Enregistrements Patch Clamp à partir de neurones rétiniens souris dans une préparation adaptés à l'obscurité Slice

Notre expérience visuelle commence lorsque le pigment visuel de nos photorécepteurs rétiniens absorbe des photons d’énergie lumineuse, conduisant finalement à la fermeture des canaux cycliques nucléotidiques dans la membrane cellulaire. Cela supprime la libération du neurotransmetteur glutamate à partir des bâtonnets et des cônes. Le glutamate libéré est détecté par les cellules rétiniennes en aval pour étudier les signaux en aval.

Les yeux sont retirés d’une souris euthanasiée. Les S sont isolés, noyés dans un bloc de gélose et tranchés à l’aide d’un microtome vibrant. Ensuite, les coupes rétiniennes sont placées sous un microscope et stimulées par un éclairage LED.

Tandis que des enregistrements de patch clamp sont pris pour mesurer les courants ou potentiels synaptiques générés. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal à travailler dans l’obscurité en raison des complexités supplémentaires. Ainsi, être capable de visualiser l’ensemble du processus donnera une sensation qui est autrement difficile à décrire.

Commencez cette procédure en recouvrant les électrodes des fils d’enregistrement et de référence qui seront utilisées avec une couche de chlorure d’argent. Trempez les électrodes dans une molaire de chlorure de sodium. Ensuite, en utilisant une source d’alimentation de 15 volts avec une onde sinusoïdale d’un hertz, pilotez 15 volts entre eux pendant environ 20 secondes.

À l’aide d’un extracteur de micro-pipettes, préparez des pipettes patch à partir de verre de silice BO poli au feu, en choisissant une résistance de pointe de pipette basée sur la taille des cellules cibles pour les corps cellulaires d’environ 20 microns de diamètre. Utilisez un tuyau en PET avec une résistance de pointe de cinq à 10 méga ohms pour les corps de cellules. Après environ cinq microns de diamètre, utilisez une résistance de pointe de 12 à 15 méga ohms.

Pour préparer les électrodes de référence à la terre, utilisez une seringue pour remplir le tube de polyéthylène avec une solution de gélose à 3,5 % préparée dans un chlorure de sodium millimolaire. Ensuite, préparez les solutions suivantes selon les instructions du protocole écrit qui l’accompagne. Solution de tranchage de la solution de bain externe, solution interne de pipette d’aspartate de potassium et butée anti-géloses.

Conservez toutes les solutions à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles soient nécessaires. Le jour de l’expérience, Thor a bu environ 1,5 millilitre de solution interne d’aspartate de potassium. Ajoutez ensuite du Fluor dilué.

Versez environ 50 millilitres de milieu à base de bicarbonate de sodium dans le récipient de stockage étanche à la lumière. Connectez le tube en plastique à un réservoir de gaz contenant 5 % de dioxyde de carbone et 95 % d’oxygène pour équilibrer le média visé avec le gaz, puis placez le récipient dans un bain-marie de 30 à 32 degrés Celsius. Ensuite, remplissez une bouteille de 110 millilitres de buts, un moyen contenant des pois et placez-le sur de la glace.

Égalisez le milieu en faisant bouillonner la solution avec 100 % d’oxygène gazeux. Placez le milieu aimes restant contenant du bicarbonate de sodium dans un réservoir chauffé au-dessus de la cage de Faraday. Enroulez le paraform autour du tube et du bouchon de la bouteille pour piéger le gaz dans l’espace au-dessus de la solution et équilibrez avec 5 % de dioxyde de carbone et 95 % d’oxygène gazeux.

À l’aide d’un tube de dispersion d’air en verre, préparez des aros à basse température de gélification de 3 % en ajoutant 0,75 gramme à 25 millilitres de cibles moyennes avec beaucoup de chaleur. La solution est d’environ 115 degrés Celsius en remuant. Lorsque la solution devient claire sans bulles, placez la solution de gélose fondue dans un bain-marie à 42 degrés Celsius.

Installez la chambre d’enregistrement sur le microscope inversé. Faites glisser un pont de gélose de cinq centimètres sur l’électrode de référence en argent et en chlorure d’argent et placez-la dans la chambre d’enregistrement. La résistance de la pointe de la pipette peut être mesurée en remplissant une pipette avec une solution interne, en la plaçant sur le support de pipette, en plaçant le support de pipette dans l’étage de tête de l’amplificateur et en abaissant la pipette dans la solution pour préserver le pigment visuel pour les enregistrements physiologiques, toutes les procédures doivent être effectuées sous lumière infrarouge à l’aide de lunettes infrarouges, mais toutes les procédures seront montrées ici à la lumière ambiante.

Une fois la souris euthanasiée, utilisez des ciseaux incurvés pour retirer rapidement les yeux. Placez les yeux sur un morceau de papier filtre pour éviter qu’ils ne roulent. Tenez ensuite un œil en place avec une pince et utilisez une fine lame à double face pour faire une fente dans la cornée.

