Name: Toxoplasma gondii Formation paroi du kyste dans la moelle osseuse Activé macrophages dérivés et Conditions Bradyzoite (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-12T17:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Découvrez comment induire et visualiser la formation de la paroi kystique chez Toxoplasma gondii in vitro en utilisant des macrophages dérivés de moelle osseuse et des fibroblastes soumis à des stress environnementaux.

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Ce travail a été soutenu par l&#39;Université du Wisconsin-Madison Herman I. Shapiro Distinguished Graduate Fellowship (CMT), l&#39;attribution des NIH AI072817 (AMP) et l&#39;American Heart Association Award 0840059N (LJK).

1. Préparation de fibroblastes de prépuce humain (HFF) enduit de lamelles <ol><li> Placer une lamelle de verre stérile ronde sur le fond des puits d'une plaque de 24 puits de culture de tissu. </li><li> Pour récolter HFFS d'une confluence 150cm 2 flacon, rincer le ballon deux fois avec du PBS 1X et ajouter 2,5 ml de 0,025% de trypsine-EDTA. Incuber flacon à 37 ° C pendant 5-10 minutes. </li><li> Exploiter le côté du ballon de contre la paume de votre main peut aider à détacher les cellules de la fiole. Une fois que les cellules ont libéré de la fiole, ajouter 150 ml de HFF moyennes (Dulbecco Modified Eagle Medium [DMEM] avec 10% de FBS, 2 mM de L-glutamine et 1% de pénicilline-streptomycine) et utiliser le moyen de se rincer la fiole et de recueillir les cellules. </li><li> Distribuer 1 ml de cellules par puits avec les lamelles. </li><li> Laisser les cellules deviennent confluentes à 37 ° C, 5% de CO 2. </li></ol> 2. Préparation L929 milieu conditionné (CM) pour le développement de BMC <ol><li> L929 est une ligne aneuploïdes murin fibrosarcome cellule qui sécrète colonies de macrophages facteur stimulant, après de longues périodes de confluence. Cette sécrétion permet à la CM de cellules L929 à être utilisé pour développer des cellules de la moelle osseuse de souris en macrophages dans une culture cellulaire. </li><li> Une fois que des cellules L929 sont confluentes, laissez-les incuber pendant une 7-9 jours supplémentaires jusqu'à ce qu'ils apparaissent sphériques et commencer à lever hors du ballon. Recueillir surnageant et le culot des cellules détachées à 425 xg pendant 10 minutes. Ce surnageant est la CM. </li><li> Un flacon de 150 cm 2 de cellules L929 rendements de 30 ml de CM, qui génère 150 ml de milieu de BMC. BMC milieu est composé de 10% de FBS, CM 20%, 1% de pénicilline-streptomycine et 1% de L-glutamine dans le DMEM. </li></ol> 3. L'isolement de la moelle osseuse et de culture cellulaire de BMC <ol><li> Sacrifice C57BL / 6 souris en CO 2 et la surface de l'asphyxie stériliser à 70% d'éthanol. </li><li> Exposer le péritoine en soulevant la peau de l'abdomen près de la jambe et la coupe avec des ciseaux. Évitez de perforer le péritoine. Couper à la jambe pour exposer le tibia et le fémur. Coupez le tissu musculaire de l'os de la jambe à l'aide des ciseaux. </li><li> Pour supprimer le fémur, couper une fois en dessous du genou et une fois près de la hanche. Placez les os dans un plat de Pétri contenant bactériologiques froide PBS 1X. Ne pas utiliser la culture de tissus traités boîtes de Pétri pour ces étapes parce que le BMC se conformer de façon permanente. Utiliser un scalpel pour gratter le tissu musculaire supplémentaire. Couper l'os juste au-dessus du genou pour exposer la moelle. </li><li> Répétez les étapes (b) et (c) de recueillir la moelle osseuse du fémur secondes. </li><li> Utiliser une seringue de 10cc rempli de PBS 1X froid et d'une aiguille de calibre 25 pour déloger la moelle osseuse dans un tube conique de 50 ml. L'os devrait apparaître pur moelle blanche fois est retiré. </li><li> Passez le mélange PBS / la moelle par une aiguille de calibre 22 pour briser les agrégats de moelle osseuse. </li><li> Spin le mélange à 425 xg pendant 10 minutes, et retirer le surnageant. </li><li> Reprendre le culot dans 8 ml de milieu de BMC. Ajouter 1 ml de suspension cellulaire et 9 ml BMC moyenne à 8 bactériologiques boîtes de Pétri. </li><li> Incuber à 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Au jour 5, ajouter 10 ml BMC moyenne à chaque assiette. Au jour 7, les cellules seront pleinement développées. BMC peuvent être repiquées pendant 1-2 semaines après la maturation. </li><li> Pour diviser BMC, éliminer le milieu et ajouter 5 ml de PBS 1X froid à chaque boîte de Pétri. Incuber à 4 ° C pendant 30 minutes, jusqu'à ce que les cellules commencent à se soulever. Rincez