutions suivantes: <ul><li> Tampon de détection </li></ul><ul><li> Solution de développement - (envelopper dans du papier) sensible à la lumière </li></ul></li><li> Laver 3 x 5 minutes en PBT à la température ambiante </li><li> Lavez 7 x 5 minutes dans de PBT </li><li> Rincer les ailes deux fois dans le tampon de détection </li><li> Développer des ailes dans 1 ml de solution de développement - le temps de développement doivent être surveillés à chaque fois - les temps de développement peuvent changer, même en utilisant les mêmes sondes et la solution de développement - généralement vérifier après 5-10 minutes et ensuite augmenter intervalles jusqu&#39;à la nuit. Plaque doit être enveloppé dans une feuille de prévenir l&#39;exposition de lumière quand il n&#39;est pas la vérification des échantillons. </li><li> Rincer à cinq reprises en tampon d&#39;arrêt de développement </li><li> Mont ailes. </li></ol>

<ol><li>Carroll, S. B., Gates, J., Keys, D. N., Paddock, S. W., Panganiban, G. E. F., Selegue, J. E., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+and+eyespot+determination+in+butterfly+wings%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pattern formation and eyespot determination in butterfly wings.</a> Science. 265, 109-114 (1994).</li>
<li>Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solubilization+in+formamide+protects+RNA+from+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Solubilization in formamide protects RNA from degradation.</a> Nucleic Acids Research. 20, 3791-3792 (1992).</li>
<li>Keys, D. N., Lewis, D. L., Selegue, J. E., Pearson, B. J., Goodrich, L. V., Johnson, R. J., Gates, J., Scott, M. P., Carroll, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+a+hedgehog+regulatory+circuit+in+butterfly+eyespot+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Recruitment of a hedgehog regulatory circuit in butterfly eyespot evolution.</a> Science. 283, 532-534 (1999).</li>
<li>Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+line+transformation+of+the+butterfly+Bicyclus+anynana%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+R+Soc+Lond+B+%28Suppl%29%22%5BJournal%5D)">Germ line transformation of the butterfly Bicyclus anynana.</a> Proc R Soc Lond B (Suppl). 271, S263-S265 (2004).</li>
<li>Monteiro, A., Glaser, G., Stockslagger, S., Glansdorp, N., Ramos, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+insights+into+questions+of+lepidopteran+wing+pattern+homology%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparative insights into questions of lepidopteran wing pattern homology.</a> BMC Developmental Biology. 6, 52(2006).</li>
<li>Ramos, D. M., Kamal, F., Wimmer, E. A., Cartwright, A. N., Monteiro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+spatial+control+of+transgene+expresson+using+laser+induction+of+the+hsp70+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Temporal and spatial control of transgene expresson using laser induction of the hsp70 promoter.</a> BMC Developmental Biology. 6, 55(2006).</li>
<li>Weatherbee, S. D., Nijhout, H. F., Grunert, L. W., Halder, G., Galant, R., Selegue, J., Carroll, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrabithorax+function+in+butterfly+wings+and+the+evolution+of+insect+wing+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Ultrabithorax function in butterfly wings and the evolution of insect wing patterns.</a> 9, 109-115 (1999).</li>
</ol>

Optimisation des protocoles existants Hybridations in situ sur des disques de l&#39;aile des larves ont été réalisées avec succès en utilisant des disques à partir des papillons coenia Précis (Carroll et al, 1994;. Keys et al, 1999;. Weatherbee et al 1999).. Le protocole actuel a été adapté à partir d&#39;un protocole écrit détaillé disponible sur demande auprès du laboratoire Carroll pour colorations aile larvaire. Les changements que nous a fait servir à tenir compte des différences entre les tissus des larves et des nymphes d&#39...

