Name: Génération dADN / ARN hybrides dADN génomique par la transformation en utilisant lARN contenant Oligonucléotides (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-24T18:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 42 s
Description: Découvrez comment générer des hybrides ARN/ADN au niveau chromosomique dans des cellules de levure vivantes par transformation avec des oligos contenant de l'ARN. Cette méthode permet d'étudier le transfert d'informations génétiques de l'ARN vers l'ADN génomique.

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Justification Exploiter l'utilisation de Thermo Scientific oligos Dharmacon, 50 à 80-mers, ici, nous présentons une procédure, basée sur un dosage de la correction de gène, par lequel oligos peuvent transférer l'information génétique de l'ADN génomique des cellules de levure, après recuit à l'ADN cible chromosomique. Le succès de ciblage par oligos est marqué par l'apparition de colonies de levures affichant le phénotype attendu. Si la modification génétique désirée est effectué dans un ou plusieurs ribonucléotides incorporé dans la séquence oligo, l'information génétique découle directement de l'appareil d'ARN à l'ADN cible chromosomique, donc, une forme d'ARN / ADN hybride au niveau chromosomique au cours du processus de ciblage. La ribonucléotide / s d'un Thermo Scientific Dharmacon ARN contenant des oligo peut servir de modèle pour le ciblage génique par synthèse ou de réparation de l'ADN peut être incorporé dans l'ADN et de servir de modèle lors de la réplication d'ADN. Dans ces expériences, nous utilisons la levure / Saccharomyces cerevisiae / système modèle eucaryote, cependant, une approche similaire peut également être appliquée dans d'autres organismes ou types cellulaires. Dans cette vidéo, nous utilisons un Thermo Scientific Dharmacon oligo conçu avec une homologie avec un locus génomique cible de la levure et contenant un ribonucléotide dans le milieu pour corriger une mutation dans le gène cible. Après la transformation avec les oligo-ARN contenant, on observe la correction du site ciblé à une certaine fréquence, ce qui indique que l'appareil de l'ARN oligo pourrait être incorporé dans l'ADN chromosomique et de servir de matrice pour la synthèse d'ADN lors de la réplication d'ADN. L'information génétique portée dans le tractus ARN est stable transmis aux générations suivantes de cellules. Nous décrivons ici les étapes de la transformation de cellules de levure par le Thermo Scientific Dharmacon ARN contenant des oligo et l'approche pour détecter les informations ARN transfert dans l'ADN chromosomique. A. Conception de l'Oligo-ARN contenant utilisé dans cette expérience Nous avons conçu un oligo-ARN contenant de corriger un défaut génétique dans la levure S. l'ADN chromosomique cerevisiae au niveau du locus trp5. La souche de levure utilisée dans le protocole contient un gène mutant trp5 avec une délétion de deux de base et une mutation non-sens (figure 1A). Telle est la souche de levure un mutant auxotrophe tryptophane et ne forme pas de colonies sur les médias sans tryptophane. La séquence d'ADN du gène TRP5 est disponible à la base de données du génome de Saccharomyces (http://www.yeastgenome.org/). Le Thermo Scientific Dharmacon ARN contenant des oligo utilisé dans ce protocole est un 65-mer avec une insertion d'ADN 2-base, destiné à corriger la mutation de suppression et d'un ribonucléotide conçu pour corriger la mutation non-sens de l'allèle trp5 (figure 1A). La séquence de l'oligo est conçu comme suit: 5'-AAAAGGGTTTTGATGAAGCTGTCG-CG-GATCCCACATTCTG-RG-GAAGACTTCAAATCCTTGTATTCT. Cet oligo est synthétisée par Dharmacon Thermo Scientific (Lafayette, CO) à 200 nM d'échelle, et est dessalé, déprotégé et utilisé sans purification PAGE. B. Préparation de l'Oligo contenant de l'ARN pour la transformation de levure (modifié à partir Storici et al., 2007 1) <ol><li> Essuyez les matériaux qui seront utilisés pour l'expérience, y compris les tubes oligo, pipettes, vortex, racks, zone d'expérimentation et de gants portés par l'enquêteur avec une solution de décontamination RNase