Name: Livraison bactérienne de lARNi Effectors: Transkingdom ARNi (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-18T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Découvrez la méthode tkRNAi pour la thérapie anticancéreuse utilisant des bactéries E. coli non pathogènes. Cette technique permet de livrer efficacement des shRNA thérapeutiques dans les cellules cancéreuses pour inverser la résistance multidrogue.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Les travaux ont été soutenus par des subventions non. 01GU0615 du «Bundesministerium für Forschung und Technologie (BMBF).

1) Livraison bactérienne des shRNA <ol><li> Avant de commencer avec la culture bactérienne, il faut se préparer milieu LB et LB-agar. </li><li> Pour le milieu LB peser extrait de levure (0,5% p / v), Bacto tryptone (1,0% p / v), et du NaCl (0,6% p / v) et diluer ces composants dans de l'eau bidest. Les solutions préparées doivent être stérilisés dans un autoclave et sont alors prêtes à utiliser. </li><li> Pour LB-agar gélose Bacto (1,5% p / v) doit être ajoutée à la précédente milieu LB à la stérilisation. </li><li> Chauffer LB-agar dans le micro-ondes jusqu'à ce que le LB-agar soit complètement dissoute. Laisser la solution refroidir jusqu'à ce que la bouteille peut être touché facilement sans se brûler. Ajouter à la kanamycine (100 mg / ml) pour la sélection de clones positifs dans d'autres mesures. </li><li> Préparer LB-agar sur un banc à flux laminaire (conditions stériles) par pipetage 20 ml de la solution de LB-agar en 10 cm de Petri-plats. Laissez les plaques refroidir jusqu'à ce le liquide est devenu solide. Les plaques sont maintenant prêts à utiliser et peut être conservé à 4 ° C. </li><li> Des vecteurs d'expression ShRNA-encodage sont transformées en compétents E. coli ceq221 par choc thermique utilisant la procédure de CaCl 2. </li><li> Plaque les bactéries transformées sur LB-agar contenant 100 ug / ml de kanamycine, fermez le couvercle, sceller les plaques avec du parafilm et cultiver l'envers à 37 ° C pendant la nuit. </li><li> Inoculer les cultures bactériennes mini clones positifs en choisissant colonies cultivées avec un cure-dent. Transférer le cure-dent dans 7,0 ml de milieu LB frais contenant 100 mg / ml de kanamycine et de cultiver à 37 ° C pendant la nuit sur un agitateur à 200 tpm. </li><li> Inoculer 100 ml de milieu LB frais contenant 100 mg / ml de kanamycine 1:100 avec la culture nuit sur un mini dans un flacon de 1 litre Erlenmeyer, et incuber à 37 ° C pendant la nuit sur un agitateur à 200 tpm. </li><li> Graine de 25 x 10 4 (nombre de cellules ensemencées dépend de la vitesse de croissance des cellules de la lignée cellulaire selon; confluence devrait être ~ 70-80% 24 heures après l'ensemencement) des cellules de carcinome gastrique (EPG85-257RDB) par puits dans 6 - plats puits et incuber ces à 37 ° C, dans une atmosphère de 5% de CO 2, vapeur d'eau saturée pendant la nuit. </li><li> Précédente à l'infection des cellules cancéreuses, sur les cultures nuit du tk ARNi contenant le vecteur E. coli sont mesurés dans un photomètre pour déterminer la DO 600. Diluer la solution bactérienne jusqu'à une densité optique de 0,5 est atteint (DO600 = 0,5 équivaut à 1,6 x 10 8 cellules bactériennes / ml). </li><li> Remplacez le support SVF contenant des cellules de culture des cellules carcinomes contre la FCS milieu sans précédent pour 30 min bactérienne co-incubation. </li><li> Laver deux fois avec des bactéries 1 x PBS, et diluer dans le sérum sans Leibovitz milieu L-15. </li><li> Ajouter des bactéries aux cellules cancéreuses diluée au désirée MOI (multiplicité d'infection = nombre de cellules bactériennes par des cellules cancéreuses) et co-incubation des bactéries et des cellules cancéreuses pendant 2 heures à 37 ° C. </li><li> Après 2 heures de cellules de cancer co-incubation ont été lavés deux fois avec du PBS 1x x et une fois avec du sérum contenant Leibovitz L-15 milieu supplémenté avec 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine, 2,5 pg / ml d'amphotéricine, 150 ug / ml de gentamicine, et 100 pg / ml de kanamycine. </li><li> Continuer à cultiver les cellules cancéreuses à 37 ° C, dans une atmosphère de 5% de CO 2, la vapeur d'eau saturée. </li><li> Les effets du traitement bactérienne peut être visualisé par microscopie à fluorescence, mesurée par PCR quantitative en temps réel sur le niveau d'ARNm RT, et par analyse western blot sur le niveau de protéines, et indiqué avec des dosages fonctionnels tels que l'analyse FACS, et les tests de prolifération cellulaire. (Si voulu, ces procédures peuvent être décrites en détail). </li></ol> Résultats Représentant 2) Si le protocole est réalisé correctement, les résultats devraient être comparables à celles indiquées ci-dessous. La