Name: Imagerie différentielle des structures biologiques avec doublement résonnante anti-Stokes cohérente diffusion Raman (CARS) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 56 s
Description: Découvrez l'imagerie différentielle par diffusion Raman cohérente anti-Stokes doublement résonnante pour visualiser les structures biologiques avec une sensibilité améliorée. Cette méthode utilise trois lasers synchronisés.

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Nous tenons à remercier Iwan Schie et Sebastian Wachsmann-Hogiu pour leurs contributions dans le développement de la technique DR-CARS. Semaines Tyler reconnaît le soutien du Programme Scholar Laurent de Lawrence Livermore National Laboratory. Thomas Huser est reconnaissante pour le soutien de l&#39;American Heart Association à travers le programme Grant-in-Aid. Ce travail a également été soutenu en partie par un financement de la National Science Foundation. Le Centre pour la biophotonique, une science et de la NSF Technology Center, est géré par l&#39;Université de Californie, Davis, sous l&#39;accord de coopération n ° 0120999 PHY. Un soutien est également reconnu par le Centre UCD clinique Science Translational sous le numéro de subvention UL1 RR024146 du National Center for Research Resources (NCRR).

1. Génération de voitures et DR-CARS Signaux Afin de générer CARS et DR-CARS signaux simultanément, trois accordables et synchronisée courte sources laser pulsé sont nécessaires. <ol><li> Pour obtenir trois impulsions synchronisées nous commençons avec un seul laser de 10 W (PicoTrain, HighQ laser, Inc.) Ce laser a une longueur d'onde fixe de 1064 nm, une longueur d'impulsion fixe de 7 ps, et un taux de répétition fixe de 76 MHz. </li><li> En utilisant une série de lames demi-ondes et de polarisation du faisceau splitter cubes le faisceau est divisé en trois parties. Une lame demi-onde combiné avec un cube séparateur de faisceau polarisant permet d'ajuster la quantité d'énergie dans chaque composante de la poutre sans changer sa direction. Généralement, deux faisceaux sont ajustés à ~ 4,5 W chacun, et le faisceau troisième contient le solde de 1 W. </li><li> Les deux faisceaux de forte puissance sont ensuite dirigés en deux indépendantes oscillateurs paramétriques optiques (OPO est, Avante, APE GmbH, Berlin, Allemagne). OPO génération de différence de fréquence utilisez pour convertir un photon d'énergie plus élevée en deux photons d'énergie inférieure avec différentes longueurs d'onde. En contrôlant la température du cristal utilisé pour obtenir cet effet, les longueurs d'onde des photons qui en résulte peut être contrôlée à 0,1 nm. Par doublage de fréquence de ces signaux, un laser avec une longueur d'onde fixe de 1064 nm peut maintenant être transformé en un faisceau laser qui peut être réglée n'importe où entre 780 nm à 910 nm. En pompant deux séparés OPO avec les mêmes sources 1064 nm, on obtient deux sources lasers accordables indépendamment qui sont synchronisées automatiquement à notre laser de pompe d'origine. </li><li> La troisième (la puissance la plus basse) du faisceau du laser 1064 nm pompe est dirigé vers l'OPO est une combinaison de miroirs dichroïques afin que tous trois faisceaux (2 de l'OPO, 1 du laser de pompe) peuvent être recombinées tard. Afin de produire efficacement des photons signal Raman cohérente des impulsions recombinés doivent se chevaucher à la fois temporellement et spatialement. Parce OPO contiennent des cavités anneau, permettant à chaque impulsion laser de passer à travers les temps multiples de cristal, les poutres envoyé par le voyage de l'OPO est une distance supplémentaire qui entraîne un retard considérable par rapport au faisceau pompe d'origine. Cette distance doit être compensée avec la troisième poutre en introduisant des miroirs supplémentaires que la force de cette poutre pour parcourir la même distance que les deux autres avant qu'ils ne se recombinent en utilisant des miroirs dichroïques. </li><li> Afin de fournir un réglage fin de la longueur du chemin de chaque faisceau parcourt les étapes retard réglable, en utilisant rétroréflecteurs prisme, sont introduits dans chaque trajet du faisceau. </li><li> Un autre ensemble de lames demi-ondes et de polarisation du faisceau cubes splitter sont ajoutés à chaque faisceau pour nous permettre de régler la puissance de chaque faisceau de façon indépendante, sans affecter l'entrée de l'OPO est. </li><li> Miroirs dichroïques sont utilisés d'abord combiner les faisceaux issus de deux OPO et ensuite avec le faisceau de 1064 nm. Des précautions doivent être prises pour s'assurer que les poutres sont précisément chevauchent (c'est à dire qu'ils sont colinéaires et ont des divergences similaires). Ceci peut être vérifié en comparant le chevauchement des faisceaux à proximité (quelques centimètres) et loin de (~ 1 m) le miroir dichroïque. </li><li> L'avantage d'utiliser des lasers pulsés, c'est que chaque impulsion peut avoir une énergie de pointe élevée à l'échantillon, permettant la génération efficace de signaux cohérents Raman, tout en conservant une intensité moyenne à faible. Une intensité moyenne