Étiquetage DiOLISTIC des neurones à partir de rongeurs et non-humains tranches de cerveau des primates

Nous démontrons l'utilisation du pistolet à gènes à introduire des colorants fluorescents, tels que DII, en neurones dans des tranches de cerveau de rongeurs et des primates non humains d'âges différents. Dans ce cas particulier, nous utilisons des souris adultes (3-6 mois) et adultes singes cynomologus (9-15 ans). Cette technique, décrite initialement par le laboratoire du Dr Lichtman (Gan

Je m’appelle Gail Siebel et je suis boursière postdoctorale dans le laboratoire du Dr Veronica Alvarez à l’Institut national sur l’abus d’alcool et l’alcoolisme. Ce travail a été réalisé en collaboration avec le Dr Kathleen Grant et Andrew Wow de l’Oregon Primate Center et le Dr James Dene de l’Université Wake Forest, qui ont fourni le tissu de primate non humain utilisé dans cette étude. L’objectif de refonte de cette procédure est d’introduire des colorants fluorescents dans les neurones et d’étiqueter des sections cérébrales de différentes espèces telles que les rongeurs et les primates de tout âge.

Dans le but d’étudier la morphologie des dendrites et des épines dendritiques, cela est accompli en enduisant d’abord les T et les billes d’un colorant lipophile tel que l’œil D. La deuxième étape de la procédure consiste à tapisser le tube avec des perles recouvertes d’œil D et à le couper en petits morceaux qui servent de balles pour le système de pistolet à gènes Helios. La troisième étape de la procédure consiste à tirer des perles recouvertes d’un œil D dans des tranches de cerveau à l’aide du pistolet à gènes.

La dernière étape de la procédure est facultative car la stylistique peut être combinée à l’immuno-coloration pour localiser simultanément d’autres marqueurs. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent un marquage fluorescent clairsemé de neurones adaptés à l’imagerie à haute résolution, comme la microscopie confocale ou la microscopie à deux photons, et l’étude de la ramification dendritique et de la morphologie de la colonne vertébrale dendritique. Le principal avantage de cette technique par rapport à nos méthodes existantes est que la stylistique peut être appliquée à des sections de cerveau d’animaux de toutes espèces, âges et génotypes.

Il peut être utilisé en combinaison avec l’immunocoloration et produit un marquage fluorescent clairsemé qui convient à la microscopie à haute résolution avant de fabriquer des balles. Enduisez des billes de tungstène d’un colorant lipophile dans une hotte chimique à raison de 450 millilitres de chlorure de méthylène pour 13,5 milligrammes de colorant lipophile pour une concentration finale de 30 milligrammes par millilitre. Prenez un tube pré Eloqua contenant 300 milligrammes de billes de tungstène et ajoutez 300 microlitres de chlorure de méthylène, pipez-le vigoureusement pour remettre les billes en suspension et obtenir une solution homogène.

Seulement 100 milligrammes de billes de tungstène sont utilisés par ensemble de balles, en pipetant de haut en bas pour maintenir les billes en suspension, ajoutez 100 millilitres de billes et l’œil de la matrice dissoute sur une lame de verre et mélangez-les soigneusement. À l’aide d’une pointe de pipette, laissez sécher complètement à l’air libre jusqu’à ce que les billes deviennent gris clair. Placez un morceau de papier blanc ciré propre sous la diapositive à l’aide d’une lame de course propre Pour chaque couleur de balles, grattez les perles du verre, faites-les glisser et coupez-les en dés en une poudre fine.

Grattez les perles enrobées sur du papier de lactosérum et entonnez-les dans un tube conique de 15 millilitres. Ajoutez trois millilitres d’eau et faites du sonicate au bain-marie pendant 10 à 30 minutes à température ambiante pour bien perturber les grumeaux. Coupez 0,7 mètre de tube sarcelle avec un angle à une extrémité et connectez l’autre extrémité à une seringue de 12 millilitres à l’aide d’un adaptateur de tube, placez l’extrémité libre dans un tube contenant 10 millilitres d’une solution de polyvinyle ou de PVP de 10 milligrammes par millilitre, et aspirez la solution complètement à travers le tube et dans la seringue.

Vortex la solution de billes pendant le pompage avec la seringue pour faire un mélange homogène en travaillant rapidement pour éviter la précipitation des billes, aspirez complètement la solution dans le tube. Évitez d’introduire des bulles d’air, ce qui empêcherait les billes de se fixer au tube à cet endroit tout en maintenant le tube tendu des deux extrémités. Inclinez-le d’un côté à l’autre pour obtenir des instructions uniformes.

Répartissez les perles. Introduisez le tube dans la station de préparation et laissez les billes se déposer pendant 30 à 60 secondes. Utilisez la seringue pour lentement mais en douceur.