microscopie à fluorescence La figure 1 montre un carcinome gastrique humaine trois heures après le traitement bactérienne (a) en comparaison à une cellule non traitée (b). Autour du noyau de la cellule traitée, les bactéries peuvent être détectées. <img src="/files/ftp_upload/2099/2099fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1: Fluorescent microscope de cellules humaines carcinome gastrique après traitement bactérien (1:500) et d'une cellule humaine non traitée carcinome gastrique comme témoin, DAPI-coloration, passe-bande DAPI filtre (Λem = 640 nm), objectif 40x. Quantitative en temps réel RT-PCR Dans la figure 2 une régulation négative de l'ARNm du gène MDR1 d'environ 70% (faisceau noir) peuvent être observés après traitement avec la bactérie thérapeutiques. Cellules parentales servir de contrôle positif en raison de l'absence d'une surexpression du gène MDR1. La lignée cellulaire 257RDB p170 contenant un plasmide exprimant anti-MDR1 shRNA s pris comme comparaison directe de la technologie ARNi pour transkingdom R d'autresNAi taire stratégies. La lignée cellulaire résistante traitée EPG85-257RDB surexprimant MDR1, la même lignée cellulaire traités avec des bactéries qui n'ont pas les shRNA plasmide exprimant, et cette lignée de cellules traitées avec des bactéries thérapeutiques portant un plasmide exprimant anti-MRP2 shRNA ont été pris comme contrôles positifs. <img src="/files/ftp_upload/2099/2099fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2: quantitative en temps réel RT-PCR l'expression des ARNm du gène MDR1 après le traitement avec des produits thérapeutiques E. coli exprimant ceq221 anti-MDR1 shRNA (MOI 1: 500). Normalisation a été réalisée en utilisant l'aldolase gène de ménage. Le ratio MDR1/aldolase des cellules non traitées de la lignée cellulaire EPG85-257RDB ont été de 100%. P-valeurs ont été calculées à l'aide de l'étudiant t-test (* = p &lt;0,05, ** = p &lt;0,005, *** = p &lt;0,001). Western blot La figure 3 montre que le MDR1 la régulation négative a également eu lieu sur le niveau de protéine bactérienne après le traitement. Elle montre le manque d'expression du gène MDR1 de la drogue lignée cellulaire parentale sensibles (EPG85-257P), l'expression du gène MDR1 de la lignée cellulaire de drogue traitées résistant (EPG85-257RDB) et l'expression du gène MDR1 de l'échantillon traité. Une réglementation claire en bas de MDR1 des cellules des bactéries traitées peuvent être observés. <img src="/files/ftp_upload/2099/2099fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3: Analyse par Western blot MDR1 niveaux d'expression des traités sensible aux médicaments EPG85-257P, la non traité résistant aux médicaments EPG-257RDB et des EPG85-257RDB après co-incubation avec E.. coli ceq221 + p43 MDR1. Ab primaire C219 1:100, et anti-actine 1:5 000, secondaire Ab anti-souris 1:10 000. Test de cytotoxicité L'analyse fonctionnelle comme le test de cytotoxicité montre la figure 4 sont également des indicateurs pour le fonctionnement de l'ARNi transkingdom. La lignée cellulaire parentale et la lignée cellulaire contenant un shRNA anit-MDR1 plasmide exprimant ne montrent aucune résistance à la daunorubicine. La lignée cellulaire résistante EPG85-257RDB et deux contrôles supplémentaires ne montrent pas des changements importants dans la résistance en comparaison de l'échantillon traité avec des bactéries shRNA anti-MDR1 exprimer où la résistance à la daunorubicine pu être renversé par environ 90%. <img src="/files/ftp_upload/2099/2099fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4: test de cytotoxicité. Médicaments spécifiques IC50-valeurs déterminées par un essai de cytotoxicité à la survie cellulaire. P-valeurs ont été calculées à l'aide de l'étudiant t-test (* = p &lt;0,05, ** = p &lt;0,005, *** = p &lt;0,001). Dosage de l'accumulation d'anthracyclines Selon la résistance des bactéries abaissé d'échantillons traités (figure 4), l'accumulation de cellules anthracycline shRNA anti-MDR1 traitée est augmenté d'environ 90% comme indiqué dans la figure 5. La lignée cellulaire parentale et la lignée cellulaire 257RDB p170 montrent une forte accumulation daunorubicine jusqu'à 100%. La variante résistante montre rarement toute accumulation. Les cellules traitées avec des bactéries shRNA anti-MDR1 exprimer montrent une augmentation de l'accumulation anthracycline de 90%. <img src="/files/ftp_upload/2099/2099fig5.jpg" alt="Figure 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 5"> Figure 5: dosage de l'accumulation des anthracyclines. L'accumulation des anthracyclines de cellules de carcinome 6 jours après le traitement bactérienne mesurée par cytométrie en flux. P-valeurs ont été calculées à l'aide de l'étudiant t-test (* = p &lt;0,05, ** = p &lt;0,005, *** = p &lt;0,001).