Dès que le globe oculaire est perforé. Transférez l’œil dans une boîte de Pétri de 60 millimètres remplie de cibles moyennes. En utilisant la fente dans la cornée comme point d’entrée, utilisez de petits ciseaux pour couper les parties restantes de la cornée.

Retirez ensuite le cristallin et l’humeur vitrée, en vous assurant que la rétine reste attachée à l’œilleton. Placez-le dans un récipient étanche léger rempli de buts. Milieu équilibré avec 5 % de dioxyde de carbone dans 95 % d’oxygène à 32 degrés Celsius.

Suivant hemis sec. L’un des œilletons à l’aide d’une lame de scalpel numéro 10. Séparez la rétine de l’épithélium pigmentaire rétinien.

Retirez les bords de la rétine pour permettre au tissu de vivre à plat. Utilisez une petite pipette à pâtes en verre avec une poire en latex pour remplir une boîte de Pétri de 35 millimètres avec de la gélose fondue à basse température et faites glisser la pince à travers la gélose pour tester sa consistance. Une fois que la gélose commence à se solidifier, transférez la rétine vers le haut de la gélose.

Ensuite, sans toucher la rétine, utilisez un morceau torsadé de lingette Kim pour absorber l’excès de solution autour de celle-ci. Placez deux à trois gouttes supplémentaires de gélose directement sur la rétine et placez rapidement un cylindre en plastique pour former une paroi autour d’elle tout en maintenant la rétine près du centre du cylindre goutte à goutte dans de l’agar-gélose fondue supplémentaire, transférez la boîte de Pétri dans un bain d’eau glacée pour refroidir. Après 30 secondes, retirez le tissu et utilisez un piston pour extruder le bloc de gélose, en poussant du côté le plus éloigné de la rétine.

Utilisez une lame de rasoir unilatérale pour découper un petit bloc de gélose contenant la rétine et collez le bloc en place contre le butée de gélose sur le disque d’échantillon. Transférez le disque d’échantillon sur l’arbre à microtomes vibrant et versez des tas de cibles glacées dans l’arbre, permettant au bloc avec la rétine d’être complètement immergé. Coupez des tranches rétiniennes d’une épaisseur d’environ 200 microns en utilisant le taux de vibration maximal de la lame avec une vitesse de lame vers l’avant réglée de telle sorte qu’il faut quatre à cinq secondes pour couper la rétine. Une fois.

Utilisez une lame de scalpel numéro 11 pour couper chaque tranche utilisable du bloc une à la fois. Placez les tranches contenant la rétine dans les chambres d’enregistrement et maintenez-les enfoncées. À l’aide d’ancrages de tranche, les fils de nylon croisent l’ancrage de tranche.

Maintenez la gélose autour de la rétine, laissant la rétine dégagée. Pour les enregistrements. Transférez la chambre d’enregistrement sur la platine du microscope vertical.

Fermez le rideau et allumez la source de lumière infrarouge pour voir la tranche sur une caméra sensible aux infrarouges. Au microscope, identifiez une tranche rétinienne avec des photorécepteurs intacts à l’angle de coupe approprié. Certains dommages de surface peuvent être apparents en raison du processus de tranchage.

À l’aide d’une pipette à l’extrémité cassée, aspirez doucement les corps cellulaires morts Pour éliminer cette fine couche de cellules, une fois qu’une couche saine de cellules vivantes a été révélée, identifiez un corps cellulaire dont la position est située dans les strates d’intérêt. Déplacez la pointe de la pipette de manière à ce qu’elle creuse la membrane cellulaire et appliquez une pression douce, négative ou vers l’intérieur pour obtenir un joint à haute résistance. Le mode cellule entière peut être obtenu en appliquant une pression négative sur l’électrode pour pénétrer dans la cellule.

Ensuite, stimulez le tissu rétinien avec de la lumière à l’aide de LED pour évoquer des réponses. À la fin de l’enregistrement, capturez une image en utilisant la lumière d’excitation appropriée pour le fluor qui s’est dialysé dans la cellule à partir de la solution interne de la pipette. Ici, les potentiels évoqués par la lumière d’un neurone rétinien adapté à l’obscurité à des éclairs de lumière de force croissante sont montrés.

Cette figure est une image de fluorescence prise à partir d’une coupe rétinienne où les cellules ont été remplies de la fluorescence évoquée par le jaune Fluor Lucifer montre la morphologie des cellules à partir desquelles des enregistrements de patch ont été effectués. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une meilleure compréhension de certaines des complexités de la réalisation d’enregistrements de patch-clamp à partir de tranches rétiniennes adaptées à l’obscurité. Le but de cette procédure est de mesurer les réponses évoquées de la lumière sous éclairage contrôlé.

Pour ce faire, nous devons d’abord isoler la rétine, l’intégrer dans une tarière, puis préparer des coupes rétiniennes à partir desquelles nous pouvons faire des enregistrements de cellules uniques.