Visualisation des larves nerfs segmentaires en 3 ^Rd Instar Drosophile Les préparatifs des larves

Le transport axonal peut être étudié en visualisant les nerfs segmentaires des larves. Une drosophile de troisième stade larvaire. La larve est d'abord disséquée, exposant le SNC sans endommager les lobes optiques, le ganglion ventral et les nerfs segmentaires.

La deuxième étape de la procédure consiste à fixer la lave au formaldéhyde avant une incubation avec l'anticorps primaire toute la nuit, puis avec l'anticorps secondaire pendant une heure à l'abri de la lumière. La lave est ensuite montée sur une lame de verre pour observer les défauts du transport axonal. La localisation et la distribution des protéines peuvent être examinées par microscopie en immunofluorescence.

Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur le transport axonal, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, tels que la morphologie des synapses et des muscles. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car il est initialement difficile d'effectuer cette dissection admissible, en particulier pour maintenir intacts les nerfs segmentaires cérébraux et les muscles. Pour commencer cette procédure, préparez un tampon de dissection fixateur à 1×, du PBT à 1× et une solution d'albumine sérique de bœuf (BSA) à 5 %.

Comme indiqué dans le tableau présenté avant la dissection, rassemblez une paire propre de pinces n°5, une paire propre de ciseaux droits en forme d'éventail et des épingles pour commencer la dissection. Utilisez une micro-spatule pour recueillir les larves étoilées de troisième stade ayant un génotype spécifique dans une boîte de Pétri. Lavez ensuite les larves en les rinçant dans une boîte de Pétri remplie d'eau déionisée afin d'éliminer tout résidu de nourriture.

Placez ensuite une larve sur la boîte de Petri S, côté dorsal vers le haut. Fixez la larve à ses extrémités antérieure et postérieure. Déposez une goutte de solution de dissection fraîche sur la larve fixée à l’aide de fines ciseaux.

Pincer la larve sur la ligne médiane dorsale près de l'extrémité postérieure. À l’aide des ciseaux, couper l’exosquelette de la larve depuis l’extrémité postérieure jusqu’à l’extrémité antérieure. Déposer une goutte de nouveau tampon de dissection une fois sur la larve disséquée.

À l’aide d’une épingle, saisissez un bord latéral de la cuticule près du milieu de la larve et fixez la cuticule à l’aide d’une autre épingle. Utilisez deux épingles de chaque côté latéral pour fixer le deuxième bord latéral de la cuticule, comme indiqué sur le schéma. Ensuite, retirez soigneusement l’intestin, les corps gras et les traia, en ne laissant que le cerveau avec les deux lobes optiques et les ganglions ventraux.

Avec les nerfs segmentaires attachés, la fixation et la coloration par anticorps sont ensuite réalisées avec les larves fixées sur la coupelle de garde. Incuber les larves disséquées dans 50 microlitres de fixateur pendant 30 minutes. Après la fixation, remplacer le fixateur toutes les 15 minutes, puis rincer les larves dans du PBT 1x pendant 30 minutes.

En remplaçant le tampon toutes les 10 minutes, il est important de noter que les larves doivent toujours être immergées dans le tampon. Préparez la solution d'anticorps primaire en la diluant à la concentration appropriée dans la solution de BSA à 5 %. Les concentrations optimales varient selon les anticorps.

Construisez une chambre humide en tapissant un plat en plastique avec un essuie-tout imbibé d'eau. Remplacez-le plusieurs fois par du PBT.

Rincer avec la solution d'anticorps primaire préparée et incuber dans la chambre humide à quatre degrés Celsius toute la nuit le jour suivant. Rincer les larves disséquées dans du PBT 1x pendant 30 minutes en remplaçant le tampon toutes les 10 minutes. Préparer l'anticorps secondaire en le diluant à la concentration appropriée dans la solution de BSA à 5 %.

Et enveloppez la chambre humide dans du papier d’aluminium, car certaines anticorps secondaires sont sensibles à la lumière. Incubez les larves dans la solution d’anticorps secondaire à 25 degrés Celsius pendant une heure. Une fois l’incubation avec l’anticorps secondaire terminée, rincez les larves dans du PBT 1x pendant 30 minutes en remplaçant le tampon toutes les 10 minutes, puis procédez au montage et à la visualisation des larves disséquées avant de monter la larve sur la lame.

Préparez la lame en étalant deux lignes verticales de vernis à ongles au milieu, avec un espace suffisamment large pour qu’un couvre-objet puisse reposer dessus, comme indiqué sur le schéma. Laissez le vernis à ongles sécher complètement une fois que le vernis est sec. Déposez une goutte de tampon de montage dans l’espace entre les lignes verticales de vernis à ongles sur la lame, comme illustré sur cette image.

La lame est désormais prête à être montée. Récupérez les larves après le dernier rinçage au PBT. Rincez et retirez délicatement les épingles latérales d'une larve.

Veillez attentivement à ne pas déchirer la cuticule. Retirez les deux épingles restantes et saisissez la larve avec une pince pour la placer sur la lame préparée. Assurez-vous que la larve n'est pas retournée et qu'elle est orientée en position ventrale.

Placez délicatement une lame couvre-objet par-dessus, côté face supérieure, et scellez les bords avec du vernis à ongles comme illustré ici. Les larves sont désormais prêtes à être visualisées au microscope à fluorescence. Cette image représentative montre une larve de type sauvage marquée avec des anticorps dirigés contre la protéine de la vessicule synaptique, la protéine cystine string.

Les nerfs segmentaires de lave sont uniformément colorés ici. Un mutant de protéine motrice, lave, a été coloré avec des anticorps dirigés contre CSP. Les nerfs segmentaires présentent d'importantes accumulations qui se colorent intensément pour CSP.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de veiller à conserver les nerfs segmentaires rattachés au cerveau et à maintenir les muscles intacts. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment effectuer une dissection. Fixez un troisième échantillon pour immunomarquage et commencez par les nerfs segmentaires larvaires afin d'étudier le transport axonal à l'aide d'un microscope à fluorescence.