<ol><li>Krühn, A., Wang, A., Fruehauf, J. H., Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+short+hairpin+RNAs+by+transkingdom+RNA+interference+modulates+the+classical+ABCB1-mediated+multidrug-resistant+phenotype+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Delivery of short hairpin RNAs by transkingdom RNA interference modulates the classical ABCB1-mediated multidrug-resistant phenotype of cancer cells.</a> Cell Cycle. 8, 3349-3354 (2009).</li>
<li>Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MDR1%2FP-glycoprotein+%28ABCB1%29+as+target+for+RNA+interference-mediated+reversal+of+multidrug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">MDR1/P-glycoprotein (ABCB1) as target for RNA interference-mediated reversal of multidrug resistance.</a> Curr. Drug Targets. 7, 813-821 (2006).</li>
<li>Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+cancer+multidrug+resistance%3A+a+still+unsolved+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">An overview of cancer multidrug resistance: a still unsolved problem.</a> Cell. Mol. Life Sci. 65, 3145-3167 (2008).</li>
<li>Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+RNA+interference+in+drug-resistant+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Fut.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of RNA interference in drug-resistant cancers.</a> Fut. Oncol. 5, 169-185 (2009).</li>
<li>Nguyen, T. A., Fruehauf, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transkingdom+RNA+interference+%28tkRNAi%29%3A+a+novel+method+to+induce+therapeutic+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Transkingdom RNA interference (tkRNAi): a novel method to induce therapeutic gene silencing.</a> Methods Mol. Biol. 514, 27-34 (2009).</li>
<li>Nieth, C., Priebsch, A., Stege, A., Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+classical+multidrug+resistance+%28MDR%29+phenotype+by+RNA+interference+%28RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Modulation of the classical multidrug resistance (MDR) phenotype by RNA interference (RNAi.</a> FEBS Lett. 545, 144-150 (2003).</li>
<li>Stege, A., Priebsch, A., Nieth, C., Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+and+complete+overcoming+of+MDR1%2FP-glycoprotein-mediated+multidrug+resistance+in+human+gastric+carcinoma+cells+by+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Stable and complete overcoming of MDR1/P-glycoprotein-mediated multidrug resistance in human gastric carcinoma cells by RNA interference.</a> Cancer Gene Ther. 11, 699-706 (2004).</li>
<li>Stein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+in+vivo+reversal+of+the+multidrug+resistance+%28MDR%29+phenotype+by+jet-injection+of+anti-MDR1+short+hairpin+RNA-encoding+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Complete in vivo reversal of the multidrug resistance (MDR) phenotype by jet-injection of anti-MDR1 short hairpin RNA-encoding plasmid DNA.</a> Mol. Ther. 16, 178-186 (2008).</li>
<li>Xiang, S., Fruehauf, J., Li, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+hairpin+RNA-expressing+bacteria+elicit+RNA+interference+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Short hairpin RNA-expressing bacteria elicit RNA interference in mammals.</a> Nat. Biotechnol. 24, 697-702 (2006).</li>
</ol>

