In utero électroporation suivie par la culture neuronale primaire pour étudier la fonction des gènes dans un sous-ensemble des neurones corticaux

L’objectif général de l’expérience suivante est d’examiner les effets sur le développement de l’inactivation ou de la surexpression de gènes dans des sous-ensembles spécifiques de cellules progénitrices neuronales dans le néocortex. Ceci est réalisé par électroporation in vivo de l’ADN dans des embryons de rat pour transfecter les cellules progénitrices néocorticales. Dans un deuxième temps, la région électroporée est disséquée afin de l’enrichir pour les cellules transfectées.

Ensuite, ces cellules sont dissociées et plaquées dans des lames de chambre et cultivées. Afin d’examiner les effets de l’altération génétique intrinsèque et de l’application de facteurs exogènes, des résultats ont été obtenus qui montrent des effets sur la croissance et la ramification des neurites sur la base de mesures quantitatives à l’aide d’un logiciel de vision. Le principal avantage de cette technique par rapport à d’autres, telles que la transfection à base de lipides de cultures neuronales primaires, est que nous pouvons cibler des sous-ensembles spécifiques de cellules progénitrices neuronales.

Par exemple, seuls les neurones glutamatergiques seront transfectés à l’aide de cette méthode. De plus, nous pouvons électro-prier aux premiers stades embryonnaires et cibler les neurones des couches profondes naissantes, ou nous pouvons électrolyser aux stades ultérieurs du développement et cibler les neurones nés plus tard qui sont destinés aux couches plus superficielles du cortex. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du neurodéveloppement.

Par exemple, comment les facteurs intrinsèques et extrinsèques interagissent-ils pour affecter la croissance et la ramification neuronales ? Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la croissance des processus neuronaux, elle peut également être appliquée à d’autres processus neurodéveloppementaux tels que la synaptogenèse, la prolifération cellulaire et la détermination des sulfates. Préparez une aiguille d’injection comme décrit dans le texte d’accompagnement.

Pour visualiser les injections, chargez l’espace restant dans l’aiguille avec de l’huile de maïs. Fixez un pico spritzer à l’aiguille chargée pour contrôler les injections. Exposez les cornes utérines d’un rat enceinte anesthésié comme décrit précédemment.

Et dans le texte accompagnant cette vidéo, l’injection d’embryons E 15 est montrée ici. Identifiez le site d’injection en éclairant les embryons à l’aide d’une lampe à col de cygne. Manipulez doucement un embryon pour trouver où se trouve la tête et localiser la suture médiane.

Utilisez-le comme point de repère pour trouver le ventricule latéral. Injectez de l’ADN à travers la paroi utérine et dans le ventricule latéral. Injectez plusieurs impulsions dans le ventricule jusqu’à ce qu’il soit rempli d’ADN.

Le vecteur déterminé par l’emplacement des électrodes est essentiel pour déterminer quelle région du néocortex est électroporée. Ici, l’électrode positive est placée près des positions médiales dorsales à travers le cerveau pour cibler cette région du cerveau antérieur. Le placement alternatif des électrodes ciblera d’autres régions du cortex, y compris le flux cortical latéral.

Injecter et électroporer chaque embryon. À son tour, ramenez les cornes utérines dans la cavité corporelle et fermez l’incision. Surveillez les animaux pendant qu’ils se remettent de l’anesthésie.

Ici, les animaux sont récoltés pour la culture 24 heures après l’électroporation, de sorte que la GFP est détectable. Retirez les embryons de l’utérus du rat euthanasié et placez-les dans une boîte de Pétri remplie de HBSS glacé avec un cation divalent dans une hotte à flux lamina. Et sous un microscope à dissection fluorescente, utilisez la pince Dumont numéro cinq.

Pour disséquer les cortex. Utilisez la pince Dumont de taille numéro trois pour enlever les méninges, allumez la fluorescence à l’aide d’une paire de ciseaux val. Coupez les régions positives à la GFP des tissus.

Transférez ces morceaux dans un tube conique de 50 millilitres rempli de HBSS glacé sans cation divalent. Récupérez tous les morceaux positifs GFP dans le tube. Retirez le HBSS du tube et remplacez-le par un millilitre de solution EDTA à 0,25 % mélangée doucement par un incubateur d’inversion à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Retirez la solution tripsin. Remplacez-le par entre un et cinq millilitres de milieu de placage en fonction de la quantité de tissu positif à la GFP. À l’aide d’une pipette à rayures de deux millilitres, on mangeait cinq à sept fois pour dissocier les cellules.

Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre, diluez avec un milieu de placage jusqu’à une concentration de deux à 3,5 fois 10 à cinq cellules par 1,5 millilitre de plaque de fluide de 1,5 millilitre dans chaque chambre d’une chambre CC à deux couches. Glisser. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant quatre heures pour permettre aux cellules d’adhérer aux lames. L’aspiration du milieu de placage contenait 1,5 millilitre de milieu neuronal par culture en chambre.

Les cellules à 37 degrés Celsius jusqu’au stade souhaité avant de procéder à l’immuno-marquage. Pour les mesures du processus neuronal. Le moment de la culture de l’excroissance varie entre 24 heures et sept jours.

Dans une hotte, aspirez le milieu de chaque chambre de culture. Fixez les cellules avec 4 % de formaldéhyde pendant 15 minutes. Laver deux fois rapidement avec une fois le PBS avant de bloquer et l’immuno observé dans les cultures comme détaillé dans le texte d’accompagnement monter les cultures avec un milieu de montage fluorescent et une lamelle.

Visualisez les cultures à 20 x sous un microscope fluorescent. Enregistrer des images de neurones positifs à la GFP pour analyse. Nous avons constaté qu’avec cette technique, environ 75 % des cerveaux électroporés sont ciblés sur la région souhaitée du cortex, qu’il s’agisse du cortex médial dorsal ou du cortex latéral ventral.

Nous avons constaté que l’électroporation précoce en E 13 à 14 cible les neurones de la couche profonde tels que le TBR, un neurone positif de la couche six, tandis que l’électroporation ultérieure cible CT IP, deux TBR positifs, une couche négative de cinq cellules, puis plus tard, l’électroporation cible BRN deux couches positives, deux barres obliques, trois cellules. Ici, nous montrons des coupes coronales de cerveaux électroporées au jour embryonnaire 15,5 ou 17,5 et récoltées au cinquième jour postnatal. En culture, le pourcentage de cellules positives à la GFP peut varier considérablement en fonction de votre degré de prudence lors de la dissection de la région positive à la GFP.

Cependant, même lorsque nous sommes très conservateurs et que nous ne disséquons que la partie positive de la GFP des cellules, le pourcentage le plus élevé que nous observons est de 5 à 10 %. Cette faible efficacité de transfection est utile pour identifier les processus appartenant à la cellule électroporée que vous analysez. Le placage des cellules à cette densité plus élevée contribue à avoir des cultures plus saines. Cependant, il est difficile de discerner quel processus appartient à quel corps cellulaire dans les cellules négatives à la GFP.

Suite à cette procédure, l’immunocoloration peut être effectuée pour plusieurs marqueurs différents afin de répondre aux questions concernant la prolifération, la synaptogenèse et la détermination des sulfates. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’utiliser des réactifs et des outils stériles pour prévenir la contamination et l’infection Une fois maîtrisé. Chaque aspect de cette technique peut être réalisé en deux à trois heures s’il est effectué correctement.

Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé. Bonne chance dans vos expériences.