<table><tbody><tr><td>Bain de fixation</td><td></td><td></td><td></td><td>4 % de paraformaldéhyde dans du PBS</td></tr><tr><td>PBT</td><td></td><td></td><td></td><td>0,1 % de Tween 20 dans du PBS</td></tr><tr><td>Solution de protéinase K</td><td></td><td></td><td></td><td>2,5&amp;#109;g/ml de protéinase K dans du PBT</td></tr><tr><td>Bain d'arrêt de la digestion</td><td></td><td></td><td></td><td>2 mg/ml de glycine dans du PBT</td></tr><tr><td>Bain de pré-hybridation</td><td></td><td></td><td></td><td>Pour 50 ml de PHB : 12 ml d’eau traitée au DEPC + 25 ml de formamide + 12,5 ml de SSC 20 x + 50 µl de Tween 20 + 500 µl de sperme de saumon à 10 mg/ml (sans RNase, dénaturé par la chaleur avant ajout à la solution).</td></tr><tr><td>Bain d'hybridation</td><td></td><td></td><td></td><td>Ajouter 1 mg/ml de glycogène au bain de pré-hybridation</td></tr><tr><td>Bain de blocage</td><td></td><td></td><td></td><td>50 mM Tris pH 6,8, 150 mM NaCl, 0,5 % d'IGEPAL (NP40), 5 mg/ml de BSA</td></tr><tr><td>Anti-DIG</td><td>Ac</td><td>Roche Group</td><td>11 093 274 910</td><td>Conjugué à la phosphatase alcaline</td></tr><tr><td>Kit de lavage et de blocage anti-DIG</td><td></td><td>Roche Group</td><td>11 585 762 001</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de montage aqueux Crystal Mount</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0612</td><td>Milieu de montage</td></tr></tbody></table>

dans le protocole in situ pour wings nymphe papillon utilisant ribosondes

In situ Protocol for Butterfly Pupal Wings Using Riboprobes

Nous présentons ici, en format vidéo, un protocole pour les hybridations in situ dans les ailes des pupes de l&#39;anynana papillon Bicyclus utilisant ribosondes. Hybridations in situ, un pilier de la biologie du développement, sont utiles pour étudier la répartition spatiale et temporelle de l&#39;expression des gènes dans le développement de tissus au niveau de la transcription. Si des anticorps qui ciblent les produits de protéine de transcription des gènes n&#39;ont pas encore été développée, et / ou il ya de multiples copies du gène d&#39;une protéine particulière dans le génome qui ne peuvent pas être différenciés en utilisant des anticorps disponibles, situs peut être utilisé à la place. Alors une technique in situ pour les disques ailes larvaires ont été offerts à la communauté papillon pour plusieurs années, le protocole actuel a été optimisé pour les ailes plus grandes et plus fragiles chrysalide.

Afin d&#39;examiner l&#39;expression des gènes dans les tissus des pupes de l&#39;aile Bicyclus anynana, nous présentons un protocole optimisé pour les hybridations in situ en utilisant des ribosondes. Nous fournissons aussi des directives pour l&#39;optimisation de ce protocole pour l&#39;utilisation dans les ailes des pupes de espèces de lépidoptères autres.

Dans le protocole in situ pour Wings Nymphe papillon utilisant ribosondes

Nous présentons ici, sous forme de vidéo, un protocole d'hybridations in situ dans les ailes nymphales du papillon Bicyclus anynana à l'aide de sondes ARN (ribosondes). L'hybridation in situ...

