Name: Injection intracrânienne des vecteurs adéno-associés virale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-17T18:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Découvrez l'injection intracrânienne de vecteurs AAV pour le marquage fluorescent des neurones et de la glie dans le cortex visuel. Cette méthode permet l'imagerie in vivo des dynamiques cellulaires spécifiques.

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Ce travail a été rendu possible par des subventions du NIH (EY012977), une bourse de carrière dans les sciences biomédicales de l&#39;Burroughs Wellcome Fund, la Fondation de Whitehall, et la Sloan Foundation (AKM).

1. Manipulation du virus et le stockage <ol><li> Une protection adéquate et des techniques de manipulation doivent être choisis en fonction du niveau de biosécurité du virus à être utilisé. Ces pratiques peuvent être trouvés dans la biosécurité dans les laboratoires ème édition microbiologique et biomédicale 5, disponible sur le site du CDC ( <a href="http://www.cdc.gov/od/OHS/biosfty/bmbl5/bmbl5toc.htm">http://www.cdc.gov/od/OHS/biosfty/bmbl5/bmbl5toc.htm</a> ). L&#39;utilisation de vecteurs AAV est approuvé pour la biosécurité de niveau 1 (BSL-1). Pour l&#39;expérience présentée ici, une blouse et des gants seront portés lors de la manipulation du virus, conformément aux procédures de traitement BSL-1 agents. </li><li> Afin de préserver l&#39;activité du virus, il est préférable de le diviser en petites portions pour éviter le gel et le dégel répétés. </li><li> Préparer une enceinte de sécurité biologique (BSC) de classe II pour aliquotage virus par le BSC compensation de tous les objets inutiles et de stérilisation de la surface avec de l&#39;EtOH 70%. Placer un bécher contenant une solution javellisée à 10% dans la hotte de la collecte des déchets contaminés AAV. Également placée dans le BSC sont stériles tubes de 0.5ml et un récipient de glace sèche. </li><li> Dégel stock viral sur la glace en dehors de la BSC. </li><li> Virus de Vortex et ouvrir le tube à l&#39;intérieur du BSC. </li><li> Pipeter le volume aliquote désirée (par exemple 5 uL) dans un tube de 0.5ml, fermer le tube et le placer dans la glace sèche pour flash-geler le virus. </li><li> Lorsque tous les virus a été aliquotés débarrasser de ce tube de virus et des embouts de pipette dans le récipient de déchets contenant Javel à 10%. </li><li> Retirez le conteneur de déchets provenant de la hotte et d&#39;ajouter l&#39;eau de Javel à 10%, puis verser l&#39;eau de javel dans l&#39;évier. Eliminer les déchets en plastique dans un container prévu comme indiqué par l&#39;agent de votre institut de biosécurité. </li><li> Nettoyer tout équipement ou des surfaces qui sont entrés en contact avec le virus de Javel à 10%. Jeter les gants. </li><li> Conserver dans aliquotes à -80 ° C au congélateur. </li></ol> 2. Chirurgie <ol><li> Couvrir la zone chirurgicale avec un papier de laboratoire banc absorbant. Instruments chirurgicaux doivent être stérilisés et de la chirurgie effectuée dans des conditions aseptiques en conformité avec la biosécurité de votre institution et les directives d&#39;utilisation d&#39;animaux. </li><li> Choisissez une zone adjacente à la zone chirurgicale qui sera dédié au chargement des micropipettes avec le virus, et le couvrir avec du papier absorbant de laboratoire banc. Placer une aliquote de virus dans un récipient de glace dans ce domaine, et permettre au virus de dégel sur la glace que la chirurgie est effectuée. </li><li> Installation d&#39;un conteneur de déchets d&#39;eau de Javel à 10% dans la zone de manipulation du virus dédié pour l&#39;élimination des embouts de pipette, etc qui viennent en contact avec le virus. </li><li> Tirez une micropipette de verre Wiretrol à un diamètre de la pointe d&#39;environ 20 microns. Placer une petite goutte d&#39;huile minérale sur la fin brutale de la micropipette et insérez le piston de fil fourni avec le micropipettes. </li><li> Fixez la micropipette dans la pince du bras micropompe. </li><li> Injecter une souris avec la buprénorphine par voie sous cutanée à la dose de 0,5 mg / kg. Anesthésier la souris avec Avertin par injection intrapéritonéale avec une dose de 200 mg / kg et enlever les poils du dessus de la tête avec des ciseaux chirurgicaux, en veillant à laisser des marges assez grandes pour empêcher les cheveux d&#39;entrer dans l&#39;incision. </li><li> Fixer une couverture chauffante à la base d&#39;un stereotax pour maintenir une température corporelle de 37 ° C toute l&#39;opération et assurer la souris dans la stereotax. </li><li> Baignez la tête avec trois gommages alternance d&#39;éthanol et bétadine pour stériliser la région. </li><li> Déposer une goutte de pommade ophtalmique Tobradex sur chaque œil à garder les yeux humides pendant la