Le nombre de cellules ensemencées pour l&#39;infection et la MOI correspondants utilisés, dépendent essentiellement sur les lignées cellulaires sous observation et leur vitesse de croissance. Pour trouver le nombre de cellules optimales pour le semis, pré-expériences pour déterminer la vitesse de croissance sont fortement recommandées. Outre cela, IAM de différents doivent être testés en raison de la limite d&#39;étendre à laquelle les cellules peuvent se l&#39;invasion bactérienne sans mourir de stress. Le point optima...

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Biochrom AG</td><td>214050</td><td></td></tr><tr><td>Amphotéricine B</td><td>Biochrom AG</td><td>A2612</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (PBS 10 x)</td><td>Invitrogen GmbH</td><td>14080048</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; ceq221</td><td>Cequent Pharmaceuticals Inc.</td><td></td><td>Aucun catalogue disponible, commande directe</td></tr><tr><td>Gentamicine</td><td>Biochrom AG</td><td>A2710</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Invitrogen GmbH</td><td></td><td>Contient 5 000 unités de pénicilline (base) et 5 000 &amp;mu;g de streptomycine (base)/ml, utilisant de la pénicilline G (sel de sodium) et du sulfate de streptomycine dans une solution saline à 0,85 %.</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Merck KgaA</td><td>1064060500</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Difco Laboratories</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>Difco Laboratories</td><td>212750</td><td></td></tr></tbody></table>

livraison bactérienne de l&#39;arni effectors: transkingdom arni

Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

L&#39;interférence ARN (ARNi) représente un mécanisme de haute efficace pour l&#39;inhibition spécifique de l&#39;expression de l&#39;ARNm. Outre son potentiel comme outil de laboratoire puissant, la voie de l&#39;ARNi semble être prometteuse pour l&#39;utilisation thérapeutique. Pour le développement de l&#39;interférence ARN (ARNi) basé sur les thérapies, la livraison de l&#39;ARNi médiation des agents à des cellules cibles est l&#39;un des obstacles majeurs. Une nouvelle stratégie pour surmonter cet obstacle est transkingdom ARNi (tk ARNi). Cette technologie utilise des bactéries non pathogènes, par exemple, Escherichia coli, pour produire et livrer en épingle à cheveux courts ARN thérapeutiques (shRNA) dans les cellules cibles pour induire l&#39;ARNi. Une première génération tk ARNi médiation vecteur, TRIP, contient le promoteur du bactériophage T7 pour régulation de l&#39;expression d&#39;un shRNA thérapeutiques d&#39;intérêt. Par ailleurs, TRIP a le locus Inv partir de Yersinia pseudotuberculosis qui encode invasine, qui permet naturelle des bactéries non invasives d&#39;entrer β1-intégrine-positif cellules de mammifères et le gène HlyA partir de la bactérie Listeria monocytogenes, qui produit listériolysine O. Cet enzyme permet le shRNA thérapeutiques pour échapper à d&#39;entrée des vésicules dans le cytoplasme de la cellule cible. Construit TRIP sont introduits dans une compétents souche non pathogène Escherichia coli, qui code T7 RNA polymérase nécessaire à l&#39;promoteur T7 axée synthèse de shRNA. Une molécule cible bien caractérisé associée au cancer pour les stratégies de RNAi différents ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp). Ce ABC-transporteur agit comme une pompe d&#39;extrusion de drogue et médiatise la &quot;classique&quot; multirésistance ABCB1 médiation (MDR) phénotype des cellules cancéreuses humaines qui se caractérise par un profil de résistance croisée spécifique. ABCB1 exprimant différentes cellules cancéreuses ont été MDR traités par anti-ABCB1 shRNA vecteur d&#39;expression portant E. coli. Cette procédure a abouti à l&#39;activation des voies de l&#39;ARNi dans les cellules cancéreuses et une réglementation considérable bas de l&#39;ARNm de ABCB1 encodage ainsi que la pompe d&#39;extrusion médicament correspondant. En conséquence, l&#39;accumulation du médicament a été renforcée dans les cellules du cancer primitif résistantes aux médicaments et le phénotype MDR a été inversé. Au moyen de ce modèle les données fournissent la preuve de concept que les savoirs traditionnels ARNi est adapté à la modulation de cancer associés à des facteurs, par exemple ABCB1 dans des cellules cancéreuses humaines.

