Name: Enregistrements Patch Clamp à partir de neurones rétiniens souris dans une préparation adaptés à lobscurité Slice (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-12T19:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Apprenez l'enregistrement patch clamp sur tranches de rétine de souris adaptées à l'obscurité pour étudier les voies de signalisation rétiniennes. Cette méthode permet de mesurer les réponses évoquées par la lumière et la libération de glutamate.

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Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH EY17606 (APS).

1. Électrodes Préparation <ol><li> Préparer les électrodes d'enregistrement et de référence en les trempant dans deux 1M de NaCl et de conduite 15V entre eux utilisant une onde sinusoïdale de 1 Hz pour ~ 20 s. </li><li> Faire les électrodes d'enregistrement à l'aide d'un tire-micropipette (Sutter Instruments P-97). Pour les pipettes de patch-utiliser un verre borosilicate avec un diamètre extérieur de 1,2 mm et un diamètre intérieur de 0,69 mm (Sutter Instruments, Cat # B120-69-10). Mesurer la résistance série à travers la pointe de l'électrode. Basé sur la taille des cellules cibles choisir un diamètre de pointe de la pipette, car les corps cellulaires ~ 20 um d'utilisation diamètre ~ 5 MW pour les corps cellulaires ~ 5 um d'utilisation de diamètre ~ 12 MQ. </li><li> Préparez-chaussée / électrodes de référence. En utilisant une seringue de remplir un tube en polyéthylène petite section (Intramedic, PE205) avec 1 mM de NaCl qui comprend Agar 3,5% (Sigma, Cat # A7002) dans NaCl 1M. Placez ce pont agar sur l'électrode de référence Ag / AgCl. </li></ol> 2. La préparation de solutions <ol><li> Solution du bain externe, «les médias contenant du bicarbonate (1 L): 1 bouteille de Ames Ames Moyenne (Sigma, Cat # A1420), 1,9 g de NaHCO 3, 7 ml de pénicilline-streptomycine (Sigma, Cat # P0781) pour empêcher des bactéries la croissance. Ajustez l'osmolarité à ~ 280 mOsm. </li><li> Tranchage solution, «support contenant le tampon HEPES pH (1 L): 1 bouteille de Ames Ames moyen, 0,887 g de NaCl, 2,38 g d'HEPES, 7 ml de pénicilline-streptomycine. Ajuster le pH à 7,4 en utilisant ~ 1M NaOH et / ou HCl 1M. Ajustez l'osmolarité à ~ 280 mOsm. </li><li> Potassium-aspartate (K-Asp), pipeter solution interne (en mM): 125 K-aspartate, 10 KCl, 10 HEPES, 5 NMG-HEDTA, 0,5 CaCl2, une ATP-Mg, 0,2 GTP-Mg; pH est ajusté à ~ 7.3 avec NMG-OH, et l'osmolarité est ajusté à ~ 280 mOsm. </li><li> Filet Agar pour la stabilisation de basse température de gélification agarose contenant de la rétine (5% en poids), 7,5 g d'Agar (Sigma, Cat # A7002) fondu dans 150 ml de dH 2 O. </li></ol> 3. Journée de l'expérience <ol><li> Dégel ~ 1,5 ml de K-Asp solution interne et le fluorophore de votre choix du congélateur. Diluer le fluorophore à la concentration appropriée, qui doit être déterminée empiriquement. </li><li> Verser les médias Ames contenant NaHCO 3 (~ 200 ml) dans le conteneur de stockage étanche à la lumière puis placez-le dans le bain d'eau (30-32 ° C) et s'équilibrer avec 5% de CO 2 / 95% d'O 2 du gaz </li><li> Remplissez la bouteille avec ~ 110 mL de milieu d'Ames contenant HEPES, placer sur la glace et équilibrer avec 100% d'O 2. </li><li> Placez le support restant Ames contenant NaHCO 3 dans un réservoir chauffé au-dessus de la cage de Faraday, et s'équilibrer avec 5% de CO 2 / 95% d'O 2 du gaz. Parafilm peut être utilisé pour piéger le gaz dans l'espace ci-dessus la solution. </li><li> Préparer la faible température de gélification agarose (3%) en ajoutant 0,75 g (Sigma, Cat # A0701) à 25 ml de milieu d'Ames »avec HEPES et chauffer la solution à ~ 115 ° C pour faire fondre l'agarose. Remuer jusqu'à ce que la solution claire, sans bulles, et stocker dans un bain d'eau (~ 42 ° C). </li><li> Remplir une pipette d'enregistrement avec la solution K-Asp interne et vérifier la résistance de pointe. </li></ol> 4. Commencez l'expérience <ol><li> Euthanasier la souris et supprimer rapidement les yeux avec des ciseaux courbes. Des lunettes à infrarouge doit être utilisé pour toutes les procédures visant à prévenir le blanchiment du pigment visuel. </li><li> Placez les yeux sur un morceau de papier filtre pour les empêcher de rouler, et en utilisant un mince lame à double face, faire une fente dans la cornée de l'œil tout en maintenant avec la pince. </li><li> Dès le globe oculaire est percé, le transfert de leur oeil dans un plat rempli de média Ames. </li><li> Utilisation de la fente de la cornée comme un point d'entrée, petits ciseaux sont utilisés pour couper les portions restantes de la cornée, après quoi le cristallin et du vitré peut être enlevé. Veillez à ce que la rétine reste attaché à l'œilleton, et de stocker