pour enlever la contamination potentielle de RNase avant le début de tout. Utilisez l'eau sans RNase, réactifs chimiques, tubes et embouts de pipette dans toutes les étapes. Chaque étape de cette expérimentation devrait être exempte de RNase. </li><li> Reprendre le Thermo Scientific Dharmacon ARN contenant des oligo reçus de la société à 250 pmoles / ul solution stock d'eau exempte de RNase et vortexer vigoureusement pour dissoudre le culot. Conserver à -80 ° C. </li><li> Juste avant la transformation, le dégel des oligo-ARN contenant de la glace et diluer à 50 pmoles / ul avec l'eau sans RNase dans les tubes sans RNase. Chaque transformation nécessite une nmole des oligos contenant de l'ARN. </li><li> Dénaturer un montant choisi des oligos contenant de l'ARN sur le bloc de 100 ° C chaleur pendant 2 min pour éliminer les structures secondaires des oligos. </li><li> Immédiatement après dénaturation placer le tube sur la glace. Restez sur la glace jusqu'à la transformation. </li><li> Comme le contrôle dans l'expérience un ADN correspondant oligo-seule est utilisée. Cet oligo est décongelé de -20 ° C et préparées pour la transformation comme les oligo-ARN contenant, comme décrit ci-dessus. </li></ol> Transformation des cellules de levure C. utilisant les oligo-ARN contenant <ol><li> Inoculer 5 ml de milieu liquide riche YPD avec les cellules de levure mutante trp5 et croître à 30 ° C pendant la nuit (voir matériaux). </li><li> Transfert 1,5 ml de la culture de nuit dans 50 ml de milieu liquide YPD. </li><li> Incuber les cellules dans un shaker à 30 ° C (225 rpm) pendant 4h. </li><li> Préparer la solution 1et la solution 2 immédiatement avant la transformation de RNase tubes (voir matériaux). </li><li> Transfert de la culture cellulaire à un 50 ml sans RNase tube et tournent à 3000 rpm, ce qui correspond à 1562 g, pendant 2 min. Le culot de la précipitation cellulaire est d'env. 0,3 cm 3. </li><li> Retirer le surnageant et laver les cellules avec 50 ml d'eau exempte de RNase et de spin à 3000 rpm pendant 2 min. </li><li> Répétez l'étape 6 pour 5 fois pour se débarrasser du milieu de culture et RNases qui pourraient être présents dans le milieu autant que possible. </li><li> Retirer le surnageant et remettre les cellules dans 5 ml de solution 1 et tournent à 3000 rpm pendant 2 min. </li><li> Retirer les cellules surnageant et remettre dans 250 ul de la solution 1. Cette quantité de cellules est suffisant pour 7-8 transformations. </li><li> Aliquote de 50 pi de la suspension de cellules dans des microtubes sans RNase, ajouter 20 ul d'ARN contenant une solution d'oligo travail (1 nmole), ou 20 pi de l'ADN seule solution oligo travail (1 nmole), ou 20 pl d'eau stérile sans oligo pour le contrôle négatif. Puis ajouter 300 pi de solution de 2 pour chaque réaction de transformation. Il n'est pas nécessaire d'ajouter d'ADN de sperme de saumon dans le processus de transformation, comme l'acte oligos comme support eux-mêmes. </li><li> Vortex vigoureusement pour mélanger les composants de manière homogène. </li><li> Incuber réactions de transformation à 30 ° C pendant 30 min dans un shaker. </li><li> Choc thermique à 42 ° C pendant 15 min. </li><li> Isoler les cellules à 5000 rpm, correspondant à 2236 g, pendant 4 min. </li><li> Retirer les cellules surnageant et remettre dans 100 pl d'eau stérile. </li><li> Prélever une partie aliquote de cette suspension cellulaire et le diluer avec de l'eau stérile de 100.000 fois et cellules de la plaque sur une plaque YPD utilisant environ. 15 billes de verre stériles et incuber à 30 ° C pendant 2 jours. </li><li> Plaque toutes les cellules en suspension de chaque réaction de transformation sur une boîte de Pétri d'un milieu solide synthèse complète sans tryptophane (SC-Trp) en utilisant environ. 