élevée peut endommager l'échantillon. Par conséquent, afin de mieux contrôler l'intensité moyenne, sans sacrifier l'énergie de pointe, les trois faisceaux combinés sont envoyés à travers un modulateur électro-optique (cellule de Pockels, les ConOptics) fonctionne comme un sélecteur d'impulsion, ce qui nous permet d'ajuster le taux de répétition des impulsions qui arriver à notre échantillon, et donc l'intensité moyenne. </li><li> Les faisceaux laser combinées sont ensuite couplés dans un microscope inversé avec un objectif de haut de NA. L'objectif est généralement une lentille objectif 60 X de l'eau avec une ouverture numérique (NA) de 1,2 qui a été corrigé pour l'aberration chromatique sur l'ensemble des accordabilité de notre OPO et le faisceau de 1064 nm. Le serrés concentrant générée par la lentille de l'objectif de haute NA permet la génération la plus efficace de signaux cohérents Raman sur l'échelle du micron. </li><li> Les poutres sont combinées élargie afin de déborder l'arrière-port de l'objectif du microscope. Par débordement à l'arrière de l'objectif du microscope, nous pouvons obtenir les meilleures conditions concentrer et donc la meilleure résolution spatiale dans notre système de microscope. </li><li> L'objectif de notre microscope est monté sur un stade XYZ piézo qui nous permet d'obtenir des images par le faisceau balaye les poutres à travers l'échantillon, similaire à faisceau de balayage commerciales microscopes confocaux. </li></ol> 2. L'utilisation de trois courts lasers pulsés L'utilisation de trois résultats à court lasers pulsés dans la production de signaux de plusieurs voitures, à partir du c différentsombinations de deux lasers, ainsi que 3-Color CARS et DR-FWM signaux de la combinaison de ces trois lasers. <ol><li> Les longueurs d'onde des signaux peut mentir spectralement proches les uns des autres. Lorsque les signaux sont rapprochés il peut être difficile de les séparer pour analyse à l'aide fixée filtres passe-bande de longueur d'onde et des miroirs dichroïques. Pour cette raison, nos signaux sont transmis dans un spectromètre imageur (SpectraPro 2300i, Acton Research), qui sert aussi d'monochromateur efficace pour séparer spatialement les signaux de longueurs d'onde différentes. </li><li> Un miroir électronique actionné retourner dans le spectromètre en position basse envoie le signal à une rétro-éclairé profonde déplétion charge-coupled device (CCD) qui fournit des informations spectroscopiques sur toute la gamme du signal entier et nous permet d'identifier et d'optimiser la cohérence de divers signaux Raman. </li><li> Pour sélectionner le signal avec lequel nous souhaitons nous tourner simplement l'image de la grille dans le spectromètre, en utilisant le fournisseur dans le contrôle et le logiciel d'acquisition de données (WinSpec, Princeton Instruments), au centre du sommet de l'intérêt sur la caméra CCD et ensuite changer les position du miroir flip rediriger ce signal à un port deuxième sortie à laquelle une avalanche compter de photon unique photodiode (APD) a été attaché. </li><li> L'objectif est alors raster numérisée et les signaux enregistrés sur l'APD sont utilisés pour générer une image en affichant le taux de comptage de photons pour chaque pixel via le logiciel d'acquisition de données (SymPhoTime, Picoquant GmbH, Berlin, Allemagne). </li><li> Nous répétons cette procédure d'imagerie pour chaque signal désiré Raman cohérent qui nous permet de comparer les signaux pendant le post-traitement. </li></ol> 3. Préparation des échantillons Afin d'obtenir des images claires et reproductibles certaines précautions doivent être prises dans la préparation de l'échantillon. <ol><li> Les échantillons sont généralement préparés sur ~ 150 microns lamelles de verre épais. Ces lamelles sont suffisamment minces pour permettre l'imagerie haute résolution avec les objectifs NA 1.2 qui sont habituellement utilisés. </li><li> Piégeage optique d'objets diélectrique peut se produire lorsque la lumière du laser est diffractée par le biais de petits objets transparents. L'utilisation de très ciblé, puissance de crête élevée, courts faisceaux laser pulsé pouvez ensuite faire glisser de petites cellules ou de bactéries le long, résultant en des images floues ou tachées. Afin d'éviter cela, il peut être nécessaire pour immobiliser l'échantillon sur la surface de la lamelle de verre en appliquant d'abord une fine couche de poly-L-lysine par spin-coating. </li><li> Pour les cellules en culture plats en verre à fond la culture peut être utilisé pour l'imagerie qui permettent, sans avoir à décoller les cellules de leurs plats de culture de cellules de croissance. </li><li> Pour la démonstration dans cette contribution nous avons d'abord déposer un C. formaldéhyde fixes ver nématode elegans sur une lamelle de verre. </li><li> Puis ajoutez une goutte de 20 pl solution à 5 M de glucose deutéré au ver. La solution de glucose deutéré donne une signature de fond unique et solide Raman. </li></ol> 4. Analyse des échantillons Afin de bien profiter de l'effet de l'amélioration doublement résonnant les spectres Raman des deux substances Raman de