l'œilleton dans l'obscurité à 32 ° C dans les médias équilibrée avec 5% de CO 2 / 95% O 2 Ames. </li></ol> 5. Tranchage <ol><li> Hemisect l'un des œilletons et dissocier la rétine de l'épithélium pigmentaire rétinien. Retirer les bords de la rétine afin de permettre le tissu à plat. </li><li> Utilisez une petite pipette Pasteur en verre avec une ampoule de latex pour remplir un plat de Pétri de 35 mm avec de l'agar fondu, et faites glisser la pince travers grâce à l'agar-agar pour tester sa cohérence. </li><li> Lorsque vous pouvez commencer à voir la gélose se solidifier: <ol class="lalpha"><li> Transfert de la rétine au sommet de l'agar-agar. </li><li> Utilisez un morceau tordu de Kimwipe pour absorber l'excès de solution autour de la rétine. </li><li> Placer 2-3 gouttes d'Agar directement sur la rétine et de placer rapidement un cylindre en plastique sur la rétine pour former un mur autour d'elle. Puis au goutte à goutte supplémentaires gélose fondue sur les côtés du cylindre en plastique tout en centrant la rétine dans l'agar. </li><li> Transférer la boîte de Petri to un bain d'eau glacée pour se rafraîchir. </li></ol></li><li> Après ~ 45 secondes enlever le tissu du bain d'eau glacée et l'utilisation d'un piston pour extruder la gélose de bloc hors du cylindre en plastique, poussant du côté le plus éloigné de la rétine. </li><li> Utilisez la lame de rasoir unilatérale de couper un petit bloc de gélose contenant de la rétine et la superglue le bloc en place contre la butée gélose sur la platine. </li><li> Transfert du disque spécimen sur le plateau vibrant microtome et versez glacée HEPES Ames dans le bac permettant le bloc avec la rétine pour être pleinement immergé. </li><li> Tranches de la rétine avec une épaisseur de ~ 200 um peut être coupé au taux maximum de la lame vibrante et une vitesse de lame vers l'avant ensemble tel que cela prend 4 à 5 secondes pour couper à travers la rétine sur chaque tranche. </li><li> Utilisez une lame de bistouri n ° 11 pour supprimer chaque une tranche utilisable à la fois </li><li> Bonne tranches contenant la rétine sont placés dans des chambres d'enregistrement et sont lestés avec des ancres tranche avec fils de nylon en les croisant. Le fils de nylon maintenez enfoncée la gélose entourant la rétine, laissant la rétine dégagée pour les enregistrements. </li><li> Transférer la chambre d'enregistrement de la platine du microscope debout, fermer le rideau et tourner sur la source de lumière infrarouge pour voir la tranche sur une caméra infrarouge sensible. </li></ol> 6. Enregistrement <ol><li> Une fois une bonne tranche de rétine (avec des photorécepteurs intact et l'angle de coupe appropriée) est identifié commencent perfusant la rétine à un taux supérieur à 5 mL / min avec les médias chauffés Ames qui est chauffé à 35 37 ° C et équilibrée avec 5% de CO 2 / 95% d'O 2. </li><li> Quelques dégâts de surface peut être apparente en raison du processus de tranchage. Cette couche généralement mince de cellules peuvent être retirés à l'aide d'une pipette avec une pointe cassée, et doucement sucer enlever les corps des cellules mortes. Ce sera généralement révèlent des cellules vivantes en dessous. Identifier un corps cellulaire saine, dont la position se situe dans les strates d'intérêt. </li><li> Remplir une micropipette avec la solution Kasp internes et d'appliquer positif (vers l'extérieur) de pression à travers la pointe de la pipette, et inférieure de la pointe de la pipette dans la chambre d'enregistrement et jusqu'au niveau de la cellule à l'aide d'un micromanipulateur. </li><li> Placez l'extrémité de la pipette de telle sorte qu'il fossettes de la membrane cellulaire, et appliquer doucement négatives (flux entrants) de pression pour faire un joint à haute résistance. Cellules entières mode peut être obtenu en appliquant une pression négative à l'électrode de pénétrer dans la cellule. </li><li> Stimuler le tissu rétinien utilisant des LED peut alors évoquer des réponses à la lumière. </li><li> Photographie de la cellule à partir de laquelle l'enregistrement a été réalisé en évoquant la fluorescence du fluorophore dans la pipette solution interne. </li></ol> 7. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/2107/2107fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Ici, la lumière des potentiels évoqués d'une adaptés à l'obscurité neurone rétinien d'éclairs de lumière de force croissante sont présentés. <img src="/files/ftp_upload/2107/2107fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Image de fluorescence d'une tranche où les cellules rétiniennes ont été remplis avec du fluorophore, Lucifer Yellow. Fluorescence évoqués montre la morphologie des cellules à partir desquelles des enregistrements de patch ont été faites.