15 billes de verre stériles et incuber à 30 ° C pendant 4-5 jours (figure 2). </li></ol> D. Analyse de la correction de gène par l'ARN-Oligo contenant <ol><li> Comptez le nombre de colonies cultivées sur le milieu sélectif (figure 2) ainsi que sur le milieu YPD pour calculer la fréquence de correction génique pour les oligo-ARN contenant l'ADN oligo-seulement et pour le contrôle sans oligo. Comparez le nombre obtenu. Taux de réversion spontanée de la trp5 allèles avec les suppressions de deux de base et la mutation non-sens est moins à 10-9 dans la souche de levure utilisée, donc nous nous attendons à aucune formation des colonies sur le milieu sélectif quand aucun oligos sont ajoutés aux cellules. </li><li> Streak à plusieurs choisis au hasard sur des colonies transformantes milieu YPD pour obtenir des isolats seule colonie. Attendez deux jours pour la croissance de colonies, puis prendre plusieurs (au moins 5) des colonies isolées et de faire des patchs sur le YPD et sur un milieu sélectif. </li><li> Conception d'une paire d'amorces pour amplifier la région (250-1,000 pb) ciblées par les oligo-ARN contenant par PCR sur colonie (figure 1B). La procédure de PCR sur colonie est comme suit (modifié à partir Storici et Resnick, 2006 2). <ol><li> Resuspendre les cellules (environ 1 mm3) de la prise correctifs individuels dans 50 pi d'eau et ajouter 1 unité de lyticase. Incuber à température ambiante pendant 10 minutes, suivie d'une incubation dans un bloc chauffant à 100 ° C pendant 5 min pour briser les cellules et l'ADN génomique communiqué en solution. </li><li> Les conditions de PCR: La réaction de PCR comprend 10 ul de la solution de resuspension cellulaire, 50 pmoles chacune des amorces avant et arrière, 1 pl de 10 mM de dNTPs, 1 unité de Taq polymérase, 5 pi de tampon 10x et est ajusté à l'eau stérile à une volume final de 50 ul. Le programme de PCR est de 3 min à 95 ° C, 30 cycles de 30 s à 95 ° C, 30 s à 55 ° C, et 1 min à 72 ° C, un temps d'extension finale de 7 min à 72 ° C, puis des échantillons sont conservés à 4 ° C. Une extension temps de 1 min / kb est supposé pour cette réaction. </li><li> Après PCR, les échantillons sont exécutés sur un gel à 1% ou 2% (selon la taille attendue du produit de PCR) pour l'observation d'agarose des produits de PCR (figure 3). </li></ol></li><li> Si l'information génétique transmis par les oligo-ARN contenant génère un nouveau site de restriction dans la région cible de la levure génomique (figure 1B), il est possible de vérifier le transfert correct des informations en digérant le produit PCR avec les enzymes de restriction appropriées. Si aucun site de restriction est généré par les oligo-ARN contenant, passez à l'étape 6. Recueil des produits de PCR utilisant une enzyme de restriction spécifique. La réaction de digestion comprend 6 ul de produit PCR, tampon, BSA (peut ne pas être nécessaire pour certaines enzymes, voir les instructions pour l'enzyme utilisée), 0,5 pi de l'enzyme de restriction et de l'eau stérile à 15 pi. Les échantillons sont incubés pendant 1 h à la température spécifique de l'enzyme utilisée. </li><li> Exécuter un échantillon non digérés avec les échantillons digérés sur la même ligne d'un gel d'agarose à 2%observer les modifications génétiques transférées par le tube de l'ARN oligo-ARN contenant (figure 3). </li><li> Purifier les produits de PCR en utilisant un kit de purification PCR et les préparer pour le séquençage d'ADN. Soumettre les échantillons pour le séquençage avec les mêmes amorces utilisées pour amplifier le produit. </li><li> Analyser les résultats de séquençage de l'ADN en utilisant un logiciel qui permet l'alignement des séquences multiples avec une séquence de référence choisie (figure 4). </li></ol> E. traitement alcalin de l'oligo-ARN contenant (figure 5) <ol><li> Pour chaque réaction, ajouter 1 nmole (4 pi de 250 pmoles / ul solution stock) de l'oligo-ARN contenant, ou de l'ADN-oligo dans un tube de 1,5 ml. </li><li> Ajouter 4 pi de NaOH 1 M pour l'hydrolyse, ou bien ajouter 4 ul H 2 O comme contrôle négatif, et incuber à 65 ° C dans un bain-marie pendant 1 h. Puis passer du bain d'eau à la glace. </li><li> Neutraliser avec 2 pi de 1,2 M HCl, 4 pi de 1 pl M Tris-HCl, et 4 de H 2 O, ou bien 6 ul de H 2 O et 4 pi de 1 M Tris-HCl pour le contrôle négatif. Restez sur la glace jusqu'à la transformation. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Schéma de l'appareil défectueux trp5 gènes et de l'allèle TRP5 corrigé par les oligo-ARN contenant. A) Le gène mutant trp5 contient une délétion 2-base (triangles noirs) et une base de mutation non-sens (astérisque). Le seul brin d'ARN contenant des oligo avec 2 base d'insertion (bleu boucle) et la substitution de base 1-ARN (rectangle rouge) générant un Van91 je place l'enzyme de restriction (indiqué par la tranche) est transformé en cellules de levure à corriger les défauts génétiques du gène trp5. B) Après le gène est réparé TRP5 par les oligo-ARN contenant (bases corrigées sont indiquées par des rectangles bleus), le site Van91 j'ai est généré dans le gène TRP5. Un fragment de 278 pb dont un seul site de restriction Van91 I TRP5 gène est amplifié par PCR par une paire d'amorces (P1 et P2). Le pb 177 pb et 101 fragments générés après digestion de la P1 et P2 PCR produit par Van91 I sont également représentées. <img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Résultat de la transformation avec les oligo-ARN contenant. A) Les cellules de levure transformées avec des oligo aucune ne forment pas une colonie sur le support SC-Trp, voir les plaques ab. B) Les plaques des colonies de levures cg montrent de plus en plus sur le SC-Trp après que les cellules sont transformées avec 1 nmole des oligo-ARN contenant. C) Plaques colonies hl de levures montrent de plus en plus sur le SC-Trp après que les cellules sont transformées avec 1 nmole de l'ADN uniquement correspondante oligo contrôle. <img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Détection de transfert d'information génétique de l'ARN contenant des oligo à l'ADN chromosomique de la levure par digestion de restriction du produit de PCR amplifiant la région génomique ciblée. 2% électrophorèse sur gel d'agarose des échantillons amplifiés par PCR par P1 et P2 et digéré par l'enzyme de restriction, je Van91. Les pistes 1, 8 et 15, échelle d'ADN avec des tailles de 100, 200, 300, 400 et 500 pb indiqué sur la gauche; piste 2, le produit de PCR de trp5 locus amplifié à partir de l'ADN génomique de la souche mutante trp5; piste 3, PCR produit amplifié de l'ADN génomique provenant d'une colonie de Trp + ciblés par les oligo-ADN seulement; voies 4-7, les produits de PCR amplifiés à partir de l'ADN génomique provenant Trp + colonies ciblées par les oligo-ARN contenant; piste 9 à 14 ans, Van91 digestion de restriction I des produits de PCR des voies de 2 à 7. La présence des bandes non coupées produit PCR dans les couloirs de 10 à 14 peut être expliquée par une digestion partielle par Van91 I au niveau du locus TRP5 (CCACATTCTGG). Considérant que le site de coupe pour Van91 I (CCANNNN NTGG) peut avoir plusieurs séquences, le site généré en TRP5 ne peut pas être la cible la plus optimale pour l'enzyme. En fait, l'ADN après séquençage de l'ensemble des produits de PCR ci-dessus nous détectons pas de changements supplémentaires à celles réalisées par les oligos (voir Figure 4). Les 278 pb amplifié par PCR la bande P1 et P2 amorces et les bandes de produit de digestion par Van91 I de 177 pb et 101 pb sont indiquées par les flèches sur la droite. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2152/2152fig4.jpg"><img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig4tmb.jpg" border="0" alt="Figure 4Pouce" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4Thumb"></a> Figure 4. L'ADN montrant les résultats du séquençage du gène de correction par les oligo-ARN contenant. Un électrophérogramme ADN) de la région génomique ciblée par les oligo-ARN contenant. Le G dans la séquence d'ADN (bleu encadré) provient de la RG sur les oligo-ARN contenant. Aussi coffret est l'insertion des bases CG. Résultats du séquençage de tous les produits de PCR autres sont aussi en tant que clear celui-ci, avec des signaux fluorescents bien au-dessus du fond. B) Les séquences de la région TRP5 de l'Trp + transformants ciblés par les oligo ADN seulement (T1) et les oligo contenant de l'ARN (T2-T5) correspondent à la séquence consensus sur le dessus et sont comparés avec celui de la trp5 cellules mutantes avant que le ciblage par les oligos (ADN génomique, rouge ombré). La réparation d'ARN contenant des oligo sur le fond a insertion d'ADN de deux de base et une base (G) la substitution d'ARN marqués en rouge. Les régions encadrées en bleu avec nuance jaune montrent que l'ARN contenant des oligo ainsi que les oligo-ADN que justement corrigé la mutation et la suppression mutation non-sens dans tous les échantillons testés. Les lignes en pointillés marquent la position de la séquence d'ARN contenant des oligo. <img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig5.jpg" alt="Figure 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 5"> Figure 5. Traitement alcalin empêche la correction de gène par l'ARN oligo-contenant. La fréquence de transformation par les oligo-ARN contenant (R) est indiqué dans la barre rouge et que par la oligo ADN uniquement (D) est indiqué dans les barres bleues. Les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne pour les trois transformations indépendantes pour chaque oligo. L'ADN ne oligo affiche la fréquence de transformation similaires avec et sans traitement de NaOH. Différemment, la fréquence de transformation par les oligo-ARN contenant des gouttes à 0 après un traitement par NaOH. Par conséquent, la préparation avec les oligo-ARN contenant n'est pas contaminé par l'ADN ne oligo, par conséquent, la fréquence de transformation observée est spécifique à l'oligo-ARN contenant.

<ol><li>Storici, F., Bebenek, K., Kunkel, T. A., Gordenin, D. A., Resnick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-templated+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNA-templated DNA repair.</a> Nature. 447, 338-3341 (2007).</li>
<li>Storici, F., Resnick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+delitto+perfetto+approach+to+in+vivo+site-directed+mutagenesis+and+chromosome+rearrangements+with+synthetic+oligonucleotides+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast.</a> Methods Enzymol. 409, 329-345 (2006).</li>
<li>Storici, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-mediated+DNA+modifications+and+RNA-templated+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">RNA-mediated DNA modifications and RNA-templated DNA repair.</a> Curr Opin Mol Ther. 10, 224-230 (2008).</li>
<li>Cerritelli, S. M., Crouch, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonuclease+H%3A+the+enzymes+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Ribonuclease H: the enzymes in eukaryotes.</a> FEBS J. 276, 1494-1505 (2009).</li>
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La production vidéo pour cet article a été parrainé par Thermo Fisher Scientific, qui produit des réactifs et des instruments utilisés dans cette publication.

Le fait que l&#39;ARN peut transférer l&#39;information génétique directement à l&#39;ADN génomique dans les cellules a été découvert exploiter l&#39;utilisation de l&#39;ARN synthétique contenant oligos (oligos synthétisés Dharmacon) 1. Il était la preuve de principe que les cellules peuvent utiliser l&#39;ARN contenant des molécules ou d&#39;ARN-seulement des séquences en tant que modèles pour la synthèse de l&#39;ADN. L&#39;utilisation d&#39;ARN contenant oligos non seulement conduit à la démonstration que l&#39;information génétique peut être transféré directement à partir de l&#39;ARN à l&#39;ADN génomique sans avoir besoin d&#39;une transcription inverse de copies d&#39;ADN intermédiaires, mais aussi à la preuve que l&#39;ARN peut être utilisé comme modèle dans homologue la réparation d&#39;un dommage 1,3 ADN. Les oligos peuvent être faites de l&#39;ARN-que ou qui contiennent juste un ribonucléotide simple intégré dans une séquence d&#39;ADN, comme dans l&#39;exemple, nous avons présenté ici. Les oligo-ARN contenant a un ribonucléotide embarqué destiné à corriger la mutation non-sens dans le génome défectueux trp5 allèle. Le transfert d&#39;information génétique de la ribonucléotide à l&#39;ADN génomique est révélée par un changement dans le phénotype (cellule en croissance sur le milieu dépourvu de tryptophane) des cellules ciblées. La fréquence de la correction de gène obtenu avec les