Toxoplasma gondii Formation paroi du kyste dans la moelle osseuse Activé macrophages dérivés et Conditions Bradyzoite

L'objectif général de cette procédure est d'induire et de visualiser la formation de la paroi kystique chez Toxoplasma gondii in vitro. Ceci est réalisé en cultivant d'abord des macrophages et des fibroblastes.

Ensuite, en infectant ces cellules hôtes, les réponses au stress des parasites peuvent être induites dans l'œil gde en soumettant les fibroblastes à un choc de pH ou en activant les macrophages, ce qui conduit dans les deux cas à la formation de la paroi kystique. Enfin, une lectine fluorescente est ajoutée aux cultures, se liant à la paroi kystique, permettant ainsi de visualiser les kystes par microscopie en immunofluorescence. Bonjour, je suis Crystal Tobin du laboratoire de la Dre Laura Noel, du Département de microbiologie médicale et d'immunologie de l'Université du Wisconsin à Madison.

Je suis Angela Pollard, également membre du laboratoire No Lab. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure de formation in vitro de la paroi kystique de Toxoplasma gondii. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les réponses du parasite à des conditions de stress.

Commençons. Commencez par placer une lame couvre-objet ronde stérile au fond de chaque puits d'une plaque de culture tissulaire de 24 puits afin d'induire la conversion de Toxoplasma gondii en bradyzoïtes dans des fibroblastes humains de prépuce sous des conditions de pH élevé et de privation en dioxyde de carbone. Démarrez avec un flacon confluant de 150 centimètres carrés de fibroblastes humains de prépuce sous une hotte de culture tissulaire.

Rincer le flacon confluant de fibroblastes de prépuce humain deux fois avec un XPBS, puis ajouter 2,5 millilitres de trypsine-EDTA à 0,025 %. Incuber le flacon à 37 degrés Celsius pendant cinq à dix minutes. Après l'incubation de cinq à dix minutes, taper plusieurs fois sur le flacon pour détacher les cellules de la surface du plastique.

Ensuite, ajoutez 150 millilitres de milieu HFF ou de milieu Eagle modifié Delcos supplémenté. Utilisez le milieu pour rincer le flacon et recueillir les cellules. Distribuez un millilitre de cellules dans chaque puits de la plaque à 24 puits contenant des lamelles, puis laissez les cellules atteindre la confluence à 37 degrés Celsius en présence de 5 % de dioxyde de carbone.

Les cellules seront alors prêtes à être infectées par le parasite Toxoplasma gondii. Dans la hotte de culture tissulaire, infecter un flacon de 25 centimètres carrés contenant une monocouche confluente de fibroblastes humains provenant du prépuce avec deux fois 10 puissance six parasites, puis incuber à 37 degrés Celsius jusqu'à ce que les cellules commencent à lysér. Après environ deux à trois jours, utiliser un grattoir à cellules pour détacher la monocouche de fibroblastes infectés du flacon de culture tissulaire.

Ensuite, libérez les parasites des cellules hôtes en faisant passer la monocouche détachée à travers une aiguille de calibre 27. Utilisez un cytomètre hématique pour déterminer le nombre de parasites dans le milieu, puis infectez chaque puits parmi les 24 puits contenant des fibroblastes de prépuce humain confluentes préalablement préparés avec 10 puissance cinq parasites.

Incuber les cellules pendant trois heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone afin de permettre aux parasites d'envahir les cellules hôtes. Passer ensuite à l'induction de la conversion des parasites en stade Brady Zeolite. Retirer le DMEM des fibroblastes humains du prépuce infectés.

Les rincer avec un XPBS, puis ajouter un millilitre de milieu de développement. Un milieu à base de RPMI sans bicarbonate, ajusté à un pH de huit. Incuber les cellules pendant trois jours à 37 degrés Celsius dans l'air ambiant.

Les cellules sont désormais prêtes à être analysées pour la présence de Brady zos. La présence de Brady ZOS est déterminée à l'aide de la lectine marquée au fluorochrome docos ou DBA, qui se lie à la paroi de Toxoplasma Gandhi is assist afin de préparer les cellules infectées pour l'imagerie en fluorescence. Rincez les puits trois fois avec un XPBS.

Ensuite, fixez les monocouches cellulaires avec 200 microlitres de formaldéhyde à 3 % pendant 20 minutes. Éliminez le fixateur et rincez les puits avec un XPBS. Ajoutez 200 microlitres de glycine 0,1 molaire dans les puits et laissez agir pendant cinq minutes.

Éliminer la glycine et rincer les puits avec un XPBS pour bloquer et permeabiliser les cellules. Ajouter 250 microlitres de solution de blocage. Incuber les cellules pendant 30 minutes.