le BMC de la plaque avec une pipette de transfert stérile. </li><li> Piscine du BMC dans un tube conique de 50 ml et de granulés à 425 xg pendant 10 minutes. </li><li> Reprendre le culot dans 10 ml de BMC moyen et compter sur un hématimètre. Graine 2x105 BMC par puits dans une plaque de 24 puits avec des lamelles de verre ronde sur le fond. Laissez les BMC adhèrent nuit avant d'infecter avec T. gondii. BMC en excès peuvent être ensemencés sur des boîtes de Pétri pour une utilisation ultérieure. </li></ol> 4. Infecter les cellules avec T. gondii <ol><li> Infect 25 cm 2 flacon de HFFS confluence avec 2x10 6 T. gondii et grandir jusqu'à ce que les cellules commencent à lyser (environ 2-3 jours). </li><li> Utilisez un grattoir pour enlever la cellule de l'hôte infecté monocouche de cellules de la fiole de culture de tissus, puis relâchez les parasites de la cellule hôte par le passage de la monocouche délogé par une aiguille de calibre 27. </li><li> Utilisez un hématimètre pour déterminer le nombre de parasites dans le milieu. </li><li> Infect 10 5 parasites par bien avec lamelle de monocouches HFF de protocole 1, ou BMC du Protocole n ° 3. Laissez les parasites envahissent pendant 3 heures à 37 ° C, 5% de CO 2. </li></ol> 5. Initier T. gondii bradyzoite de développement par les contraintes environnementales <ol><li> Le développement de Bradyzoite HFFS avec une augmentation de pH du milieu et de CO 2 de famine <ol class="lalpha"><li> Préparer le milieu du développement. Développement à moyen contient RPMJ'ai 1640 sans bicarbonate, 1% de FBS, 1% de pénicilline-streptomycine, et 42 mM d'HEPES. pH à 8,0 et stériliser par filtration. </li><li> Retirer du DMEM HFFS infectés, rincer avec du PBS 1X, et ajoutez 1 ml de milieu de développement. </li><li> Incuber pendant 3 jours à 37 ° C avec l'air ambiant. </li></ol></li><li> L'activation du BMC <ol class="lalpha"><li> Préparer le milieu pour activer BMC. Moyennes activation est complétée par BMC moyennes d'IFN-γ 100U/ml et 100 ng / ml de LPS. Soniquer LPS dans un bain d'eau pendant 2 minutes avant de l'utiliser pour perturber les agrégats. </li><li> Retirer BMC moyenne des puits et la remplacer par 1 ml de milieu d'activation. </li><li> Incuber à 37 ° C, 5% de CO 2 pendant 3 jours. </li></ol></li></ol> 6. Détection par immunofluorescence <ol><li> Rincez infectés puits trois fois avec du PBS 1X. </li><li> Fixer le monocouche avec 200ul de formaldéhyde à 3% pendant 20 minutes. </li><li> Retirer fixateur et rincer les puits avec du PBS 1X. </li><li> Ajouter 200 ul de 0,1 M de glycine aux puits et laisser reposer pendant 5 minutes. </li><li> Retirez la glycine et rincer les puits avec du PBS 1X. </li><li> Ajouter 250 pi de 3% BSA/0.2% TritonX-100 dans du PBS 1X à perméabiliser et bloquer la monocouche pendant 30 minutes. </li><li> Retirer la solution de blocage et rincer les puits avec du PBS 1X. </li><li> Ajouter 50 ul d'une dilution 1:250 de la rhodamine Dolichos biflorus agglutinine de 3% BSA/0.2% de Triton X-100 dans du PBS 1X. </li><li> Recouvrir la plaque et les placer sur la plate-forme agitateur à température ambiante pendant 1 heure </li><li> Lavez les lamelles 3 fois avec 0,2% de Triton X-100 dans du PBS 1X pendant 5 minutes chacun sur un shaker plate-forme. </li><li> Lamelles mont en utilisant le milieu de montage Vectashield contenant 4'6-diamidino-2-phénylindole (DAPI). </li><li> Vitrail T. gondii peuvent être visualisées en utilisant un microscope à fluorescence avec un filtre approprié pour la rhodamine à un grossissement de 100x. </li></ol> 7. Les résultats représentatifs La figure 1 montre coloration DBA représentant de T. gondii dans BMMs activé et HFFS sous stress pH. Les deux taches DBA montrer autour du parasite contenant des vacuoles, indiquant la présence de composants de la paroi du kyste. L'image montre BMM activé coloration DBA qui est conforme à la surface de la vacuole. La section transversale du T. gondii dans pH souligné HFFS montre la paroi du kyste sans structures internes tachés. <img src="/files/ftp_upload/2091/2091fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Coloration de la DBA a souligné T. gondii. parasites intracellulaires dans des conditions de stress, BMMs activé ou pH souligné HFFS, ont été colorés avec DBA conjugué rhodamine (rouge). Contraste d'interférence différentiel (DIC) montre le contour du kyste et la barre d'échelle est égal à 2 uM noire. Expériences sur animaux Expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et règlements établis par l'Université du Wisconsin et de protection des animaux Comité utilisation.