Pour le développement de l&#39;interférence ARN (ARNi) thérapies basées sur une nouvelle stratégie a été développée, transkingdom ARNi (tkRNAi). Cette technologie utilise des bactéries non pathogènes pour produire et livrer en épingle à cheveux courts ARN thérapeutiques (shRNA) dans les cellules cibles. Ici, tkRNAi a été appliquée avec succès pour le renversement de la multirésistance classique ABCB1 médiation (MDR) des cellules cancéreuses.

Livraison bactérienne de l&#39;ARNi Effectors: Transkingdom ARNi

L'interférence ARN (ARNi) représente un mécanisme très efficace pour l'inhibition spécifique de l'expression de l'ARNm. Outre son potentiel en tant qu'outil puissant de laboratoire...

Dans le procédé trans-kingdom d'interférence par ARN ou RNAi, des bactéries sont utilisées pour délivrer des ARN en épingle à cheveux courts ou des ARN ciblant le gène d'intérêt MDR1 dans ce protocole, dans des cellules cancéreuses, dans le but de silencer le gène d'intérêt par ARNi. Des bactéries Escherichia coli sont d'abord transformées avec un vecteur exprimant un ARN court sous forme de boucle (shARN). Des cellules cancéreuses positives pour bêta-1 sont ensuite ensemencées afin d'obtenir une confluence de 70 à 80 %, 24 heures après l'ensemencement. Dans l'étape suivante, les bactéries exprimant le shARN et les cellules sont co-incubées pendant deux heures.Enfin, la co-incubation est interrompue par un traitement antibiotique des cellules cancéreuses. Les résultats montrent une régulation à la baisse du gène d'intérêt au niveau de l'ARNm, des protéines et des fonctions, évaluée par PCR en temps réel, analyse par immunotransfert, tests de prolifération cellulaire et tests d'accumulation de médicaments. Le principal avantage de cette technique par rapport à d'autres procédures classiques telles que la transfection par ARNi-S-I-R, utilisant un effet oligo, réside dans la livraison efficace et directe de l'ARNi dans les cellules cibles.L'ARNi trans-royaume, ou technologie TK ARNi, utilise des souches non pathogènes d'Escherichia coli pour produire et délivrer des ARN courts en épingle à cheveux thérapeutiques, ou ARNsh, dans des cellules cibles afin d'induire un effet d'interférence par ARN. Un vecteur médiateur de première génération pour le TK ARNi, ou trip, contient le promoteur du phage bactériophage T7 permettant la régulation de l'expression d'un ARNsh thérapeutique d'intérêt. De plus, le trip contient le locus inv de Yersinia pseudotuberculosis, qui code pour l'invasine, une protéine permettant à des bactéries naturellement non invasives d'entrer dans des cellules mammales exprimant l'intégrine β1.Tripp comprend également le gène hli, A, provenant de Listeria monocytogenes, qui produit la listériolysine O. Cette enzyme permet au HRNA thérapeutique de s'échapper des vésicules d'entrée dans le cytoplasme de la cellule cible. Les constructions Trop sont introduites dans une souche compétente d'Escherichia coli non pathogène, qui code la polymérase ARN T7 nécessaire à la synthèse des ARNsh dirigée par le promoteur T7. Les bactéries et les cellules eucaryotes sont co-incubées, permettant aux bactéries d'entrer dans les cellules eucaryotes.Les ARN SH sont libérés dans une voie d'interférence par ARN. Pour commencer cette procédure, faire croître une culture de bactéries Escherichia coli transformées avec le facteur trip exprimant l'ARN SH, sous forme de culture nocturne comme décrit dans le protocole écrit accompagnant, le jour précédent. Incuber les bactéries avec les cellules cibles en semant 25 fois 10 à la puissance 4 cellules de carcinome gastrique humain par puits dans des boîtes de 6 puits.Le nombre de cellules semées dépend de la vitesse de croissance de la lignée cellulaire ; planifiez le moment du semis de manière à ce que la confluence soit d'environ 70 à 80 % après 24 heures. Après le semis, incubez les cellules semées à 37 degrés Celsius dans une atmosphère saturée en vapeur d'eau contenant 5 % de dioxyde de carbone, pendant la nuit. Avant de commencer l'infection des cellules cancéreuses, mesurez la densité optique des cultures de la nuit contenant le vecteur d'ARNi TK dans *E. coli*.Déterminez la DO à 600 nm, diluez la solution