Dépistage ARNi pour les facteurs de l'hôte impliqués dans Vaccine aide Drosophile Cellules

L’objectif global de cette procédure est d’utiliser le criblage ARNI à haut débit pour identifier les facteurs de l’hôte impliqués dans l’infection virale. Ceci est accompli en appauvrissant d’abord les gènes d’intérêt par l’ARNAI dans 384 plaques de puits. Ensuite, les cellules sont testées avec la coloration du virus d’intérêt pour les protéines virales et mesurées pour l’infection virale par microscopie d’immunofluorescence.

Enfin, une analyse automatisée des images est effectuée pour identifier les gènes candidats à la validation et à une étude plus approfondie. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent des changements dans l’infection grâce à la quantification du pourcentage de cellules infectées à l’aide de la microscopie à immunofluorescence. Cela permet de découvrir de nouveaux facteurs cellulaires impliqués dans l’infection virale.

Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les interactions entre l’hôte du virus, elle peut également être appliquée à l’étude de tout système qui bénéficierait de l’utilisation d’une lecture visuelle du processus cellulaire d’intérêt. Les personnes qui ne connaissent pas cette méthode doivent s’attendre à une courbe d’apprentissage abrupte, car la réalisation d’infections reproductibles tout en minimisant la variabilité nécessite une optimisation considérable. Pour garantir la reproductibilité des résultats, il est essentiel d’utiliser un seul numéro de lot pour chaque réactif utilisé dans un crible entier. Cultivez des cellules de drosophile S 2D RSC et complétez le milieu de Schneider à 25 degrés Celsius, les cellules doivent être en phase logarithmique.

Pour les expériences dans une hotte à flux laminaire, déloger les cellules semi-adhérentes du ballon par un pipetage rigoureux. Comptez sur un cytomètre hémologique pour transférer 125 % des cellules nécessaires à l’expérience dans un tube conique de 50 millilitres en pastille à 300 G pendant cinq minutes. Aspirez le super nommé remettre en suspension la pastille à une concentration finale de 1,7 fois 10 à six cellules par millilitre dans un milieu Schneider sans sérum.

Utilisez un système automatisé de manipulation des liquides stérilisé et amorcé. Ici, la matrice s’accouple bien pour minimiser la variabilité des plaques. Ajoutez 10 microlitres de suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque de 384 puits pré Eloqua avec 250 nanogrammes par puits de cellules de spin d’ARN double brin sur des plaques à 300 G pendant une minute.

Incuber les assiettes à 25 degrés Celsius pendant 45 minutes. Ajoutez 20 microlitres de milieu complet Schneider’s à chacun. Bien faire tourner le milieu à 300 G pendant une minute pour minimiser les effets de l’évaporation.

Conservez les assiettes et les contenants scellés humidifiés tapissés d’essuie-tout imbibés d’eau. Incuber à 25 degrés Celsius pendant trois jours pour permettre des effets d’inactivation robustes dans une enceinte de biosécurité BSL deux. Avant d’infecter les cellules, filtrez le stock brut de virus de la vaccine à travers un filtre à seringue de 0,8 micron.

Pour enlever les débris cellulaires. Diluer le virus dans le milieu de Schneider avec 2 % de sérum pour obtenir une multiplicité d’infection. MOI abrégé de deux premiers.

Le puits stérilisé s’accouple avec du virus dilué jusqu’à ce que le tube soit exempt de bulles d’air. À l’aide d’un aspirateur multicanaux stérilisé avec collecteur à vide, retirez délicatement le milieu des plaques de cellules de drosophile traitées à ARN double brin. Versez 30 microlitres de virus dilué dans chaque plaque.

Bien centrifuger les plaques à 300 G pendant une minute. Remettez les plaques dans le récipient humidifié et incubez à 25 degrés Celsius pendant 48 heures. Dans une BSL, deux enceintes de biosécurité aspirent le milieu de la plaque.