chirurgie. </li><li> Faire une incision le long de la ligne médiane de la tête et tirer la peau du dos pour exposer le crâne. </li><li> Retirez délicatement la façade du crâne à l&#39;aide à pointe fine pince. </li><li> Localisez la zone à être injecté en utilisant les coordonnées stéréotaxiques et marquer le crâne avec un stylo chirurgical. </li><li> En utilisant une fraise de dentiste avec une bavure 1.4mm, fine une zone du crâne d&#39;environ 2mm de diamètre jusqu&#39;à la fissure du crâne, en divisant la zone amincie en plusieurs segments. </li><li> Tout au long de cette procédure, garder le crâne humide avec des applications de solution saline stérile. </li><li> Effectuer une craniotomie en enlevant doucement les segments du crâne à l&#39;aide aminci extra-fine pince à pointe. </li></ol> 3. Préparation à l&#39;injection <ol><li> Avec un Kimwipe placé sur le couvercle, ouvrir le tube de virus et de la pipette 1.5uL (pour une injection 1UL) du virus sur un petit morceau de parafilm. </li><li> Placez la pointe de la micropipette dans le stock viral et manuellement retirer le piston. En cas de difficulté de dessin stock viral dans la micropipette, la pointe peut être agrandi être légèrement percer un Kimwipe à la micropipette pour casser une petite partie de la vitre. </li><li> Bras inférieur sur micropompe piston jusqu&#39;à ce qu&#39;une petite quantité de virus est dissipé depuis la pointe de la micropipette. Retirer cette petite goutte avec un coton-tige et l&#39;applicateur jeter dans étaiscontenant e. </li><li> Appliquez une goutte d&#39;huile minérale à la pointe de la micropipette pour éviter le colmatage de la micropipette est descendue dans le cerveau. </li></ol> 4. Injection du virus <ol><li> Utilisation de X et Y coordonnées stéréotaxique, la position de la micropipette sur la zone à injecter. Dans cette expérience, la stéréotaxie coordonnées utilisé pour localiser cortex visuel primaire sont postérieurs à 2,7 mm et 2,5 mm bregma latéral à la ligne médiane. Très lentement le micropipette (à un taux approximatif de 1mm/1minute) à la bonne position Z. </li><li> Entrez les paramètres d&#39;injection souhaitée dans la boîte SYS Micro4 contrôleur de micropompe et initier l&#39;injection. Pour cette expérience, 1 microlitre de plus de 10 minutes sera utilisé comme un taux d&#39;injection. </li><li> Lorsque l&#39;injection est terminée, laisser la pipette au repos pendant une à deux minutes pour empêcher l&#39;efflux de virus lors de l&#39;enlèvement. Après cette période, très lentement retirer la micropipette par le cerveau (même taux que ci-dessus). </li><li> Suture du cuir chevelu et le sceller avec de la colle tissulaire. Injecter de l&#39;animal sous-cutanée avec la buprénorphine à la dose de 0,1 mg / kg toutes les 8-12 heures au cours des 72 prochaines heures, ou aussi longtemps que l&#39;animal manifeste des signes de douleur. Permettre à l&#39;animal de retrouver sous une lampe chauffante jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit ambulantes et prêt à être retourné à sa cage. Des expériences d&#39;imagerie peuvent être engagées après le temps d&#39;incubation désirée (jours ou semaines après l&#39;injection virale). </li></ol> 5. Nettoyage <ol><li> Rincer la micropipette avec l&#39;eau de Javel à 10% et le jeter dans un contenant pour objets pointus. </li><li> Jeter le contenant des déchets de la même manière que la section 1. </li><li> Jeter le papier dans le bac paillasse biorisques et essuyez toutes les surfaces et les instruments qui ont pu entrer en contact avec le virus de l&#39;eau de Javel à 10%. </li><li> Le virus inutilisés peuvent être congelés à nouveau, en gardant à l&#39;esprit que répétées cycles gel / dégel provoque la dégradation des virus. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/2140/2140fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Transduction neurone après l&#39;injection du double brin du virus adéno-associé de sérotype 1 (dsAAV S1) transportant la protéine fluorescente verte (GFP) sous contrôle du promoteur CMV. Le corps de la cellule ainsi que les dendrites proximales et distales sont clairement visibles dans les sections fixes imagée en utilisant un microscope à épifluorescence. Barre d&#39;échelle = 100 pm. <img src="/files/ftp_upload/2140/2140fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Étiquetage typiques d&#39;une injection de virus intracrânienne dans le cortex visuel primaire en utilisant S1 dsAAV montrant l&#39;ampleur de la propagation virale ainsi que des neurones marqués, glie et les processus. Barre d&#39;échelle = 250 um. <img src="/files/ftp_upload/2140/2140fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Étiquetage des cellules dans l&#39;hippocampe en utilisant S1 dsAAV. Barre d&#39;échelle = 250 um. Ces chiffres sont adaptés de Lowery et al. 2009 1