<ol><li>Weblin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+along+and+between+rods+in+the+tiger+salamander+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Transmission along and between rods in the tiger salamander retina.</a> J Physiol. 280, 449-470 (1978).</li>
<li>Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+connections+among+retina+neurons+in+living+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Synaptic connections among retina neurons in living slices.</a> J Neurosci Methods. 20, 139-149 (1987).</li>
<li>Rieke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+contrast+adaptation+in+salamander+bipolar+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Temporal contrast adaptation in salamander bipolar cell.</a> J Neurosci. 21, 9445-9454 (2001).</li>
<li>Armstrong-Gold, C., &amp, R. ieke, F, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bandpass+filtering+at+the+rod+to+second-order+cell+synapse+in+salamander+%28Ambystoma+tigrinum%29+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Bandpass filtering at the rod to second-order cell synapse in salamander (Ambystoma tigrinum) retina.</a> J Neurosci. 23, 3796-3806 (2003).</li>
<li>Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fundamental+plan+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The fundamental plan of the retina.</a> Nat Neurosci. 4, 877-886 (2001).</li>
<li>Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+processing+in+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Parallel processing in the mammalian retina.</a> Nat Rev Neurosci. 5, 747-757 (2004).</li>
</ol>

L&#39;enregistrement tranche de rétines de vertébrés ont été faites depuis des décennies 1,2, et ont assez bien réussi à fournir une compréhension plus profonde de la façon dont les circuits rétiniens encode la lumière incidente. Les avantages de la coupe avec un microtome vibrant plutôt que directement avec une lame de rasoir, c&#39;est que les tranches de la rétine encourent moins de dégâts à la surface. Avec une pipette d&#39;aspiration, il est facile d&#39;enlever ces dommages et les cellules cibles saine...