résonance doit être connue. <ol><li> Une fois l'échantillon est préparé sur la lamelle, il est analysé à l'aide d'un microscope confocal Raman pour obtenir le spectre pertinentes spontanée Raman et d'identifier les pics appropriés. </li><li> Pour effectuer DR-CARS nous identifions les endroits spectrale du mode d'étirement CH, généralement associés à des lipides, et le mode d'étirement de CD, associée avec le glucose deutéré, à 2845 cm -1 et 2121 cm -1 respectivement. </li><li> Coherent Raman est atteint lorsque la différence de fréquence entre les deux lasers correspond à la fréquence d'une vibration moléculaire. En réglant une OPO à 817 nm on sondera les 2845 cm -1 en mode CH lorsqu'il est combiné avec le faisceau laser 1064 nm et en réglant l'OPO d'autres à 868 nm, elle permettra de sonder les 2121 cm -1 pointe lorsque combiné avec un faisceau de 1064 nm . </li><li> Par le faisceau balaye l'échantillon sur le microscope CARS nous pouvons maintenant observer trois signaux Raman cohérente d'intérêt. Un signal de sonder les VOITURES CH étirement vibration, une CARS signal de sonder la mode d'étirement de CD, et un signal DR-CARS sonder les deux. </li><li> Nous sélectionnons chaque pic comme décrit dans la section 2.3 et de prendre une image comme décrit ci-dessus. </li></ol> 5. Traitement d'images Extraction des informations supplémentaires sur ces trois images exige maintenant des traitements d'image assez simple. <ol><li> D'abord les images doivent être normalisés. Dans la théorie de la normalisation peut être réalisé en tenant compte de l'intensité de chaque laser impliquées dans chaque processus de génération de signal. En pratique, cependant cela ne fonctionne pas toujours, principalement en raison de la non-réponse spectral uniformedes miroirs dichroïques, des détecteurs, et des grilles. </li><li> Une méthode pratique pour la normalisation repose sur le fait que dans les régions où dominent les lipides purs du signal, la résonance de CD ne devrait pas contribuer à l'un des signaux. De même, dans les régions de la solution de glucose pur de la résonance CH ne devrait pas contribuer à l'un des signaux. Dans cet esprit, nous normalisons l'image DR-CARS et l'image CARS obtenue sur la résonance de CD de la solution de glucose deutéré à une région bien à l'extérieur de la C. elegans qui devrait présenter aucune résonance CH. </li><li> Puis nous identifions une région dans le ver à l'image de résonance CH-CARS qui est riche en lipides et la normaliser à la région correspondante dans le normalisée DR-CARS image. Pour cette méthode fonctionne correctement, nous supposons que profondément dans cette région pas de glucose deutéré est présent. Cette hypothèse est sûre puisque les lipides sont hydrophobes et ne se mélange pas avec la solution. </li><li> Maintenant, en soustrayant les normalisée CH-résonant d'image voitures de la normalisation DR-CARS l'image on se retrouve avec seulement le CD-amplifié de résonance du signal. </li><li> De même en soustrayant les normalisée CD-résonance image de voitures de la normalisation DR-FWM l'image on se retrouve avec juste le CH-résonant signal amplifié. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1: Schéma du système de microscopie DR-CARS comme décrit ci-dessus. <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2: image en lumière blanche d'un C. elegans dans une solution de glucose deutéré préparées sur une lamelle de verre et prêt pour l'imagerie. <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3:. Spectre Raman de l'acide oléique modifiés (un acide gras insaturé) qui inclut une modification alcyne (un groupe carbone-carbone triple liaison) Les résonances CH forte à 2845 cm -1 et la résonance alcyne à 2100 cm -1 sont à la fois bien isolées de la région d'empreintes digitales (la région de pics densément tassées), ce qui les rend idéales pour les marqueurs d'imagerie Raman cohérente. <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4:. Spectre typique des signaux Raman cohérente générée lorsque trois courts-pulsé les lasers sont engagés dans les limites de l'échantillon Les flèches indiquent le processus (es) responsables de chaque signal tel que représenté par les diagrammes d'énergie. Dans les schémas présentés ici flèches en pointillés indiquent les photons du laser et l'OPO et du flèches pleines indiquent le signal résultant. Les lignes solides horizontales indiquent l'énergie de la vibration Raman et donner une représentation visuelle qui, en RD-CARS, en mélangeant les 3 mêmes photons entrée simultanément deux différentes sondes Raman des vibrations. <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig5.jpg" alt="Figure 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 5"> Figure 5: Résultats typiques de l'imagerie C. elegans ver utilisant DR-voitures et les. La rangée du haut a utilisé les trois signaux indiqués dans la figure 4 à l'image d'un ver dans une solution de glucose deutéré. Dans la deuxième ligne les images ont été convenablement normalisées et dans la troisième rangée de la différence des images ont été produites en soustrayant chacune des images de l'image CARS DR-CARS.