<ol><li>Kaplitt, M. G., Leone, P., Samulski, R. J., Xiao, X., Pfaff, D. W., O'Malley, K. L., During, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+gene+expression+and+phenotypic+correction+using+adeno-associated+virus+vectors+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain.</a> Nat Genet. 8, 148-154 (1994).</li>
<li>Harding, T. C., Dickinson, P. J., Roberts, B. N., Yendluri, S., Gonzalez-Edick, M., Lecouteur, R. A., Jooss, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+gene+transfer+efficiency+in+the+murine+striatum+and+an+orthotopic+glioblastoma+tumor+model%2C+using+AAV-7-+and+AAV-8-pseudotyped+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Enhanced gene transfer efficiency in the murine striatum and an orthotopic glioblastoma tumor model, using AAV-7- and AAV-8-pseudotyped vectors.</a> Hum Gene Ther. 17, 807-820 (2006).</li>
<li>Lo, W. D., Qu, G., Sferra, T. J., Clark, R., Chen, R., Johnson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus-mediated+gene+transfer+to+the+brain%3A+duration+and+modulation+of+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus-mediated gene transfer to the brain: duration and modulation of expression.</a> Hum Gene Ther. 10, 201-213 (1999).</li>
<li>Lowery, R. L., Zhang, Y., Kelly, E. A., Lamantia, C. E., Harvey, B. K., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+long-term+labeling+of+cells+in+the+developing+and+adult+rodent+visual+cortex+using+double-stranded+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Rapid long-term labeling of cells in the developing and adult rodent visual cortex using double-stranded adeno-associated viral vectors.</a> Dev Neurobiol. 69, 674-688 (2009).</li>
</ol>

Les protocoles expérimentaux animaux et ont été approuvés par l&#39;Université de Rochester University Comité des Ressources Animales (UCAR) en conformité avec le PHS politique sur les soins aux animaux et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire.

Livraison de gènes médiée par Virally détient un grand potentiel pour l&#39;étude des processus neurologiques et le traitement des troubles du cerveau 1,2,3. La grande polyvalence de cette technique peut aussi être exploitée pour marquer les cellules par fluorescence pour l&#39;imagerie in vitro et in vivo 4. Ici nous démontrons une procédure détaillée pour la transduction de neurones et cellules gliales dans le cortex visuel de la souris en utilisant un double brin d&#39;associat...

<table><tbody><tr><td>Adaptateur pour souris et rat nouveau-né St&amp;#8211;lting</td><td>Stoelting Co.</td><td>51625</td><td>Un stéréotaxique ordinaire pour maintenir les animaux pendant la chirurgie peut être utilisé à la place</td></tr><tr><td>Ciseaux extra fins Bonn, 8,5 cm, pointe droite, tranchant de 13 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Pinces à pansement oculaire, 10 cm, largeur de la pointe 0,5 mm, courbées</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinces Dumont n°5/45, pointe standard Dumoxel, 11 cm, angulées</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td>Pinces à extrémité extra-fine pour réaliser une craniotomie</td></tr><tr><td>Pinces à motif standard, droites, extrémité 2,5 mm × 1,35 mm, 12 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Boîtier de commande Microtorque et pièce à main Tech2000</td><td>Ram Products, Inc.</td><td>TECH2000ON/OFF</td><td>Perceuse dentaire</td></tr><tr><td>Fraises en acier inoxydable Micro Drill, diamètre de la pointe 1,4 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>19008-14</td><td></td></tr><tr><td>Micropipettes Wiretrol, pour délivrer 1-5 µL</td><td>VWR international</td><td>5-000-1001 ou 53480-287</td><td></td></tr><tr><td>Huile minérale</td><td>VWR international</td><td>29447-338</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulateur manuel et base inclinable (pour droitier)</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>M3301-M3-R</td><td>Utilisé pour déterminer les coordonnées stéréotaxiques</td></tr><tr><td>UltraMicroPump (UMP3) (un) avec contrôleur SYS-Micro4</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>UMP3-1</td><td></td></tr><tr><td>Fils de suture</td><td>VWR international</td><td>95056-952</td><td></td></tr><tr><td>Tireuse de micropipettes P-97 Flaming/Brown</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Tobradex</td><td></td><td></td><td>Disponible auprès des services vétérinaires de votre établissement&amp;rsquo;</td></tr></tbody></table>

