Étiquetage DiOLISTIC des neurones à partir de rongeurs et non-humains tranches de cerveau des primates

Je m'appelle Gail Siebel et je suis chercheuse postdoctorale dans le laboratoire de la Dre Veronica Alvarez à l'Institut national sur l'abus et l'alcoolisme. Ce travail a été réalisé en collaboration avec le Dr Kathleen Grant et Andrew Wow du Centre des primates de l'Oregon, ainsi qu'avec le Dr James Dene de l'Université Wake Forest, qui ont fourni les tissus de primates non humains utilisés dans cette étude. L'objectif principal de cette procédure est d'introduire des colorants fluorescents dans les neurones et de marquer des sections cérébrales provenant d'espèces différentes, telles que des rongeurs et des primates de tout âge.

En vue d'étudier la morphologie des dendrites et des épines dendritiques, cette méthode consiste d'abord à recouvrir les Ts et les billes d'un colorant lipophile tel que D eye. La deuxième étape du protocole consiste à garnir un tube de billes recouvertes de D eye, puis à le découper en petits morceaux servant de projectiles pour le système de canon à gènes Helios. La troisième étape du protocole consiste à tirer les billes recouvertes de D eye dans des tranches de cerveau à l'aide du canon à gènes.

La dernière étape de la procédure est facultative, car les stylistiques peuvent être combinées à une immunomarquage afin de localiser simultanément d'autres marqueurs. En fin de compte, on peut obtenir des résultats montrant une étiquetage fluorescent clairsemé des neurones, adapté à l'imagerie haute résolution, comme la microscopie confocale ou la microscopie à deux photons, ainsi qu'à l'étude du ramification dendritique et de la morphologie des épines dendritiques. Le principal avantage de cette technique par rapport à nos méthodes existantes est que les stylistiques peuvent être appliquées à des sections cérébrales provenant d'animaux de toutes espèces, âges et génotypes.

Il peut être utilisé en combinaison avec une immunomarquage et produit une étiquetage fluorescent clairsemé, adapté à la microscopie à haute résolution. Avant de préparer les microperles, recouvrir les billes de tungstène d'un colorant lipophile dans une hotte chimique, à raison de 450 millilitres de chlorure de méthylène pour 13,5 milligrammes de colorant lipophile, afin d'obtenir une concentration finale de 30 milligrammes par millilitre. Prendre un tube pré-éloqué contenant 300 milligrammes de billes de tungstène et ajouter 300 microlitres de chlorure de méthylène ; agiter vigoureusement pour resuspendre les billes et obtenir une solution homogène.

Seulement 100 milligrammes de billes de tungstène sont utilisés par ensemble de balles ; pipetez de haut en bas pour maintenir les billes en suspension, ajoutez 100 millilitres des billes et du colorant dissous sur une lame de verre et mélangez-les soigneusement. À l’aide d’une pointe de pipette, laissez sécher complètement à l’air jusqu’à ce que les billes deviennent gris clair. Placez un morceau propre de papier blanc ciré sous la lame, puis, à l’aide d’une lame de rasoir propre, pour chaque couleur de balles, grattez les billes de la lame de verre et broyez-les en une fine poudre.

Gratter les billes revêtues sur du papier filtre et les verser dans un tube conique de 15 millilitres. Ajouter trois millilitres d'eau et soniquer au bain ultrasons pendant 10 à 30 minutes à température ambiante afin de rompre complètement tous les agrégats. Couper 0,7 mètre de tube turquoise avec une extrémité inclinée et relier l'autre extrémité à une seringue de 12 millilitres à l'aide d'un raccord pour tube, placer l'extrémité libre dans un tube contenant 10 millilitres d'une solution de polyvinylpéroné ou PVP à 10 milligrammes par millilitre, puis aspirer entièrement la solution à travers le tube et dans la seringue.

Vortexez la solution de billes tout en pompant avec la seringue pour obtenir un mélange homogène, en travaillant rapidement afin d'éviter la précipitation des billes. Aspirez complètement la solution dans le tube. Évitez d'introduire des bulles d'air, car elles empêcheraient les billes de s'attacher au tube à cet endroit, tout en tenant le tube tendu par les deux extrémités. Inclinez-le d'un côté à l'autre pour répartir uniformément.

Répartir les billes. Introduire le tube dans la station de préparation et laisser les billes se déposer pendant 30 à 60 secondes. Utiliser la seringue lentement mais régulièrement.

Retirer l'eau en laissant les billes. Déconnecter immédiatement la seringue et commencer à faire tourner le tube. Régler le débit d'azote sur la station de préparation à quatre à cinq LPM sec pendant 10 à 20 minutes, jusqu'à ce que les gouttelettes d'eau ne soient plus visibles.