<ol><li>Cheng, J. X., Volkmer, A., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theoretical+and+experimental+characterization+of+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Opt+Soc+Am+B%22%5BJournal%5D)">Theoretical and experimental characterization of coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy.</a> J Opt Soc Am B. 19 (9), (2002).</li>
<li>Tolles, W. M., Nibler, J. W., McDonald, J. R., Harvey, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Review+of+the+Theory+and+Application+of+Coherent+Anti-Stokes+Raman+Spectroscopy+%28CARS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Spectrosc%22%5BJournal%5D)">A Review of the Theory and Application of Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS).</a> Appl Spectrosc. , (1977).</li>
<li>Weeks, T., Schie, I. W., Wachsmann-Hogiu, S., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+generation+and+Raman-resonant+imaging+by+non-degenerate+four-wave+mixing+under+tight+focusing+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophoton%22%5BJournal%5D)">Signal generation and Raman-resonant imaging by non-degenerate four-wave mixing under tight focusing conditions.</a> J Biophoton. 3 (3), 169-175 (2010).</li>
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<li>Schie, I. W., Weeks, T., McNerney, G. P., Fore, S., Sampson, J. K., Wachsmann-Hogiu, S., Rutledge, J. C., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+forward+and+epi-CARS+microscopy+with+a+single+detector+by+time-correlated+single+photon+counting%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Simultaneous forward and epi-CARS microscopy with a single detector by time-correlated single photon counting.</a> Optics Express. 16 (3), 2168-2175 (2008).</li>
</ol>

Spectroscopie Raman et Raman à base d&#39;imagerie sont des outils puissants émergent dans les sciences bio. Actuellement, cela est particulièrement vrai pour l&#39;in vivo et in vitro d&#39;étude du métabolisme cellulaire et les troubles métaboliques dans le traitement et le stockage des lipides. La plupart des bio-macromolécules contiennent un grand nombre d&#39;analogues, principalement à base de carbone liaisons moléculaires, de sorte que les spectres Raman obtenus à partir de cellules et d&#39;organismes sont généralement une convolution des contributions des lipides, protéines, acides nucléiques, sucres, lipides etc sont relativement faciles d&#39;isoler à partir de ces spectres complexes, en raison de leur tendance à former des gouttelettes denses ou bicouches et parce qu&#39;ils contiennent des chaînes étendu avec un grand nombre de liaisons CH aliphatiques. Notre capacité d&#39;isoler des protéines spécifiques, acides aminés, ARN ou d&#39;ADN dans l&#39;environnement cellulaire complexe est, cependant, très limitée. Cela est particulièrement vrai si ces molécules d&#39;intérêt ne sont présents à des concentrations pM et ci-dessous. Ici, la capacité de la sonde faibles résonances Raman utilisant notre nouvellement introduit DR-CARS technique d&#39;imagerie différence fournit une approche potentiellement puissant pour leur microanalyse chimique et imagerie. Certes, la partie la plus compliquée de ce protocole est de l&#39;alignement et la synchronisation du système laser. Lors du démarrage à partir de zéro, la synchronisation des impulsions, c&#39;est à dire faire en sorte que les impulsions sont superposées dans le temps, malgré les différents chemins qu&#39;ils prennent peut être facilitée par l&#39;utilisation d&#39;un autocorrélateur pouls. Chevauchent fois spatiale et temporelle est atteinte, CARS et DR-CARS signaux doit être facilement détectable. Toutefois, le premier alignement est souvent brut, résultant en des signaux faibles. La meilleure pratique pour aligner ce système est d&#39;abord ainsi générer des signaux faibles et donc d&#39;améliorer la puissance du signal par un léger peaufinage les miroirs le long de chaque trajectoire et ajustant le chevauchement temporel en utilisant les étapes de retard. Bien que les actes du spectromètre / monochromateur comme une chicane très efficace pour la lumière ambiante la plus propre des résultats peut être réalisé par l&#39;exploitation du système avec les lumières de la pièce éteinte et des rideaux ou des tubes de verre pour minimiser de fond introduites par les différentes sources de lumière d&#39;autres (par exemple les écrans d&#39;ordinateur, voyants, voyants, etc.) Notre configuration particulière utilise un seul comptage de photons d&#39;avalanche photodiode (APD) et des détecteurs corrélées dans le temps de comptage de photons simples (TCSPC) du matériel de détection 5. Cela nous permet de détecter des signaux extrêmement faibles avec un bruit relativement faible, mais de nombreux groupes ont trouvé des tubes photomultiplicateurs (PMT) avec un gain variable avantageux quand effectuer des mesures similaires. L&#39;avantage de la PMT, c&#39;est qu&#39;ils offrent à gain variable et ont une surface de détection beaucoup plus grande qui peut simplifier l&#39;alignement du détecteur. De plus, notre configuration utilise les stades piézo pour traduire l&#39;objectif afin de parvenir à la numérisation du faisceau. L&#39;avantage de cela est que nous avons la capacité de revenir à n&#39;importe quel endroit dans l&#39;image précédemment numérisée avec un haut degré de précision et de prendre des mesures supplémentaires, y compris les spectres Raman spontanée. D&#39;autres groupes ont été couronnées de succès en utilisant des assemblées miroir de balayage, ou même l&#39;ensemble des unités confocale à balayage comme le système Olympus FluoView, qui propose d&#39;imagerie beaucoup plus rapide mais elle est limitée dans sa capacité à justement revenir à des positions arbitraires dans une image. Tuning les lasers pour correspondre à la résonance Raman est également une étape critique qui peut exiger une certaine optimisation. Bien que les pics Raman peut être connu dans le pic d&#39;intensité maximale spectrale obtenue à partir DR-voitures et les ne correspond pas nécessairement au maximum du pic Raman spontanée. Cela est dû à l&#39;interférence intrinsèque des signaux générés par mélange à quatre ondes conduisant à un signal de fond non-résonant et des voitures, ce qui fausse les spectres CARS rapport à spectres Raman spontanée. L&#39;emplacement spectral de la crête du signal CARS peut être