<ol><li>Tomida, M., Yamamoto-Yamaguchi, Y., Hozumi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+a+factor+inducing+differentiation+of+mouse+myeloid+leukemic+M1+cells+from+conditioned+medium+of+mouse+fibroblast+L929+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification of a factor inducing differentiation of mouse myeloid leukemic M1 cells from conditioned medium of mouse fibroblast L929 cells.</a> J Biol Chem. 259 (17), 10978-10980 (1984).</li>
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<li>J, P., Knoll, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Toxoplasma+gondii+development+mutants+identifies+a+potential+proteophosphogylcan+that+enhances+cyst+wall+formation.+Molecular+and+Biochemical+Parasitology%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Isolation of Toxoplasma gondii development mutants identifies a potential proteophosphogylcan that enhances cyst wall formation. Molecular and Biochemical Parasitology.</a> 169 (2), 120-123 (2010).</li>
<li>Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Bradyzoite-Specific+Toxoplasma+gondii+Antigens+in+Gamma+Interferon-Treated+Mouse+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Induction of Bradyzoite-Specific Toxoplasma gondii Antigens in Gamma Interferon-Treated Mouse Macrophages.</a> Infection and Immunity. 61 (3), 1141-1145 (1993).</li>
<li>Ibrahim, H. M., Bannai, H., Xuan, X., Nishikawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii+Cyclophilin+18-Mediated+Production+of+Nitric+Oxide+Induces+Bradyzoite+Conversion+in+a+CCR5-Dependent+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii Cyclophilin 18-Mediated Production of Nitric Oxide Induces Bradyzoite Conversion in a CCR5-Dependent Manner.</a> Infection and Immunity. 77 (9), 3686-3695 (2009).</li>
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<li>Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+replication+of+Toxoplasma+gondii+is+necessary+for+induction+of+bradyzoite-specific+antigens%3A+a+possible+role+for+nitric+oxide+in+triggering+stage+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Reduced replication of Toxoplasma gondii is necessary for induction of bradyzoite-specific antigens: a possible role for nitric oxide in triggering stage conversion.</a> Infection and Immunity. 62 (5), 1761-1777 (1994).</li>
</ol>

Bien que le mécanisme de développement bradyzoite n&#39;est pas entièrement comprise, des analyses génétiques moléculaires de T. conversion de l&#39;étape gondii dans la culture de tissus a conduit à la découverte des gènes qui sont impliqués dans la formation de kystes bradyzoite 2,3,4. Les analyses ont également conduit à l&#39;observation que certains marqueurs bradyzoite sont exprimés dans d&#39;autres conditions de stress prolongé, y compris la croissance dans les macrophages activés <s...