Retirez l’eau en laissant les perles derrière. Débranchez immédiatement la seringue et commencez à faire tourner le tube. Ajustez le débit d’azote sur la station de préparation à quatre à cinq LPM secs pendant 10 à 20 minutes jusqu’à ce que les gouttelettes d’eau ne soient plus visibles.

Retirez le tube de la station de préparation, coupez les balles en longueurs de 13 millimètres avec le coupe-tube observé et sur les bonnes balles, une légère brume grise recouvre uniformément l’intérieur. Placez les balles dans des flacons à scintillation enveloppés d’aluminium contenant un agent de séchage tel que du sulfate de calcium anhydre. Conservez-le à température ambiante jusqu’au moment de tirer.

Le marquage diique peut être utilisé pour colorer des neurones dans des tissus cérébraux de diverses espèces et âges et conservés à l’aide de diverses méthodes. Placez des tranches de cerveau qui ont été fixées avant ou après le tranchage dans les puits d’un 24. Assiette de puits.

Lavez les tranches dans un XPB S3 plusieurs fois pendant cinq à 10 minutes par lavage. Pipetez le PBS à l’aide d’un pinceau pour centrer la tranche dans le puits. Placez un morceau de filtre de 3,0 micromètres entre les deux écrans de diffusion métalliques à l’extrémité de la doublure du canon du pistolet à gènes.

Tenez le pistolet à gènes de manière à ce que l’extrémité de la doublure du canon soit à 1,5 centimètre de l’échantillon. Tirez les billes dans la tranche avec une pression d’hélium gazeux de 120 à 180 PSI. Rincez rapidement les tranches trois fois avec un XPBS pour éliminer le colorant supplémentaire.

Assurez-vous de garder la surface de la tranche tournée vers le haut pendant toutes les étapes de manipulation des liquides. Conservez les tranches dans du PBS pendant trois à six heures pour permettre au DAI de se répandre le long des dendrites, recouvertes d’une feuille d’aluminium. Comme dai est sensible à la lumière, les tranches peuvent être montées à ce stade ou soumises à une coloration supplémentaire avec des anticorps comme détaillé dans la section suivante pour procéder à la coloration à 300 à 500 microlitres de solution de perméation contenant 0,01 % de TRITTON X 100 dans un XPBS à chaque tranche, incuber à température ambiante pendant exactement 15 minutes.

Retirez la solution de perméation des puits, bloquez les tranches dans une solution contenant 10 % de sérum de chèvre et 0,01 % de tritan X 100 dans un XPBS, incubez à température ambiante pendant 30 minutes. Ajoutez 300 à 500 microlitres d’anticorps primaires dilués dans une solution bloquante à chacun. Bien incuber à température ambiante pendant une à deux heures ou toute la nuit, selon l’anticorps, laver les tranches trois fois avec un XPBS pendant cinq à 15 minutes à chaque lavage, retirer la solution du puits.

Ajoutez 300 à 500 microlitres d’anticorps secondaires dilués dans une solution bloquante à chacun. Lavez bien quatre fois avec un XPBS pendant cinq à 15 minutes à chaque lavage comme auparavant, montez les tranches sur une lame de verre avec un support de montage fluorescent et couvrez avec un 18 x 18 millimètres. Laisser sécher pendant six à 12 heures à température ambiante avant de sceller les bords avec du vernis à ongles transparent stocké dans l’obscurité ou recouvert à quatre degrés Celsius.

Des images exemplaires de coupes cérébrales étiquetées sont présentées ici. Deux caractéristiques importantes à rechercher sont un modèle de marquage clairsemé à faible grossissement et la capacité d’identifier les composants cellulaires individuels. Une mauvaise préparation des balles ou une fixation excessive du tissu peut entraîner un mauvais étiquetage, comme illustré ici.

Des conseils de dépannage sont fournis dans le texte ici. Il existe une image confocale d’un neurone spin du milieu TAL du cerveau de la souris et son motif complexe de ramification dendritique. La coupe optique obtenue lors de l’utilisation de la microscopie confocale permet d’isoler des cellules marquées uniques dans la coupe de tissu.

Les images à fort grossissement montrent des segments de dendrites provenant d’un cerveau de rongeur et d’un cerveau de primate non humain. Notez la haute intensité de coloration fluorescente obtenue avec cette technique résultant en des épines dendritiques bien définies lors de la combinaison de l’ICS avec l’immuno-marquage. Cette image montre un exemple de colocalisation du marquage de l’œil D en rouge avec l’immunocoloration pour l’expression de la GFP en vert.

Cette image correspond à une tranche de sal d’une souris transgénique exprimant la protéine fluorescente GFP sous le promoteur du récepteur de la dopamine D. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer les balles et d’utiliser le pistolet Jing pour les neurones peu sensibles avec des colorants fluorescents. Cette technique permet de visualiser clairement la morphologie neuronale et d’étudier les ramifications et les épines.