calculé, mais une approche plus pratique consiste à ajuster les OPO dans plusieurs petites étapes à travers le spectre emplacement prévu de la résonance Raman. Ce processus devrait donner un maximum clair. En fait, pour la plus grande sensibilité du DR-FWM deux résonances doit être accordé à ce maximum. Un dernier problème potentiel de l&#39;approche DR-CARS doit également être discuté, c&#39;est à dire le signal DR-CARS dépendra d&#39;une distribution homogène de la molécule d&#39;actifs Raman amplifiant. Pour la plupart des objets biologiques, ce qui pourrait bien être la large résonance OH de l&#39;eau, qui est abondante et presque omniprésente. L&#39;eau est, toutefois, exclus de régions hydrophobes avec une cellule, tels que des gouttelettes lipidiques, conduisant une distorsion des signaux obtenus lors de l&#39;utilisation de la résonance de l&#39;eau pour amplifier les modes de lipides. Dans notre exemple, nous avons utilisé une solution de glucose deutéré pour générer un signal facilement détectable et abondants pour notre échantillon biologique. De même, l&#39;eau ou deutéré deutéré Buffe biologiquesrs, tels que le d-HEPES pourraient être utilisés. Dans notre exemple, le lipide gouttelettes dans le C. elegans ont été assez petit pour contenir à la fois toujours, la solution de glucose et de lipides deutérés dans le spot laser focalisé sur notre système. Ceci, cependant, n&#39;est pas généralement vrai. Un exemple particulier serait adipocytes, qui génèrent des gouttelettes lipidiques assez large au sein de leur cytoplasme. Cela signifie, toute expérience réalisée avec la technique du DR-CARS nécessite une préparation minutieuse et des expériences de contrôle pour vérifier les résultats.

<table><tbody><tr><td>Objectif à immersion dans l'eau 60X</td><td>Olympus Corporation</td><td>UPLSAPO 60XW</td><td></td></tr><tr><td>Microscope inversé</td><td>Olympus Corporation</td><td>IX-71SIF-3</td><td></td></tr><tr><td>Cellule de Pockels</td><td>ConOptics</td><td>350-160</td><td></td></tr><tr><td>Laser pompé par Picotrain</td><td>HighQ</td><td>IC-1064-10000</td><td></td></tr><tr><td>Oscillateur paramétrique optique</td><td>APE</td><td>Levante IR</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips en verre 1,5</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-102 25cm&lt;sup&gt;-1&lt;/sup&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Plaques demi-onde</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>AHWP05M-980</td><td></td></tr><tr><td>Cubes séparateurs de faisceau polarisants</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>PBS052 ou PBS053</td><td></td></tr><tr><td>Spectromètre/Monochromateur</td><td>Princeton Instruments/Acton</td><td>Spectra Pro 2300i</td><td></td></tr><tr><td>Caméra CCD</td><td>Princeton Instruments/Acton</td><td>PIXIS : 100B</td><td></td></tr><tr><td>Photodiode à avalanche</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>SPCM-AGR-14-12691</td><td></td></tr><tr><td>Plateau piézoélectrique XYZ</td><td>Physik Instruments</td><td>P 733-2CL P 721.CDQ</td><td>Il s'agit d'une combinaison d'un plateau XY et d'un support d'objectif Z</td></tr><tr><td>Miroirs dichroïques</td><td>Semrock</td><td>Ff01-720/SP-25 LPD01-633RS-25</td><td>Ces miroirs dichroïques spécifiques ne sont pas essentiels ; tout ensemble présentant les caractéristiques de transmission/réflexion appropriées conviendra.</td></tr><tr><td>Miroir dichroïque</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>Z830rdc</td><td>Pour combiner les différents faisceaux laser proches infrarouges</td></tr><tr><td>Carte TCSPC</td><td>PicoQuant</td><td>Timeharp 200</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d'imagerie Symphotime</td><td>PicoQuant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imagerie différentielle des structures biologiques avec doublement résonnante anti-stokes cohérente diffusion raman (cars)

Differential Imaging of Biological Structures with Doubly-resonant Coherent Anti-stokes Raman Scattering (CARS)

Cohérente des techniques d&#39;imagerie Raman ont vu une augmentation spectaculaire de l&#39;activité au cours de la dernière décennie en raison de leur promesse de permettre sans étiquette d&#39;imagerie optique moléculaire élevé avec une spécificité 1. La sensibilité de ces techniques, cependant, est de plusieurs ordres de grandeur plus faible que la fluorescence, nécessitant milli-molaire 1,2 moléculaires concentrations. Ici, nous décrivons une technique qui peut permettre la détection de faibles concentrations ou faible actifs Raman des molécules en amplifiant leur signal avec celui obtenu à partir de solides ou abondants diffuseurs Raman. L&#39;interaction des lasers pulsés courts dans un échantillon biologique génère une variété de signaux cohérents de diffusion Raman, chacun de qui transportent l&#39;information chimique unique sur l&#39;échantillon. Typiquement, un seul de ces signaux, par exemple anti-Stokes cohérente diffusion Raman (CARS), est utilisé pour générer une image tandis que les autres sont défaussées. Cependant, lorsque ces autres signaux, y compris 3-couleurs CARS et mélange à quatre ondes (FWM), sont collectés et comparés au signal CARS, autrement difficiles à détecter des informations peuvent être extraites 3. Par exemple, CARS doublement résonnant (DR-CARS) est le résultat de l&#39;interférence constructive entre les deux signaux de résonance 4. Nous démontrons comment tuning des trois lasers nécessaires pour produire DR-CARS signaux au 2845 cm -1 aux vibrations d&#39;élongation CH dans les lipides et les vibrations 2120 cm -1 CD étirement d&#39;une molécule deutérée (par exemple, les sucres deutéré, acides gras, etc) peut être utilisé pour sonder les résonances Raman simultanément. Dans ces conditions, en plus des signaux CARS de chaque résonance, un combiné DR-CARS signal de sonder à la fois est également généré. Nous démontrons comment détecter la différence entre le signal DR-CARS et amplifiant le signal de la vibration d&#39;une molécule abondante peut être utilisée pour améliorer la sensibilité des plus faibles du signal. Nous avons également démontré que cette approche s&#39;étend même à des applications où les deux signaux sont générés à partir de molécules différentes, telles que par exemple en utilisant le signal fort Raman d&#39;un solvant peut améliorer le faible signal Raman d&#39;un soluté dilué.

