Induction et d'évaluation de la recombinaison commutateur de classe dans purifiée cellules B murines

Au cours de la réponse immunitaire humorale, les lymphocytes B activés par l'antigène prolifèrent et sécrètent des anticorps à mesure que la réponse progresse. L'ISOTYPE d'anticorps I GM par défaut est remplacé par les isotopes plus diversifiés IgG, IgA ou IgE afin d'évaluer la prolifération et la commutation de classe. Des lymphocytes B spléniques sont isolés in vitro à partir d'une souris expérimentale par séparation magnétique des cellules.

Les cellules sont marquées avec le colorant fluorescent CFSE afin de suivre leur prolifération, laquelle est stimulée par un traitement au L-P-S. Le L-P-S induit également un commutation de classe vers l'isotype IgG3, phénomène qui, tout comme la prolifération, peut être analysé par cytométrie en flux. Aujourd'hui, je vais vous présenter une technique d'isolement et d'activation de cellules B spléniques pures. Cette méthode peut être utilisée pour étudier la recombinaison de commutation de classe et la prolifération in vitro, et elle permet également de répondre à des questions essentielles dans le domaine de l'immunité des cellules B, notamment concernant la fonction et la régulation de la cytidine désaminase induite par activation.

Commencez par imbiber un souris euthanasiée avec de l'éthanol à 70 %. La souris doit avoir entre huit et douze semaines d'âge. Afin de garantir une maturation complète du système immunitaire, utilisez des ciseaux stériles pour pratiquer une incision à travers la peau et le muscle de l'hypochondre gauche de l'abdomen. Utilisez des ciseaux ou une pince pour retirer la rate du tissu adjacent.

Ensuite, découpez-le en trois grands morceaux dans du PBS. Puis, à l’aide de l’extrémité en caoutchouc du piston d’une seringue de un millilitre, écrasez délicatement la rate à travers un tamis cellulaire de 70 microns dans du PBS. Veillez à effectuer un mouvement de poussée plutôt qu’un mouvement de broyage.

Car le broyage peut entraîner la rupture de cellules plus grandes et proliférant. Centrifuger les cellules à au plus 350 G pendant cinq minutes. Ensuite, resuspendre le culot dans du PBS.

Compter les cellules en suspension à l'aide d'un hémocytomètre dans un tube stérile en polystyrène de cinq millilitres. Préparer une suspension de un fois dix puissance huit cellules par millilitre dans du PBS contenant 5 % de sérum de rat normal. Un maximum de deux millilitres peut être ajouté à chaque tube.

Ensuite, ajouter 50 microlitres de cocktail d'enrichissement des cellules B de souris EP négatif pour chaque millilitre de cellules. Puis boucher les tubes et les placer au réfrigérateur pendant 15 minutes.

Ajoutez 100 microlitres de cocktail de sélection biotine EP par millilitre de cellules. Fermez les tubes et placez-les au réfrigérateur pendant 15 minutes après l'incubation avec le mélange de nanoparticules magnétiques EP du cocktail de sélection biotine, puis ajoutez 100 microlitres par millilitre de cellules. Pipetez le mélange, fermez les tubes et placez-les au réfrigérateur pendant cinq minutes.

Compléter la solution à 2,5 millilitres avec du PBS et placer dans un aimant cept pendant cinq minutes. Inverser l'aimant dans le tube et verser rapidement dans un nouveau tube en polystyrène. Ne pas agiter le tube, car les cellules négativement sélectionnées seront liées magnétiquement aux parois du tube. Pour augmenter davantage la pureté de la suspension cellulaire, placer le nouveau tube contenant les cellules dans l'aimant pendant cinq minutes, puis verser à nouveau dans un nouveau tube.

Cette étape peut réduire le rendement global en cellules. La pureté des cellules B peut être évaluée par analyse cytométrique en flux des marqueurs de surface des cellules B. Après enrichissement, plus de 95 % des cellules doivent être positives pour B deux 20.

Resuspendre les cellules isolées dans du PBS chaud supplémenté avec 0,1 % de BSA à une concentration finale d'un million de cellules par millilitre à partir d'une solution mère de cinq millimolaire de colorant CFSE diluée dans du diméthylsulfoxyde stérile. Ajouter deux microlitres pour chaque millilitre de cellules dans le tube. Le CFSE est utilisé pour surveiller la division cellulaire des cellules stimulées.