<table><tbody><tr><td>albumine sérique bovine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;milieu de culture Eagle modifié (DMEM)</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>11960-051</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (SVF)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>inactiver par chaleur </td></tr><tr><td>Rhodamine &lt;em&gt;Dolichos biflorus&lt;/em&gt; agglutinine</td><td>Vector Laboratories</td><td>RL-1032</td><td></td></tr><tr><td>Formaldéhyde (16 %)</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>18814</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-5</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN&amp;#947;</td><td>PeproTech Inc</td><td>315-05</td><td>Conserver en aliquots à usage unique</td></tr><tr><td>L-glutamine (200 mM)</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide (LPS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4391-1MG</td><td>Conserver en aliquots à usage unique</td></tr><tr><td>Couvercle de lame de microscope</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-80 12CIR-1</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Milieu RPMI 1640 en poudre (avec L-glutamine, sans bicarbonate)</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>31800-022</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,25 %)</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de montage VectaShield avec DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr></tbody></table>

toxoplasma gondii formation paroi du kyste dans la moelle osseuse activé macrophages dérivés et conditions bradyzoite

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii est un parasite intracellulaire obligatoire qui peut envahir toute cellule nucléée des animaux à sang chaud. Lors de l&#39;infection, T. gondii diffuse comme une forme rapide répliquant appelé tachyzoïtes. Tachyzoïtes convertir en une forme à croissance lente enkystées appelé bradyzoite par un processus de signalisation qui ne sont pas bien caractérisés. Dans les animaux, les kystes bradyzoite sont trouvés dans le système nerveux central et les tissus musculaires et représentent la phase chronique de l&#39;infection. Conversion à bradyzoïtes peut être simulé en culture de tissus par le CO 2 la famine, l&#39;aide moyenne avec un pH élevé, ou l&#39;ajout d&#39;interféron gamma (IFN). Bradyzoïtes sont caractérisées par la présence d&#39;un kyste, à laquelle la lectine de Dolichos biflorus agglutinine (DBA) lie. DBA marqué par fluorescence est utilisée pour visualiser la paroi du kyste chez des parasites cultivés dans des fibroblastes de prépuce humain (HFFS) qui ont été exposés à faibles émissions de CO 2 et moyennes pH élevé. De même, les parasites qui résident dans les os murins dérivés de la moelle macrophages (BMMs) affichent une paroi du kyste détectable par DBA après la BMMs sont activés avec IFN et de lipopolysaccharides (LPS). Ce protocole va montrer comment induire une conversion de T. gondii à l&#39;aide d&#39;un support bradyzoïtes pH élevé de croissance avec le CO 2 à faible et l&#39;activation de BMMs. Les cellules hôtes seront cultivés sur des lamelles, infectés par tachyzoïtes et soit activé avec plus d&#39;IFNy et LPS (BMMs) ou exposé à un milieu de croissance à pH élevé (HFFS) pendant trois jours. À la fin des infections, des cellules hôtes seront fixées, perméabilisées, et bloqués. Parois des kystes seront visualisés en utilisant la rhodamine DBA avec la microscopie à fluorescence.

Toxoplasma gondii se convertit en une forme un kyste, en réponse aux stress environnementaux, ce qui peut être imité dans les modèles de culture de tissus. Cette vidéo montre des techniques pour examiner la formation des parois du kyste en activant la moelle osseuse dérivées des macrophages ou des changements de pH moyen de croissance des cellules de fibroblastes.

Toxoplasma gondii Formation paroi du kyste dans la moelle osseuse Activé macrophages dérivés et Conditions Bradyzoite

Toxoplasma gondii est un parasite intracellulaire obligatoire capable d'envahir n'importe quelle cellule nucléée d'animaux à sang chaud. Lors de l'infection, T. gondii ...