Une combinaison de trois simples courte longueur d&#39;onde des lasers pulsés sont utilisés pour générer des anti-Stokes cohérente diffusion Raman (CARS) et les voitures doublement résonnant (DR-CARS). La différence entre ces signaux fournit une sensibilité accrue pour les autrement difficiles à détecter des signaux cohérents Raman, permettant l&#39;imagerie de la faiblesse des diffuseurs Raman.

Imagerie différentielle des structures biologiques avec doublement résonnante anti-Stokes cohérente diffusion Raman (CARS)

Les techniques d'imagerie Raman cohérente ont connu une augmentation spectaculaire de l'activité au cours de la dernière décennie en raison de leur promesse de permettre l'imagerie optique sans marquage...

Ce vidéo montre une procédure permettant d'effectuer une imagerie différentielle de deux résonances Raman associées à des structures biologiques à l'aide de signaux de diffusion Raman cohérente. Trois lasers à impulsions courtes synchronisés sont d'abord superposés dans le temps et l'espace. Les impulsions superposées sont ensuite envoyées vers un microscope inversé standard, ce qui permet la génération de signaux Raman cohérents à partir d'objets microscopiques.Les signaux sont convertis en images à l'aide d'un logiciel commercial afin de comparer les différents signaux Raman produits. Les résultats indiquent que la différence entre les images obtenues à partir de signaux Raman doublement et simplement résonnants offre une sensibilité accrue pour les signaux Raman faibles. Bonjour, je suis Tyler Weeks du Centre de bio-photonique de l'Université de Californie à Davis.Je suis Thomas ER du Centre de bio-photonique et du Département de médecine interne de l'Université de Californie à Davis. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure utilisant la diffusion Raman cohérente anti-Stokes doublement résonnante pour produire des images chimiquement spécifiques de cellules. Nous utilisons cette procédure pour détecter des signaux provenant de molécules trop faibles pour être détectés directement par spectroscopie Raman cohérente anti-Stokes seule.Commençons. Afin de générer simultanément les signaux CARS et CARS-DG, trois sources laser à impulsions courtes accordables et synchronisées sont nécessaires pour obtenir ces impulsions synchronisées. Commencez avec un seul laser à impulsions courtes ayant une puissance de sortie de 10 watts, une longueur d'onde fixe de 1064 nanomètres, une durée d'impulsion fixe de sept picosecondes et une fréquence de répétition fixe de 76 mégahertz.À l’aide d’une série de lames demi-onde et de cubes diviseurs de faisceau polarisants, le faisceau est divisé en trois parties. Une lame demi-onde combinée à un cube diviseur de faisceau polarisant permet d’ajuster la puissance dans chaque composante du faisceau sans en modifier la direction. Typiquement, deux faisceaux sont réglés à environ 4,5 watts chacun, et le troisième faisceau contient le watt restant.Les deux faisceaux de haute puissance sont ensuite dirigés vers deux oscillateurs paramétriques optiques indépendants, ou OPO. Les OPO utilisent une génération de fréquences différentes pour convertir un photon à haute énergie en deux photons à énergie plus faible ayant des longueurs d'onde distinctes. En contrôlant la température du cristal utilisé pour obtenir cet effet, les longueurs d'onde des photons résultants peuvent être ajustées avec une précision de 0,1 nanomètre.En doublant la fréquence de ces signaux, un laser à longueur d'onde fixe de 1064 nanomètres peut désormais être transformé en un faisceau laser accordable entre 780 nanomètres et 910 nanomètres, en pompant deux OPO distincts à l'aide de la même source de 1064 nanomètres. Deux sources laser indépendamment accordables sont ainsi obtenues, automatiquement synchronisées avec notre laser pompe d'origine. Le troisième faisceau provenant du laser pompe de 1064 nanomètres est dévié autour des OPO à l'aide d'une combinaison de miroirs diélectriques, de sorte que les trois faisceaux puissent être recombinés ultérieurement.Pour produire efficacement des photons de signal Raman cohérents, les impulsions recombinées doivent être superposées à la fois dans le temps et dans l'espace, car les OPO contiennent des cavités en anneau permettant à chaque impulsion laser de traverser le cristal plusieurs fois ; le faisceau envoyé à travers les OPO parcourt ainsi une distance supplémentaire, entraînant un retard considérable par rapport au faisceau pompe d'origine. Cette distance doit être compensée à l'aide d'un troisième faisceau, en introduisant des miroirs supplémentaires qui forcent ce faisceau à parcourir la même distance que les deux autres avant qu'ils ne soient recombinés à l'aide de miroirs dichroïques afin d'assurer un réglage fin de la longueur du trajet. Chaque faisceau traverse des étages de retard réglables, qui permettent d'ajuster le recouvrement temporel des différentes impulsions laser.Un autre ensemble de lames demi-onde et de cubes diviseurs de faisceau polarisants est ajouté à chaque faisceau afin de permettre l'ajustement indépendant de la puissance laser de chaque faisceau. Des miroirs dichroïques sont utilisés pour combiner d'abord les faisceaux provenant des deux OPO, puis le faisceau de 1064 nanomètres ; il est essentiel de veiller à ce que les faisceaux soient parfaitement superposés dans l'espace. Cette superposition peut être vérifiée en comparant le recouvrement des faisceaux à quelques centimètres du miroir dichroïque avec celui observé à environ un mètre du miroir dichroïque.