bactérienne jusqu'à une densité optique de 0,5, 30 minutes avant la co-incubation bactérienne qui remplace le milieu de culture cellulaire contenant du FCS. Remplacez le milieu des cellules de carcinome par un milieu sans FCS pendant la période de 30 minutes. Lavez les bactéries deux fois avec du PBS 1x par centrifugation à 4 000 tr/min pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius, puis resuspendez-les dans un milieu sans sérum.L 15, milieu au volume dilué d'origine. Une fois les bactéries resuspendues et l'incubation des cellules terminée (30 minutes), ajouter les bactéries aux cellules cancéreuses à la multiplicité d'infection ou IRM souhaitée, qui devrait se situer entre 1:300 et 1:700. Incuber ensemble les bactéries et les cellules cancéreuses pendant deux heures à 37 degrés Celsius dans une atmosphère saturée en vapeur d'eau contenant 5 % de dioxyde de carbone.Après deux heures de co-incubation, laver les cellules cancéreuses deux fois avec du PBS au concentration unitaire et une fois avec des milieux L 15 contenant du sérum, supplémenté de 100 unités par millilitre de pénicilline, 100 microgrammes par litre de streptomycine et 2,5 microgrammes par millilitre.Amphotéricine à 150 microgrammes par millilitre, gentamicine à 100 microgrammes par millilitre. Peut-on continuer à cultiver les cellules cancéreuses à 37 degrés Celsius dans une atmosphère saturée en vapeur d'eau avec 5 % de dioxyde de carbone ? Les effets du traitement bactérien peuvent être visualisés par microscopie fluorescente, mesurés par RT-PCR quantitative en temps réel au niveau de l'ARNm, et analysés par immunotransfert (western blot).Des tests fonctionnels tels que l'analyse par fax et les tests de prolifération cellulaire peuvent également être utilisés. Cette image représentative a été prise trois heures après l'incubation de cellules de carcinome gastrique humain avec des bactéries exprimant un agent thérapeutique. Des bactéries S-H-R-N-A peuvent être détectées autour du noyau de la cellule traitée.Dans cette expérience, la régulation à la baisse de l'expression du gène de résistance multiple aux médicaments MDR1 a été examinée par PCR en temps réel. Une régulation à la baisse de l'ARNm de mdr1 d'environ 70 % peut être observée après traitement avec une bactérie thérapeutique. La régulation à la baisse de MDR1 s'est également produite au niveau protéique après le traitement bactérien.Les niveaux de la protéine MDR1 ont diminué au fil du temps par rapport à la lignée cellulaire témoin. L'analyse fonctionnelle basée sur les résultats du test de cytotoxicité présenté ici peut être utilisée comme indicateur du fonctionnement de l'ARNi trans-royaume, tandis qu'une lignée cellulaire résistante aux médicaments ne répond pas au traitement anticancéreux. En revanche, la même lignée cellulaire infectée par des bactéries transformées avec un plasmide exprimant un ARNh ciblant MDR1 devient sensible au médicament.Enfin, dans un test d'accumulation d'anthracycline, la lignée cellulaire cancéreuse résistante a montré une faible accumulation du médicament anticancéreux, ce qui a été observé dans les cellules cancéreuses résistantes traitées avec le MDR un SHRA une fois maîtrisé. Cette technique peut être appliquée en moins de 28 heures si elle est correctement réalisée en suivant cette procédure. D'autres techniques comme la R-T-P-C-R peuvent être utilisées afin de répondre à plusieurs questions, telles que les effets régulateurs sur le gène d'intérêt.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la manière d'appliquer l'interférence ARN trans-roi en co-incubant des bactéries exprimant des ARNth et des cellules de mammifères positives pour HRNA.

bacterial-delivery-of-rnai-effectors-transkingdom-rnai

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

l'interférence ARN (ARNi) techniques de gènes knockdown-based sont au cœur de la recherche Tribolium. Ici, nous donnons un aperçu de notre technique ARNi larvaire dans Tribolium castaneum. Larvaire ARNi est une technique simple, mais puissant qui permet d'accéder rapidement à des phénotypes perte de fonction, ce qui permet aux chercheurs d'étudier les fonctions des gènes dans divers contextes.