Il s'agit d'un protocole ceto pour les ailes de papillon au stade de nymphe. Nous commençons donc par collecter les pré-nymphes dans la cage, les placer sur un plateau, puis photographier leurs temps exacts de PPU (pré-pupation) à l'aide d'une photographie en accéléré. Cela nous permet d'effectuer les colorations à des moments précis suivant la nymphose.Ceci est important car différents ARNm pour différentes protéines sont exprimés à des moments différents après la fécondation. Ici, nous disséquons les ailes de l'imaginal dans une boîte de Pétri avec une base en silicone, et la partie importante consiste à retirer les ailes et à les placer dans la solution de fixation afin qu'elles soient bien plates. Si elles ne sont pas plates à ce stade, elles ne le deviendront jamais à nouveau.Après un temps de fixation approprié, nous éliminons le tampon fixateur et effectuons cinq lavages. L'étape de protéinase K avec le PBT est assez critique, car elle permet de permeabiliser les tissus afin que la sonde puisse y pénétrer ; elle doit donc être interrompue au moment opportun grâce à ces rinçages et lavages. Le sperme de saumon agit comme une source peu coûteuse d'ADN pour empêcher la sonde de se lier de façon non spécifique à tous les endroits.Le sperme est l'un des composants du tampon de pré-hybridation. Ici, nous ajoutons donc le sperme au tampon de pré-hybridation, puis nous préparons une solution constituée à parts égales de PBT et de tampon de pré-hybridation, soit un mélange 1:50:50 P-B-T-P-H-B. Cette solution sert de solution intermédiaire pour transférer délicatement les ailes depuis la solution de PBT, dans laquelle elles sont immergées, vers la solution de pré-hybridation.Il existe donc une étape intermédiaire durant laquelle les ailes vont d'abord être placées dans cette solution à 50 50. Ici, les ailes sont incubées dans du PHP pendant 10 minutes, puis à nouveau dans du PHP pendant une heure à 55 degrés. Entre-temps, nous allons préparer le tampon d'hybridation, qui correspond simplement au tampon de pré-hybridation mélangé avec du glycogène.Ici, nous ajoutons du glycogène au PHV afin de préparer une petite quantité de tampon d'hybridation. À ce tampon, nous allons ajouter la sonde dénaturée. Nous chauffons donc un bloc chauffant et nous centrifugeons brièvement la sonde conservée à moins 20 degrés, puis nous transférons la quantité appropriée de sonde dans un tube pour la dénaturer à 80 degrés pendant environ cinq minutes. Ici, nous dénaturons deux sondes simultanément ; ainsi, nous ajoutons du tampon d'hybridation à la sonde, puis nous ajoutons cent microlitres du mélange de sonde dans chaque puits.Pour finaliser cette étape, nous allons simplement recouvrir tous les puits de perfil, car les ailes seront incubées pendant les deux prochains jours à 55 degrés, et le parfum empêche l'évaporation. Après deux jours d'incubation, la sonde est éliminée en lavant les ailes avec du PHP, et le dernier lavage reste sur les ailes pendant encore 12 à 24 heures. Enfin, les ailes sont lavées selon une série d'étapes afin de les ramener en solution PBT. Là encore, en utilisant la solution mixte 50 50 entre chaque étape.À ce stade, la solution de blocage par les anticorps est ajoutée aux ailes et l'anticorps anti-digoxigénine conjugué à la phosphatase alcaline est ajouté au PBT afin d'obtenir une concentration d'environ un à 2000. Environ 300 microlitres de cette solution d'anticorps seront ajoutés à chaque puits, puis les ailes seront placées au réfrigérateur pour une incubation avec l'anticorps toute la nuit. Le jour suivant, l'anticorps est éliminé par une série de lavages avec le PBT, puis les ailes seront rincées deux fois dans le tampon de détection à température ambiante.Enfin, un millilitre de solution de développement est ajouté à chaque puits et les ailes sont rapidement recouvertes de papier d’aluminium. Après environ 10 minutes, nous vérifions : les ailes commencent à prendre une teinte violette, mais elles sont encore un peu claires. Elles sont donc à nouveau recouvertes, puis nous vérifions de nouveau quelques minutes plus tard et constatons qu’elles ont légèrement foncé.Remarquez que les ailes incubées dans différents sondes semblaient s'assombrir à des taux légèrement différents, nous avons donc décidé de les recouvrir à nouveau, et finalement, 20 minutes plus tard, nous avons décidé d'arrêter la réaction avec le tampon d'arrêt de développement. Les ailes sont maintenant prêtes à être montées sur une lame, nous ajoutons donc une petite goutte de milieu de montage sur une lame étiquetée et déplaçons les ailes sur la lame en les prenant simplement avec des pinces et en les posant sur la goutte. Éliminez toute bulle d'air, redressez délicatement l'aile et recouvrez-la d'une lamelle.Dans cette expérience, nous utilisons la sonde qui cible les transcrits du gène grail, et nous les observons localisés au centre du futur motif IPO du papillon chez Cyclasis anana durant les premiers stades du développement de l'aile pupale.

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Biologie

Utilisation Mont entier<em&gt; In situ</emHybridation&gt; Lien vers biologie moléculaire et Organismal

Whole mont In Situ</emHybridation> de E8.5 à E11.5 embryons de souris

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L’embryon de Xenopus laevis continue d’être exceptionnellement utile dans l’étude du développement précoce en raison de sa grande taille et de sa facilité de manipulation.   Un protocole simplifié pour l’hybridation in situ de l’ensemble du mont est fourni qui peut être utilisé dans l’identification d’organes spécifiques dans ce système modèle.

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Multi-cible chromogénique totalité montage<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation pour la comparaison des gènes domaines d&#39;expression dans<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryons

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