Ensuite, à l’aide d’une pipette multicanaux, ajoutez 15 microlitres de formaldéhyde à 4 % sur chaque plaque. Bien incuber à température ambiante pendant 15 minutes. Retirez le liquide à l’aide d’un aspirateur multicanaux.

Utilisez le WELLMADE pour ajouter 30 microlitres de PBST à chacun. Bien incuber à température ambiante pendant 10 minutes. Effectuez un deuxième lavage PBST de 10 minutes de la même manière.

Retrait du liquide après le bloc d’incubation et 30 microlitres de PBST avec une solution bloquante VSA à 2 %. Incuber à température ambiante pendant 10 minutes. À l’aide d’un pipeteur répété multicanaux, ajoutez 15 microlitres d’anticorps primaires dilués dans une solution bloquante.

Bien faire tourner les assiettes à 300 G pendant une minute. Scellez chaque plaque avec un plafond transparent : laissez incuber à quatre degrés Celsius pendant la nuit. À l’aide de l’aspirateur à canaux multiples et du bon maté, il faut laver les cellules au PBST trois fois pendant 10 minutes à chaque lavage.

À l’aide d’une pipette multicanaux, ajoutez 15 microlitres d’anticorps secondaires marqués par fluorescence avec coloration nucléaire. Bien couvrir d’une feuille d’aluminium pour protéger de la lumière, incuber les assiettes à température ambiante pendant une heure. Lavez les cellules avec du PBST trois fois comme auparavant pendant 10 minutes à chaque lavage.

Ajoutez 30 microlitres de PBST dans les cellules et scellez avec un plafond transparent. Filmer et couvrir de papier d’aluminium. Conservez les plaques scellées à quatre degrés Celsius jusqu’à trois semaines avant de les imager sur un microscope automatisé.

Les puits non infectés ne présentent aucune coloration pour les protéines du virus de la vaccine alors qu’un puits infecté représentatif contient des cellules. La coloration positive pour la protéine bêta GCSEs exprimée par la vaccine est mesurée par microscopie d’immunofluorescence. Un logiciel d’analyse d’images automatisé quantifie l’infection dans chaque image à l’aide de paramètres définis par l’utilisateur.

Dans une image représentative, le nombre total de noyaux cellulaires et le nombre de cellules exprimant l’antigène viral sont comptés en fonction de la taille et de l’intensité de la coloration au-dessus du fond local. La coloration du fil sert de contrôle positif pour la déplétion robuste de l’ARNi des gènes cibles. L’inactivation de ce facteur anti-apoptotique entraîne une mort cellulaire dramatique.

L’inactivation de la luciférase sert de contrôle négatif de l’effet du double brin. Traitement de l’ARN en cas d’infection La déplétion de la luciférase n’a aucun effet sur l’infection par rapport aux cellules non traitées. L’inactivation de la protéine bêta-galacto sert de contrôle positif pour une réduction de l’infection.

Étant donné que le test utilise les niveaux de protéine bêta-galacto comme lecture de l’infection, l’épuisement du bêta-galacto entraîne une diminution du pourcentage de cellules infectées. L’inactivation du facteur cellulaire RAB cinq entraîne une diminution du pourcentage de cellules infectées. Étant donné que l’on sait que le RAB cinq participe à l’endocytose, ce facteur contribue probablement à l’entrée du virus de la vaccine.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser le dépistage de l’ARNi chez la drosophile pour identifier les facteurs de l’hôte qui contribuent à l’infection virale, y compris la réalisation de l’ARNi, l’infection par le virus de la vaccine, l’imagerie de coloration et l’analyse de 384. Eh bien, n’oubliez pas que travailler avec le virus DIA peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port de blouses de laboratoire et de lunettes de protection doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure. Le virus vivant ne doit être ouvert que dans une enceinte de sécurité biologique BSL deux, et tout ce qui est en contact avec le virus vivant doit être stérilisé dans de l’eau de Javel à 10 % avant d’être éliminé.