Larvaire interférence de l'ARN dans le rouge de la farine Beetle, Tribolium castaneum

Nous décrivons une méthode pour inhiber l’expression génique dans une population croissante de cellules E. coli à l’aide de cassettes d’expression d’ARNs ciblées par séquence délivrées par un vecteur phagémide M13.

Phage médiée Livraison de Targeted ARNs Construit pour faire tomber l&#39;expression génique dans<em&gt; E. coli</em

interférence ARN (ARNi) est un outil extrêmement précieux pour découvrir la fonction des gènes. Cependant, la capacité de cibler des gènes à l’aide de l’ARNi au cours des stades préadultes est limitée chez le principal vecteur du paludisme humain, Anopheles gambiae. Nous décrivons un protocole ARNi pour réduire la fonction des gènes par injection directe pendant le développement de la nymphe.

ARNi Trigger Livraison en<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; pupes

Ici, nous présentons des protocoles d'élevage un coléoptère intermédiaire germe, Dermestes maculatus (D. maculatus) dans le laboratoire. Nous partageons également des protocoles pour l'embryon et des parents ARNi et méthodes pour l'analyse des phénotypes embryonnaires pour étudier la fonction des gènes de cette espèce.

L'élevage et d'ARN double brin médiée Gene Knockdown dans le Hide Beetle, Dermestes maculatus

Cet article explique les nouvelles techniques mises au point pour l’administration orale de l’ARN double brin (dsRNA) à travers les tissus vasculaires des plantes pour l’interférence ARN (ARNi) en sève nourrir les insectes.

Méthodes de prestation orale ARN double-brin d’induire l’interférence d’ARN dans le phloème et insectes hémiptères plante-sap-alimentation

L’interférence de l’ARN est une technique puissante et largement applicable pour manipuler l’expression des gènes à des stades de développement spécifiques. Ici, nous décrivons les étapes nécessaires pour mettre en œuvre cette technique dans le coléoptère de plongée aquatique Thermonectus marmoratus, de l’acquisition de séquences génétiques à l’effondrement des gènes qui affectent la structure ou le comportement.

Interférence de l’ARN dans les coléoptères aquatiques comme un outil puissant pour manipuler l’expression des gènes à des points de temps de développement spécifiques

Un système de recombinaison médiée par λ-Red a été utilisé pour créer un mutant de délétion d’un petit micC à ARN non codant.

Un petit ARN non codant MicC contribue à la virulence des protéines de la membrane externe chez Salmonella enteritidis

L’administration orale d’ARNd produit par des bactéries, une méthode d’administration de l’interférence ARN (ARNi) couramment utilisée chez Caenorhabditis elegans, a été appliquée avec succès ici aux moustiques adultes. Notre méthode permet des études robustes de génétique inverse et des études de vecteurs bloquant la transmission sans l’utilisation de l’injection.

Administration efficace d’interférence ARN orale (ARNi) aux moustiques anophèles gambiens adultes

Inverse des approches génétiques se sont avérées extrêmement utiles pour déterminer quels gènes de résistance sous-tendent à des agents pathogènes vecteurs de moustiques. Ce protocole vidéo illustre une méthode utilisée par le laboratoire Dimopoulos à injecter dans les ARNdb Anopheles gambiae moustiques, qui abritent le parasite du paludisme. La technique de manipulation de l'installation d'injection et injection ARNdb dans le thorax est illustré.

Protocole pour des essais de l&#39;ARNi dans les moustiques adultes (A. gambiae)

Dans cette vidéo, nous montrons une procédure pour une livraison précise biolistique des réactifs dans le tissu vivre avec un canon à gènes miniatures roman. Nous sommes renversant l'expression de la nétrine axone molécule conseils dans les embryons de sangsue en fournissant des molécules d'ARN double brin dans le mur ventrale du corps et les ganglions des segments unique.

Localisé ARNi et l&#39;expression des gènes extra-utérine dans la sangsue médicinale

Découvrez la méthode tkRNAi pour la thérapie anticancéreuse utilisant des bactéries E. coli non pathogènes. Cette technique permet de livrer efficacement des shRNA thérapeutiques dans les cellules cancéreuses pour inverser la résistance multidrogue.

Livraison bactérienne de l'ARNi Effectors: Transkingdom ARNi

Explorer plus de vidéos