<table><tbody><tr><td>Micro-pipeteur</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Verre borosilicaté</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>B120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>Tubulure en polyéthylène</td><td>Intramedic</td><td>PE205</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7002</td><td></td></tr><tr><td>Agarose à température de gélification basse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0701</td><td></td></tr><tr><td>Milieu d'Ames&amp;rsquo;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1420</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td></td></tr></tbody></table>

enregistrements patch clamp à partir de neurones rétiniens souris dans une préparation adaptés à l&#39;obscurité slice

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Notre expérience visuelle est déclenchée lorsque le pigment visuel dans nos photorécepteurs rétiniens absorbe les photons d&#39;énergie de la lumière et déclenche une cascade d&#39;événements intracellulaires qui conduisent à la fermeture de nucléotide cyclique-dépendants des canaux dans la membrane cellulaire. Le changement résultant dans le potentiel de membrane entraîne à son tour une réduction du montant de la libération des neurotransmetteurs à la fois de la tige et les terminaux cône synaptique. Pour mesurer la façon dont le changement de lumière évoquée dans le potentiel de membrane des photorécepteurs conduit à une activité en aval dans la rétine, les scientifiques ont fait des enregistrements électrophysiologiques de préparations tranche de la rétine pour 1,2 décennies. Dans le passé, ces tranches ont été coupées manuellement avec une lame de rasoir sur le tissu rétinien qui est attaché à un papier filtre; ces dernières années une autre méthode de découpage a été développé selon lequel le tissu rétinien est intégré dans l&#39;agar gélifiant à basse température et tranchées dans une solution fraîche avec un vibrant microtome 3,4. Cette préparation produit des tranches de la rétine avec moins de dommages de surface et des réponses très robuste lumière évoquée. Ici nous montrons comment cette procédure peut être faite sous une lumière infrarouge pour éviter le blanchiment du pigment visuel.

Nous décrivons ici une procédure pour générer adaptés à l&#39;obscurité des tranches de la rétine de souris pour les enregistrements électrophysiologiques.

Enregistrements Patch Clamp à partir de neurones rétiniens souris dans une préparation adaptés à l&#39;obscurité Slice

Notre expérience visuelle débute lorsque le pigment visuel de nos photorécepteurs rétiniens absorbe des photons d'énergie lumineuse et déclenche une cascade de...