Retirer le tube du poste de préparation, couper des balles en morceaux de 13 millimètres de longueur à l’aide du coupe-tube observé ; sur de bonnes balles, une légère pellicule grise recouvre uniformément l’intérieur. Placer les balles dans des vials scintillants enveloppés de papier d’aluminium et contenant un agent desséchant tel que du sulfate de calcium anhydre. Conserver à température ambiante jusqu’au moment du tir.

L'étiquetage Diic peut être utilisé pour colorer les neurones dans des tissus cérébraux provenant d'espèces et d'âges variés, et conservés selon différentes méthodes. Placer les tranches de cerveau, fixées soit avant soit après découpage, dans les puits d'une plaque de 24 puits.

Lavez les tranches dans un XPB S3 trois fois, pendant cinq à dix minutes par lavage. Éliminez le PBS à la pipette et utilisez un pinceau pour centrer la tranche dans le puits. Placez un morceau de filtre de 3,0 micromètre entre les deux écrans métalliques de diffusion à l’extrémité du revêtement de canon à gènes.

Tenez le canon à gènes de manière à ce que l'extrémité du revêtement du canon soit à 1,5 centimètre du spécimen. Projetez les billes dans la tranche avec une pression de gaz d'hélium comprise entre 120 et 180 PSI. Rincez rapidement les tranches trois fois avec un X PBS afin d'éliminer l'excès de colorant.

Veillez à maintenir la surface coupée de la tranche orientée vers le haut pendant toutes les étapes de manipulation des liquides. Conservez les tranches dans du PBS pendant trois à six heures afin de permettre au DAI de se répandre le long des dendrites ; couvrez d’un film opaque. Étant donné que le DAI est sensible à la lumière, les tranches peuvent être montées à ce stade ou subir une coloration supplémentaire par anticorps, comme décrit dans la section suivante, pour poursuivre la coloration avec 300 à 500 microlitres de solution de perméabilisation contenant 0,01 % de TRITON X-100 dans du PBS 1× par tranche, puis incubez exactement 15 minutes à température ambiante.

Retirer la solution de perméabilisation des puits. Bloquer les tranches dans une solution contenant 10 % de sérum de chèvre et 0,01 % de Triton X-100 dans du PBS 1X, puis incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Ajouter de 300 à 500 microlitres d'anticorps primaire dilué dans la solution de blocage à chaque puits. Incuber à température ambiante pendant une à deux heures ou toute la nuit, selon l'anticorps. Laver les tranches trois fois avec du PBS 1X, pendant cinq à quinze minutes par lavage. Retirer la solution du puits après chaque étape.

Ajouter de 300 à 500 microlitres d'anticorps secondaire dilué dans la solution de blocage à chaque puits. Laver quatre fois avec du XPBS 1× pendant cinq à quinze minutes par lavage, comme précédemment. Monter les tranches sur une lame de verre à l’aide d’un milieu de montage fluorescent et recouvrir d’un coverslip de 18 × 18 millimètres. Laisser sécher de six à douze heures à température ambiante avant de sceller les bords avec du vernis incolore, puis conserver à l’abri de la lumière ou recouvert à quatre degrés Celsius.

Des images exemplaires de sections cérébrales marquées sont présentées ici. Deux caractéristiques importantes à rechercher sont un motif de marquage clairsemé à faible grossissement et la capacité d'identifier des composants cellulaires individuels. Une préparation incorrecte des projectiles ou une sur-fixation du tissu peuvent entraîner un mauvais marquage, comme illustré ici.

Des conseils de dépannage sont fournis dans le texte ci-dessous. On observe une image en microscopie confocale d’un neurone épineux de taille moyenne du TAL provenant du cerveau de souris, montrant son motif complexe de ramification dendritique. Le sectionnement optique obtenu grâce à la microscopie confocale permet d’isoler des cellules uniques marquées dans la coupe de tissu.

Les images à fort grossissement montrent des segments de dendrites provenant d’un cerveau de rongeur et d’un cerveau de primate non humain. Remarquez l’intensité élevée de la coloration fluorescente obtenue avec cette technique, permettant d’obtenir des épines dendritiques bien définies lorsqu’on combine la SIC avec une immunomarquage. Cette image illustre un exemple de colocalisation de l’étiquetage D eye en rouge avec un immunomarquage de l’expression de la GFP en vert.

Cette image correspond à une coupe de sal provenant d'une souris transgénique exprimant la protéine fluorescente GFP sous le promoteur du récepteur D1 de la dopamine. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment préparer les pastilles et utiliser le pistolet Jing pour marquer de façon éparse des neurones avec des colorants fluorescents. Cette technique permet une visualisation claire de la morphologie neuronale ainsi que l'étude du branchement dendritique et des épines dendritiques.