Étant donné qu'une exposition à des faisceaux laser de puissance moyenne élevée peut endommager l'échantillon, les trois faisceaux combinés sont dirigés à travers un modulateur électro-optique fonctionnant comme un sélecteur d'impulsions, ce qui permet d'ajuster la fréquence de répétition des impulsions arrivant sur l'échantillon, et donc la puissance moyenne. Les faisceaux laser combinés sont ensuite couplés à un microscope inversé équipé d'un objectif à haute ouverture numérique, ou NA. Le focalisation très serrée produite par l'objectif à haute NA permet la génération la plus efficace de signaux Raman cohérents à l'échelle microscopique.L'objectif du microscope est monté sur une platine piézoélectrique X, Y, Z, ce qui permet d'obtenir des images en balayant les faisceaux sur l'échantillon selon un mode similaire à celui des microscopes confocaux commerciaux à balayage de faisceau. Voyons maintenant comment générer les signaux CARS et D-R-F-W-M : l'interaction de trois faisceaux laser à impulsions courtes au niveau de l'échantillon conduit à la génération de plusieurs signaux de mélange à quatre ondes, tels que les signaux CARS provenant des différentes combinaisons de deux lasers, ainsi que les signaux CARS tricolores et les signaux DR-CARS issus de la combinaison des trois lasers. Lorsque les signaux sont relativement proches en longueur d'onde, il peut être difficile de les séparer pour l'analyse.Pour cette raison, les signaux sont envoyés vers un spectromètre d'imagerie qui sert également de monochromateur ou de filtre passe-bande afin de séparer spatialement les signaux à différentes longueurs d'onde. Un miroir basculant actionné électroniquement situé à l'intérieur du spectromètre, en position abaissée, dirige le signal vers une caméra CCD (dispositif à couplage de charge) à éclairage arrière et à appauvrissement profond, qui fournit des informations spectroscopiques sur l'ensemble du spectre de signal, et nous permet d'identifier et d'optimiser les différents signaux Raman cohérents afin de sélectionner le signal à imager. Il suffit de faire tourner le réseau dans le spectromètre à l'aide du logiciel de commande et d'acquisition de données fourni par le fabricant pour centrer le pic d'intérêt sur la caméra CCD.Ensuite, modifiez la position du miroir basculant afin de rediriger le signal vers un deuxième port de sortie auquel est fixé un photodétecteur à avalanche à comptage de photons uniques DDE ou un PD. Effectuez une numérisation raster de l'objectif, puis utilisez les signaux enregistrés sur le PD pour générer une image en affichant le taux de comptage de photons pour chaque pixel à l’aide du logiciel d’acquisition de données. Répétez cette procédure d’imagerie pour chaque signal Raman cohérent souhaité afin que les signaux puissent être comparés lors du post-traitement.Examinons maintenant comment préparer correctement un échantillon afin d'obtenir des images nettes et reproductibles. Un soin particulier doit être pris lors de la préparation des échantillons. Ces derniers sont généralement préparés sur des lamelles en verre d'une épaisseur d'environ 150 microns.Ces lamelles sont suffisamment minces pour permettre une imagerie haute résolution à l’aide d’objectifs à immersion dans l’eau ou dans l’huile ayant un grand indice de réfraction (NA), utilisés dans ces expériences. Pour illustrer la préparation d’un échantillon typique, nous préparons des sections d’environ 20 micromètres d’épaisseur de tissu musculaire de souris fixé sur une lame de microscope. Une goutte de 20 microlitres de solution de glucose deutéré à cinq molaire est ajoutée à l’échantillon.La solution de glucose deutérée fournit une signature de fond Raman unique et intense. Un lamelle en verre est placée au-dessus de l'échantillon et fixée à l'aide de vernis à ongles pour les cellules et la culture. Des boîtes de culture à fond en verre peuvent être utilisées, permettant l'imagerie sans avoir à détacher les cellules de leurs boîtes de culture initiales.Examinons maintenant comment déterminer les pics et longueurs d'onde appropriés pour les voitures Dr. Afin de tirer pleinement parti de l'effet