Éliminer la solution de blocage et rincer les puits avec un XPBS. Ajouter 50 microlitres d'une dilution au 1/250 de DBA, qui a été conjuguée à la rumine, dans les puits. Couvrir la plaque et agiter pendant une heure à température ambiante sur un agitateur plat.

Après l'incubation, retirez le DBA marqué par fluorescence en lavant les lamelles trois fois avec du Triton X-100 0,2 % dans un XPBS pendant cinq minutes chacun sur un agitateur rotatif, puis montez finalement les lamelles en utilisant un milieu de montage contenant un écran bêta et du dpi. La coloration T Gandhi peut être visualisée à l’aide d’un microscope à fluorescence équipé d’un filtre adapté à la rodamine, à un grossissement de 100 x. Comme méthode alternative pour induire la formation de Brady ZO, on peut activer les macrophages dérivés de la moelle osseuse infectés à l’aide d’interféron gamma et de lipopolysaccharide (LPS). Pour commencer, préparez d’abord un milieu conditionné à partir de cellules L 9 29 pour ce processus.

L 9 29 est une lignée cellulaire de fibrosarcome utilisée comme modèle, qui sécrète un facteur de stimulation des colonies de macrophages après de longues périodes de confluence. Ce milieu conditionné peut être utilisé pour différencier les cellules de la moelle osseuse de souris en macrophages en culture cellulaire. Pour préparer le milieu conditionné, cultivez une fiole de 150 cm² de cellules L 9 2 9 jusqu'à confluence à 37 °C, puis incubez-les pendant sept à neuf jours supplémentaires, jusqu'à ce qu'elles apparaissent sphériques et commencent à se détacher de la surface de la fiole.

Recueillir le milieu et les cellules détachées dans un tube de 50 millilitres et centrifuger à 420 ×g pendant 10 minutes. Le surnageant obtenu correspond au milieu conditionné : un flacon de 150 centimètres carrés de cellules L 9 29 produira 30 millilitres de milieu conditionné, volume nécessaire pour préparer 150 millilitres de milieu BMC. Pensez à préparer le DMEM pour le BMC avec les cellules L 9 29 destinées à l'élaboration du BMC.

Pour visionner des protocoles vidéo détaillés illustrant la méthode d'isolement des cellules de la moelle osseuse. Pour le fémur de souris, veuillez consulter les protocoles vidéo suivants après que les CMO aient été incubées pendant cinq jours. Dans des boîtes de Pétri bactériologiques, ajoutez 10 millilitres de milieu pour CMO, qui contiendra du milieu conditionné provenant de cellules L 9 2 9, dans chaque boîte et incubez pendant deux jours supplémentaires, après quoi les cellules seront complètement développées.

Des macrophages matures issus de moelle osseuse ou BMS peuvent être repiqués pendant une à deux semaines après leur maturation. Pour diviser les BMS, retirez le milieu et ajoutez cinq millilitres de PBS 1X froid incubé à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes, jusqu'à ce que les cellules commencent à se détacher. Rincez les cellules de la plaque à l'aide d'une pipette de transfert stérile. Récupérez les BMS dans un tube conique de 50 millilitres et centrifugez les cellules à 420 ×g pendant 10 minutes.

Resuspendre le culot dans 10 millilitres de milieu BMC, puis utiliser un hémocytomètre pour déterminer la densité cellulaire d'ensemencement. Deux fois 10 à la puissance 5 BMS par puits. Dans une plaque de 24 puits contenant des lamelles rondes au fond, laisser les cellules adhérer toute la nuit avant de les infecter avec T. gandhi.

Les cellules en excès peuvent être repiquées sur des boîtes de Pétri pour une utilisation ultérieure. Pour activer les BMS, préparez le milieu d'activation en soniquant le LPS dans un bain d'eau pendant deux minutes afin de rompre les éventuels agrégats. Ensuite, ajoutez au milieu BMC 100 nanogrammes par millilitre de LPS et 100 unités par millilitre d'IFN gamma.

Enfin, retirez le milieu BMC des puits et remplacez-le par l'un des milieux d'activation. Incubez à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone pendant trois jours. Les BMC peuvent être colorées comme précédemment montré avec des fibroblastes de prépuce.

Dans ces exemples, les bradyzoïtes de Toxoplasma gondii sont marqués avec un DBA fluorescent dans des fibroblastes de prépuce humain. Sous stress de pH. La paroi kystique est marquée de manière fluorescente, comme indiqué dans cette coupe transversale d'un kyste in vitro dans des DMS activés par l'IFN gamma et le L-P-S-D-V-A.

Une coloration est également présente, comme indiqué ici à la surface de la vacuole. Nous venons de vous montrer comment colorer in vitro Toxoplasma gondii, les kystes dans les fibroblastes et les macrophages activés. Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de prévoir que les parasites et les cellules hôtes soient prêts le même jour.

Voilà, c'est terminé. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.