Notre expérience visuelle commence lorsque le pigment visuel présent dans les photorécepteurs de notre rétine absorbe des photons d'énergie lumineuse, entraînant finalement la fermeture des canaux activés par les nucléotides cycliques dans la membrane cellulaire. Cela supprime la libération du neurotransmetteur glutamate à partir des bâtonnets et des cônes. Le glutamate libéré est détecté par les cellules rétiniennes en aval afin d'étudier les signaux en aval.Les yeux sont prélevés sur une souris euthanasiée. Les S sont isolés, inclus dans un bloc d'agar et sectionnés à l'aide d'un microtome vibrant. Ensuite, les sections rétiniennes sont placées sous un microscope et stimulées à l'aide d'un éclairage LED.Alors que les enregistrements en configuration patch clamp sont effectués pour mesurer les courants ou potentiels synaptiques générés, les personnes novices dans cette méthode éprouvent généralement des difficultés en raison de la complexité accrue liée au travail dans l'obscurité. Ainsi, pouvoir visualiser l'ensemble du processus permettra d'acquérir une sensation qu'il est autrement difficile de décrire.Commencez cette procédure en recouvrant les électrodes en fil métallique d'enregistrement et de référence qui seront utilisées d'une couche de chlorure d'argent. Plongez les électrodes dans du chlorure de sodium à une molaire. Ensuite, à l'aide d'une source d'alimentation de 15 volts avec une onde sinusoïdale de 1 hertz, appliquez 15 volts entre elles pendant environ 20 secondes.À l’aide d’un tireur de micropipettes, préparez des pipettes de patch à partir de verre de silice BO poli au chalumeau, en choisissant une résistance de tip de pipette en fonction de la taille des cellules cibles dont les corps cellulaires ont environ 20 micromètres de diamètre. Utilisez une pipette avec une résistance de tip de cinq à 10 mégohms pour les corps cellulaires. Pour des cellules d’environ cinq micromètres de diamètre, utilisez une résistance de tip de 12 à 15 mégohms.Pour préparer les électrodes de référence au sol, utilisez une seringue pour remplir un tube en polyéthylène avec une solution d'agar à 3,5 % préparée dans du chlorure de sodium à un millimolaire. Ensuite, préparez les solutions suivantes selon les instructions du protocole écrit joint : solution bain externe, solution de découpe, solution interne de pipette à aspartate de potassium et butée en agar.Conserver toutes les solutions à quatre degrés Celsius jusqu'à leur utilisation. Le jour de l'expérience, prélever environ 1,5 millilitre de solution interne à base d'aspartate de potassium. Puis ajouter le Fluor dilué.Verser environ 50 millilitres de milieu aims contenant du bicarbonate de sodium dans un récipient de stockage étanche à la lumière. Relier le tube en plastique à une bouteille de gaz contenant 5 % de dioxyde de carbone et 95 % d’oxygène afin d’équilibrer le milieu aims avec le gaz, puis placer le récipient dans un bain d’eau à 30 à 32 degrés Celsius. Ensuite, remplir une bouteille avec 110 millilitres de milieu aims contenant les pois et la placer sur de la glace.Équilibrez le milieu en faisant barboter la solution avec du gaz oxygène à 100 %. Placez le milieu aimes restant contenant du bicarbonate de sodium dans un réservoir chauffé placé au-dessus de la cage de Faraday. Enveloppez du paraforme autour du tube et du bouchon de la bouteille pour piéger le gaz dans l'espace au-dessus de la solution et l'équilibrer avec un mélange de 5 % de gaz carbonique et 95 % d'oxygène.À l’aide d’un tube de dispersion d’air en verre, préparez de l’agarose à faible température de gélation à 3 % en ajoutant 0,75 gramme à 25 millilitres de milieu AIMs sous forte chaleur. La solution atteint environ 115 degrés Celsius sous agitation. Lorsque la solution devient limpide et sans bulles, placez la solution d’agarose fondue dans un bain-marie à 42 degrés Celsius.Installez la chambre d’enregistrement sur le microscope inversé. Faites glisser un pont d’agarose de cinq centimètres sur l’électrode de référence en argent/chlorure d’argent et positionnez-le dans la chambre d’enregistrement. La résistance de la pointe de la pipette peut être mesurée en remplissant une pipette avec la solution interne, en la plaçant sur le porte-pipette, en insérant le porte-pipette dans le support amplificateur, puis en abaissant la pipette dans la solution. Pour préserver le pigment visuel lors des enregistrements physiologiques, toutes les procédures doivent être effectuées sous lumière infrarouge à l’aide de lunettes infrarouges, bien que toutes les étapes soient ici illustrées en lumière ambiante.Après l'euthanasie de la souris, utilisez des ciseaux courbes pour retirer rapidement les yeux. Placez les yeux sur un morceau de papier filtre afin d'empêcher qu'ils ne roulent. Ensuite, maintenez un œil en place avec une pince et utilisez une lame fine double tranchant pour pratiquer une fente dans la cornée.Dès que le globe oculaire est perforé, transférez l’œil dans une boîte de Pétri de 60 millimètres remplie de milieu AIMs. En