L'objectif général de cette procédure est d'induire et de visualiser la formation de la paroi kystique chez Toxoplasma gondii in vitro. Ceci est réalisé en cultivant d'abord des macrophages et des fibroblastes.Ensuite, en infectant ces cellules hôtes, les réponses au stress des parasites peuvent être induites dans l'œil gde en soumettant les fibroblastes à un choc de pH ou en activant les macrophages, ce qui conduit dans les deux cas à la formation de la paroi kystique. Enfin, une lectine fluorescente est ajoutée aux cultures, se liant à la paroi kystique, permettant ainsi de visualiser les kystes par microscopie en immunofluorescence. Bonjour, je suis Crystal Tobin du laboratoire de la Dre Laura Noel, du Département de microbiologie médicale et d'immunologie de l'Université du Wisconsin à Madison.Je suis Angela Pollard, également membre du laboratoire No Lab. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure de formation in vitro de la paroi kystique de Toxoplasma gondii. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les réponses du parasite à des conditions de stress.Commençons. Commencez par placer une lame couvre-objet ronde stérile au fond de chaque puits d'une plaque de culture tissulaire de 24 puits afin d'induire la conversion de Toxoplasma gondii en bradyzoïtes dans des fibroblastes humains de prépuce sous des conditions de pH élevé et de privation en dioxyde de carbone. Démarrez avec un flacon confluant de 150 centimètres carrés de fibroblastes humains de prépuce sous une hotte de culture tissulaire.Rincer le flacon confluant de fibroblastes de prépuce humain deux fois avec un XPBS, puis ajouter 2,5 millilitres de trypsine-EDTA à 0,025 %. Incuber le flacon à 37 degrés Celsius pendant cinq à dix minutes. Après l'incubation de cinq à dix minutes, taper plusieurs fois sur le flacon pour détacher les cellules de la surface du plastique.Ensuite, ajoutez 150 millilitres de milieu HFF ou de milieu Eagle modifié Delcos supplémenté. Utilisez le milieu pour rincer le flacon et recueillir les cellules. Distribuez un millilitre de cellules dans chaque puits de la plaque à 24 puits contenant des lamelles, puis laissez les cellules atteindre la confluence à 37 degrés Celsius en présence de 5 % de dioxyde de carbone.Les cellules seront alors prêtes à être infectées par le parasite Toxoplasma gondii. Dans la hotte de culture tissulaire, infecter un flacon de 25 centimètres carrés contenant une monocouche confluente de fibroblastes humains provenant du prépuce avec deux fois 10 puissance six parasites, puis incuber à 37 degrés Celsius jusqu'à ce que les cellules commencent à lysér. Après environ deux à trois jours, utiliser un grattoir à cellules pour détacher la monocouche de fibroblastes infectés du flacon de culture tissulaire.Ensuite, libérez les parasites des cellules hôtes en faisant passer la monocouche détachée à travers une aiguille de calibre 27. Utilisez un cytomètre hématique pour déterminer le nombre de parasites dans le milieu, puis infectez chaque puits parmi les 24 puits contenant des fibroblastes de prépuce humain confluentes préalablement préparés avec 10 puissance cinq parasites.Incuber les cellules pendant trois heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone afin de permettre aux parasites d'envahir les cellules hôtes. Passer ensuite à l'induction de la conversion des parasites en stade Brady Zeolite. Retirer le DMEM des fibroblastes humains du prépuce infectés.Les rincer avec un XPBS, puis ajouter un millilitre de milieu de développement. Un milieu à base de RPMI sans bicarbonate, ajusté à un pH de huit. Incuber les cellules pendant trois jours à 37 degrés Celsius dans l'air ambiant.Les cellules sont désormais prêtes à être analysées pour la présence de Brady zos. La présence de Brady ZOS est déterminée à l'aide de la lectine marquée au fluorochrome docos ou DBA, qui se lie à la paroi de Toxoplasma Gandhi is assist afin de préparer les cellules infectées pour l'imagerie en fluorescence. Rincez les puits trois fois avec un XPBS.Ensuite, fixez les monocouches cellulaires avec 200 microlitres de formaldéhyde à 3 % pendant 20 minutes. Éliminez le fixateur et rincez les puits avec un XPBS. Ajoutez 200 microlitres de glycine 0,1 molaire dans les puits et laissez agir pendant cinq minutes.Éliminer la glycine et rincer les puits avec un XPBS pour bloquer et permeabiliser les cellules. Ajouter 250 microlitres de solution de blocage. Incuber les cellules pendant 30 minutes.