Un processus essentiel pour la commutation d'isotype. Une concentration finale de 10 micromolaire est optimale pour la coloration des lymphocytes B primaires. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes à l'abri de la lumière.

Remarquez que le CFSE est sensible à la lumière et doit être conservé à l'abri de la lumière autant que possible. Après l'incubation, éteignez la coloration en ajoutant un volume équivalent de sérum de veau bovin à vos cellules et en incubant sur de la glace pendant cinq minutes. Pour laver les cellules, complétez les tubes avec du milieu de culture ; un volume total d'au moins cinq fois le volume initial de milieu doit être ajouté afin de compenser la viscosité du sérum de veau bovin et permettre aux cellules de former un culot, puis centrifugez à 350 G. Lavez les cellules deux fois supplémentaires dans du milieu de culture ; les cellules sont désormais prêtes à être stimulées.

Préparez un milieu de culture de lymphocytes B in vitro en complétant le RPMI 1640 avec 10 % de sérum de veau fœtal et 50 micromolaire de Beto me capita éthanol. Ensuite, préparez le milieu de stimulation en ajoutant du LPS à une concentration finale de 50 microgrammes par millilitre. Répartissez 125 microlitres du milieu de stimulation dans chaque puits d'une plaque de culture histologique à 96 puits, à fond plat.

Préparez les cellules B marquées avec le CFS E dans du milieu de culture sans LPS à une concentration finale de 3,2 × 10⁶ cellules par millilitre. Ajoutez 125 microlitres de la suspension cellulaire dans les puits contenant votre milieu de stimulation et mélangez délicatement à l’aide d’une pipette. Chaque puits contient désormais 400 000 cellules dans une concentration finale de LPS de 25 microgrammes par millilitre.

Ceci assure des niveaux optimaux de prolifération cellulaire et de commutation de classe. Bien que des modifications de ces valeurs puissent être effectuées selon les besoins, incuber les cellules à 37 degrés Celsius et à 5 % de dioxyde de carbone pendant 72 à 96 heures. Après 48 heures, des agrégats de grandes cellules B en prolifération seront clairement visibles au microscope pour l'observation de la commutation de classe.

Retirer les cellules de l’incubateur et les laver deux fois dans un millilitre de tampon de marquage afin d’éviter une coloration non spécifique par les anticorps. Récupérer les cellules par centrifugation à 350 ×g. Resuspendre ensuite les cellules dans 100 microlitres de tampon de marquage contenant 5 % de sérum de souris normal et un microgramme de bloc FC par million de cellules, puis incuber 15 minutes sur de la glace sans lavage. Ajouter un anticorps anti-US IgG3 marqué avec un fluorochrome à raison d’un microgramme par million de cellules, incuber 30 minutes sur de la glace, laver les cellules deux fois, puis les resuspendre dans deux à 300 microlitres de tampon de marquage.

Les cellules sont désormais prêtes à être analysées par cytométrie en flux. Le CFSE est excité de manière optimale à 492 nanomètres par un laser à ion argon et émet à 517 nanomètres. Le spectre d'excitation et d'émission de l'anticorps IgG trois dépend du colorant fluorescent auquel il est conjugué.

Après l'enrichissement magnétique, la suspension cellulaire doit présenter un aspect homogène, composé de petites cellules circulaires indistinguables. Après 48 à 72 heures de stimulation, des agrégats isolés de cellules agrandies en prolifération seront clairement visibles. Une grande partie des cellules non prolifératives apparaîtront petites et granulaires, en cours d'apoptose.

La RSC peut normalement être détectée aux niveaux les plus élevés entre 72 et 96 heures après la stimulation, avant que la majorité des cellules ne commencent à mourir. À ce stade, les cellules doivent avoir subi plusieurs divisions cellulaires, les cellules ayant effectué le commutation apparaissant dans les populations cellulaires filles tardives. Après avoir suivi ces protocoles, d'autres techniques telles que l'ARN, l'inhibition génique médiée par IA peuvent être utilisées pour étudier l'effet de n'importe quel gène sur la fonction d'un ID et sur le processus de recombinaison de commutation de classe.