utilisant l’incision dans la cornée comme point d’entrée, utilisez de petites ciseaux pour découper les parties restantes de la cornée.Ensuite, retirez le cristallin et l'humeur vitrée, en veillant à ce que la rétine reste attachée à la cupule oculaire. Placez-la dans un récipient imperméable à la lumière rempli de milieu AIMs équilibré avec 5 % de dioxyde de carbone dans 95 % d'oxygène à 32 degrés Celsius.Ensuite, sectionner l'hémisphère à l'aide d'une lame de bistouri n°10 sur l'une des coupes oculaires. Séparer la rétine de l'épithélium pigmentaire rétinien.Retirez les bords de la rétine pour permettre au tissu de s'aplatir. Utilisez une petite pipette en verre pour pâtes munie d'une poire en latex pour remplir une boîte de Pétri de 35 millimètres avec de l'agar fondu à faible température de gélification, puis faites glisser la pince dans l'agar pour en tester la consistance. Dès que l'agar commence à durcir, transférez la rétine sur la surface de l'agar.Ensuite, sans toucher à la rétine, utilisez un morceau de papier absorbant Kimwipes tordu pour absorber la solution excédentaire autour de celle-ci. Ajoutez directement sur la rétine deux à trois gouttes supplémentaires d'agar et placez rapidement un cylindre en plastique pour former une paroi autour de la rétine, tout en maintenant celle-ci près du centre du cylindre ; ajoutez goutte à goutte de l'agar fondu supplémentaire, puis transférez la boîte de Pétri dans un bain d'eau glacée pour refroidir. Après 30 secondes, retirez le tissu et utilisez un piston pour extraire le bloc d'agar en poussant depuis le côté le plus éloigné de la rétine.Utilisez une lame de rasoir à un seul tranchant pour découper un petit bloc d'agar contenant la rétine, puis fixez-le avec de la colle cyanoacrylate contre le butoir en agar sur le disque d'échantillon. Transférez le disque d'échantillon sur le porte-objet du microtome vibrant et versez de l'AIMS glacé en abondance dans le réservoir, en veillant à ce que le bloc contenant la rétine soit complètement immergé. Découpez des tranches rétiniennes d'une épaisseur d'environ 200 microns en utilisant la fréquence maximale de vibration de la lame et une vitesse d'avancement réglée de manière à ce qu'il faille entre quatre et cinq secondes pour traverser entièrement la rétine.Utilisez une lame de scalpel numéro 11 pour découper chaque tranche utilisable à partir du bloc, une par une. Placez les tranches contenant la rétine dans des chambres d'enregistrement et maintenez-les fermement. À l'aide d'ancres pour tranches, fixez les fils de nylon qui traversent l'ancrage.Appuyez fermement sur l'agar autour de la rétine, en laissant la rétine dégagée. Pour les enregistrements. Transférez la chambre d'enregistrement sur la platine du microscope droit.Fermez le rideau et allumez la source de lumière infrarouge pour visualiser la coupe sur une caméra sensible à l'infrarouge. Sous le microscope, identifiez une coupe rétinienne présentant des photorécepteurs intacts à l'angle de coupe approprié. Des dommages superficiels peuvent être apparents en raison du processus de découpe.À l’aide d’une pipette dont la pointe est cassée, aspirez délicatement les corps cellulaires morts. Pour éliminer cette fine couche de cellules, une fois qu’une couche saine de cellules vivantes est visible, identifiez un corps cellulaire situé dans la strate d’intérêt. Déplacez la pointe de la pipette de manière à créer une légère déformation de la membrane cellulaire, puis appliquez une pression négative ou entrante douce afin d’obtenir un scellement à haute résistance. Le mode « cellule entière » peut être obtenu en appliquant une pression négative à l’électrode pour pénétrer l’intérieur de la cellule.Ensuite, stimulez le tissu rétinien avec de la lumière à l'aide de DEL afin d'évoquer des réponses. À la fin de l'enregistrement, capturez une image en utilisant la lumière d'excitation appropriée pour le fluorophore qui a diffusé dans la cellule à partir de la solution interne de la pipette. Ici, les potentiels évoqués par la lumière d'un neurone rétinien adapté à l'obscurité, en réponse à des éclairs lumineux d'intensité croissante, sont illustrés.Cette figure est une image de fluorescence prise sur une coupe rétinienne où les cellules ont été remplies avec le fluorochrome Lucifer yellow ; la fluorescence induite montre la morphologie des cellules à partir desquelles des enregistrements en mode patch ont été réalisés. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une meilleure compréhension de certaines des complexités liées à l'obtention d'enregistrements en électrode à patch sur des tranches rétiniennes adaptées à l'obscurité. L'objectif de cette procédure est de mesurer les réponses induites par la lumière dans des conditions d'illumination contrôlées.Pour ce faire, nous devons d'abord isoler la rétine, l'incorporer dans de l'agar et préparer ensuite des tranches rétiniennes à partir desquelles nous pouvons effectuer des enregistrements unitaires.

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