Éliminer la solution de blocage et rincer les puits avec un XPBS. Ajouter 50 microlitres d'une dilution au 1/250 de DBA, qui a été conjuguée à la rumine, dans les puits. Couvrir la plaque et agiter pendant une heure à température ambiante sur un agitateur plat.Après l'incubation, retirez le DBA marqué par fluorescence en lavant les lamelles trois fois avec du Triton X-100 0,2 % dans un XPBS pendant cinq minutes chacun sur un agitateur rotatif, puis montez finalement les lamelles en utilisant un milieu de montage contenant un écran bêta et du dpi. La coloration T Gandhi peut être visualisée à l’aide d’un microscope à fluorescence équipé d’un filtre adapté à la rodamine, à un grossissement de 100 x. Comme méthode alternative pour induire la formation de Brady ZO, on peut activer les macrophages dérivés de la moelle osseuse infectés à l’aide d’interféron gamma et de lipopolysaccharide (LPS). Pour commencer, préparez d’abord un milieu conditionné à partir de cellules L 9 29 pour ce processus.L 9 29 est une lignée cellulaire de fibrosarcome utilisée comme modèle, qui sécrète un facteur de stimulation des colonies de macrophages après de longues périodes de confluence. Ce milieu conditionné peut être utilisé pour différencier les cellules de la moelle osseuse de souris en macrophages en culture cellulaire. Pour préparer le milieu conditionné, cultivez une fiole de 150 cm² de cellules L 9 2 9 jusqu'à confluence à 37 °C, puis incubez-les pendant sept à neuf jours supplémentaires, jusqu'à ce qu'elles apparaissent sphériques et commencent à se détacher de la surface de la fiole.Recueillir le milieu et les cellules détachées dans un tube de 50 millilitres et centrifuger à 420 ×g pendant 10 minutes. Le surnageant obtenu correspond au milieu conditionné : un flacon de 150 centimètres carrés de cellules L 9 29 produira 30 millilitres de milieu conditionné, volume nécessaire pour préparer 150 millilitres de milieu BMC. Pensez à préparer le DMEM pour le BMC avec les cellules L 9 29 destinées à l'élaboration du BMC.Pour visionner des protocoles vidéo détaillés illustrant la méthode d'isolement des cellules de la moelle osseuse. Pour le fémur de souris, veuillez consulter les protocoles vidéo suivants après que les CMO aient été incubées pendant cinq jours. Dans des boîtes de Pétri bactériologiques, ajoutez 10 millilitres de milieu pour CMO, qui contiendra du milieu conditionné provenant de cellules L 9 2 9, dans chaque boîte et incubez pendant deux jours supplémentaires, après quoi les cellules seront complètement développées.Des macrophages matures issus de moelle osseuse ou BMS peuvent être repiqués pendant une à deux semaines après leur maturation. Pour diviser les BMS, retirez le milieu et ajoutez cinq millilitres de PBS 1X froid incubé à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes, jusqu'à ce que les cellules commencent à se détacher. Rincez les cellules de la plaque à l'aide d'une pipette de transfert stérile. Récupérez les BMS dans un tube conique de 50 millilitres et centrifugez les cellules à 420 ×g pendant 10 minutes.Resuspendre le culot dans 10 millilitres de milieu BMC, puis utiliser un hémocytomètre pour déterminer la densité cellulaire d'ensemencement. Deux fois 10 à la puissance 5 BMS par puits. Dans une plaque de 24 puits contenant des lamelles rondes au fond, laisser les cellules adhérer toute la nuit avant de les infecter avec T. gandhi.Les cellules en excès peuvent être repiquées sur des boîtes de Pétri pour une utilisation ultérieure. Pour activer les BMS, préparez le milieu d'activation en soniquant le LPS dans un bain d'eau pendant deux minutes afin de rompre les éventuels agrégats. Ensuite, ajoutez au milieu BMC 100 nanogrammes par millilitre de LPS et 100 unités par millilitre d'IFN gamma.Enfin, retirez le milieu BMC des puits et remplacez-le par l'un des milieux d'activation. Incubez à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone pendant trois jours. Les BMC peuvent être colorées comme précédemment montré avec des fibroblastes de prépuce.Dans ces exemples, les bradyzoïtes de Toxoplasma gondii sont marqués avec un DBA fluorescent dans des fibroblastes de prépuce humain. Sous stress de pH. La paroi kystique est marquée de manière fluorescente, comme indiqué dans cette coupe transversale d'un kyste in vitro dans des DMS activés par l'IFN gamma et le L-P-S-D-V-A.Une coloration est également présente, comme indiqué ici à la surface de la vacuole. Nous venons de vous montrer comment colorer in vitro Toxoplasma gondii, les kystes dans les fibroblastes et les macrophages activés. Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de prévoir que les parasites et les cellules hôtes soient prêts le même jour.Voilà, c'est terminé. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

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