d'amplification doublement résonnant, les spectres Raman des deux substances résonnantes doivent être connus. Généralement, ces pics se situent à 2 845 cm⁻¹, associé aux lipides, et à 2 121 cm⁻¹, correspondant au mode d'étirement CD lié au glucose deutéré.La diffusion Raman cohérente est obtenue lorsque la différence de fréquence entre deux lasers correspond à la fréquence d'une vibration moléculaire. En ajustant un OPO à 817 nanomètres, il sondéra le mode C à 2 845 centimètres inverses lorsqu'il sera combiné au faisceau laser de 1064 nanomètres, et en réglant l'autre OPO à 868 nanomètres, il sondéra le mode à 2 121 centimètre inverse lorsqu'il sera combiné au faisceau de 1064 nanomètres. En mode spectroscopique, le microscope CARS nous permet d'observer trois signaux Raman cohérents d'intérêt : un signal CARS sondant la vibration d'élongation CH, un signal CARS sondant le mode d'élongation CD, et un signal DR CARS sondant les deux. Dans le schéma présenté ici, les flèches en pointillés indiquent les photons provenant des lasers des OPO, tandis que les flèches pleines indiquent le signal résultant.Les lignes horizontales continues indiquent l'énergie de la vibration ramen et offrent une représentation visuelle du fait que, dans les voitures DR, le mélange simultané des trois mêmes photons d'entrée sonde deux vibrations ramen différentes. L'intensité du signal pour chaque pic devra être optimisée en effectuant des réglages fins autour de ces positions de pics. Ici, nous sélectionnons chaque pic et prenons des images de vers marins elgan dans une solution de glucose deraté, l'extraction d'informations supplémentaires à partir de ces trois images obtenues individuellement nécessitant un traitement d'image assez simple.Tout d'abord, les images doivent être normalisées. Une méthode pratique de normalisation repose sur le fait que les lipides sont hydrophobes. Cela signifie que dans les régions où la densité des lipides est élevée, la résonance CD issue du glucose devrait contribuer très peu au signal de double résonance.En revanche, dans les régions contenant uniquement une solution de glucose, les résonances CH provenant des lipides devraient également contribuer très peu. Dans cette optique, normalisez l'image du car DR et l'image du car obtenue sur la résonance CD de la solution de glucose deutérée à une région située bien au-delà du ver CL egan, qui ne devrait présenter aucune résonance CH. Ensuite, identifiez une région située à l'intérieur du ver sur l'image du car en résonance CH riche en lipides, et normalisez-la par rapport à la région correspondante dans l'image normalisée du car DR.Pour que cette méthode fonctionne correctement, on suppose qu’en profondeur dans cette région, aucun glucose deutéré n’est présent. Cette hypothèse est raisonnable puisque les lipides sont hydrophobes et ne se mélangent pas à la solution. En soustrayant ensuite l’image normalisée du carbone lié à l’hydrogène (CH) de l’image normalisée du carbone lié au deutérium (CD), seul le signal résonnant amplifié du CD subsiste, de manière analogue à la soustraction de l’image normalisée du carbone lié au deutérium (CD) de l’image normalisée de Dr.FWM.Seul le signal résonnant CH amplifié reste visible. Voici le spectre Raman pour un acide oléique modifié incluant une modification alkyne : les résonances CH intenses à 2 845 cm⁻¹ et la résonance alkyne à 2 121 cm⁻¹ sont toutes deux bien isolées de la région d'empreinte digitale, correspondant à la zone aux pics densément groupés, ce qui les rend idéales comme marqueurs pour l'imagerie Raman cohérente. Il s'agit d'un spectre typique de signaux Raman cohérents générés lorsque trois lasers à impulsions courtes se superposent dans l'échantillon. Les flèches indiquent les processus responsables de chaque signal, tels qu'illustrés par les diagrammes d'énergie.Il s'agit de résultats typiques obtenus par imagerie des vers de C. Elgin à l'aide de voitures DR et de voitures. La rangée supérieure a utilisé les trois signaux précédemment montrés pour imager un ver dans une solution de glucose atténué. Dans la deuxième rangée, les images ont été correctement normalisées et, dans la troisième rangée, les images de différence ont été produites en soustrayant l'image de chaque voiture de l'image de la voiture DR. Nous venons de vous montrer comment réaliser une imagerie de différence Raman basée sur la microscopie cohérente anti-Stokes Raman doublement résonante.Lorsque vous effectuez cette procédure, souvenez-vous qu'il est important de vous assurer que les faisceaux sont correctement superposés et synchronisés. De plus, lors du passage d'un signal cohérent à un autre, veillez à ne pas heurter ni déplacer l'échantillon, car cela affecterait l'analyse. Voilà tout.Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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