injection intracrânienne des vecteurs adéno-associés virale

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

L&#39;injection intracrânienne de vecteurs viraux pour exprimer une protéine fluorescente est une technique de marquage polyvalent pour la visualisation des sous-ensembles spécifiques de cellules dans différentes régions du cerveau in vivo et dans les sections du cerveau. Contrairement à l&#39;injection de colorants fluorescents, l&#39;étiquetage virale offre ciblant des types cellulaires individuels et est moins coûteux et fastidieux que d&#39;établir des lignées de souris transgéniques. Dans cette technique, une viraux adéno-associés (AAV) est injecté par voie intracrânienne en utilisant les coordonnées stéréotaxique, une micropipette et une pompe automatique pour la livraison précise de l&#39;AAV à la zone désirée avec un minimum de dommages aux tissus environnants. Paramètres d&#39;injection peuvent être adaptées à des expériences individuelles en ajustant l&#39;âge des animaux à un taux d&#39;injection, l&#39;emplacement d&#39;injection, le volume d&#39;injection, d&#39;injection, AAV de sérotype et le promoteur dirigeant l&#39;expression des gènes. Selon les conditions choisies, viro-induit l&#39;expression du transgène peut permettre la visualisation des groupes de cellules, des cellules individuelles ou d&#39;une amende de processus cellulaires, jusqu&#39;au niveau des épines dendritiques. L&#39;expérience montre ici représente une injection de double-brin AAV exprimant la protéine fluorescente verte pour l&#39;étiquetage des neurones et cellules gliales dans le cortex visuel primaire de souris.

Nous présentons ici l&#39;injection intracrânienne de vecteurs AAV pour le marquage fluorescent des neurones et cellules gliales dans le cortex visuel.

Injection intracrânienne des vecteurs adéno-associés virale

L'injection intracrânienne de vecteurs viraux conçus pour exprimer une protéine fluorescente est une technique de marquage polyvalente pour la visualisation de ...

Les vecteurs viraux peuvent être utilisés pour exprimer des protéines fluorescentes dans des sous-ensembles spécifiques de cellules dans les tissus. Ici, un virus exprimant des protéines modifiées est introduit dans le cortex visuel primaire du cerveau en réalisant d'abord une petite craniotomie au-dessus de cette région. Ensuite, une micro-pipette en verre est abaissée dans le cerveau et un vecteur viral associé aux dents est injecté dans le cerveau, puis le site chirurgical est fermé.Une fois que l'animal s'est rétabli, des acquisitions d'images peuvent être effectuées pour suivre le devenir des cellules marquées par fluorescence in vivo ou sur des sections cérébrales. Les principaux avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que le marquage par colorants fluorescents ou l'utilisation de lignées de souris transgéniques, sont qu'elle permet de cibler des types cellulaires individuels et qu'elle est moins coûteuse et moins longue que la création d'une lignée transgénique. L'utilisation de vecteurs viraux associés aux adénovirus est approuvée pour un niveau de biosécurité 1 ou BSL 1.Ici, une blouse de laboratoire et des gants seront portés conformément

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Neuroscience

Neurosciences

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Le cerveau est un site unique avec des qualités qui ne sont pas bien représentés par des analyses in vitro ou extra-utérines. Des modèles de souris orthotopique avec l'emplacement et les caractéristiques de croissance et reproductibles peuvent être créés de manière fiable avec des injections intracrâniennes en utilisant un instrument stéréotaxique de fixation et d'une pompe à seringue à basse pression.

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