oligo-ARN contenant est mesurée et comparée avec celle d&#39;un ADN ne contrôlent oligo. En effectuant ce test de correction de gènes dans des cellules différentes origines, où nous muter les gènes de la levure différentes, nous pouvons détecter quels sont les facteurs / s touchent spécifiquement le ciblage par les oligos contenant de l&#39;ARN. Ainsi, nous pouvons révéler les mécanismes de fonctionnement des cellules réguler la stabilité de l&#39;ADN / ARN hybrides. Par une simple conception de différentes variantes de la oligos contenant de l&#39;ARN, nous pouvons déterminer la probabilité pour un appareil particulier, l&#39;ARN pour servir de modèle dans la modification de l&#39;ADN et nous pouvons déterminer la stabilité des séquences d&#39;ARN spécifiques intégrés dans l&#39;ADN. Par ailleurs, nous pouvons identifier quelles sont les préférées des substrats in vivo de facteurs interagissant avec hybrides ARN / ADN. Alors que plusieurs études in vitro, principalement en utilisant courts ARN contenant oligos, ont été menées pour caractériser la fonction des facteurs qui peuvent reconnaître l&#39;ARN dans un hybride avec l&#39;ADN, telles que les enzymes H RNase 4, les fonctions in vivo de RNases H ainsi que l&#39;identité des autres protéines qui pourraient affecter ARN / ADN stabilité des hybrides demeurent inconnues. La possibilité d&#39;utiliser l&#39;ARN contenant oligos d&#39;une durée significative (50 à 80-mères) et de qualité optimale (telles que Thermo Scientific Dharmacon contenant de l&#39;ARN oligos) a ouvert la voie à l&#39;examen d&#39;un large éventail de processus moléculaires in vivo directement dans le cellules d&#39;intérêt. Comme indiqué dans cette vidéo, la transformation en utilisant l&#39;ARN contenant oligos nécessite essentiellement que quelques étapes supplémentaires par rapport à la transformation à l&#39;aide de molécules d&#39;ADN, afin de prévenir la dégradation par les RNases. Ainsi, la transformation en utilisant l&#39;ARN contenant oligos ne se limite pas à la levure, mais peuvent être appliquées à tout organisme ou un type de cellules où la transformation par l&#39;ADN oligos est compétent. En conclusion, le ciblage des cellules par l&#39;ARN contenant oligos offre la possibilité de générer des hybrides ARN / ADN et ribonucléotides intégré dans l&#39;ADN in vivo dans les cellules. La stabilité, la fonction et les conséquences de ces in vivo généré hybrides ARN / ADN peuvent être analysés et caractérisés, éventuellement découvrir des mécanismes inconnus de la réparation de l&#39;ADN et de révéler de nouvelles stratégies de ciblage génique.

Réactifs Transformation A. et les médias (modifié à partir Storici et Resnick, 2006 <ol><li> YPD (levure-peptone dextrose): Pour 1 L, 10 g extrait de levure, 20 g de soja peptone, 20 g de dextrose. Ajouter 15 g d&#39;agar pour faire YPD milieu solide. Autoclave avant utilisation. Stocker à température ambiante. </li><li> Solution 1: 0,1 M d&#39;acétate de lithium. Préparer immédiatement avant la transformation. La solution 1 est une solution de travail, il est donc préparée directement à partir de la poudre. Pas de solution stock est faite. Conserver à température ambiante. LiAc augmente la perméabilité de la paroi des cellules de levure à l&#39;ADN. </li><li> Solution 2: 0,1 M d&#39;acétate de lithium et 50% de polyéthylène glycol 4000. Aussi la solution 2 est une solution de travail et elle est faite directement à partir de la poudre. Pas de solution mère est préparée. Conserver à température ambiante. Dépôts PEG oligos sur des cellules de levure. </li><li> Contenant de l&#39;ARN oligos (Thermo Scientific Dharmacon), 50-80-Mers, dessalé, déprotégé et non purifiée. Resuspendre à 250 pmoles / ul. Conserver à -80 ° C. </li><li> ADN ne oligos, 50-80-Mers, dessalé et non purifiée. Resuspendre à 50 pmol / ul. Conserver à -20 ° C. </li><li> SC-Trp (Synthetic milieu complet dépourvu de tryptophane) des milieux solides. </li><li> 0,5 cm de diamètre des perles de verre, stérilisé à l&#39;autoclave. </li><li> RNase-off: la solution de décontamination RNase. </li><li> DNase / RNase, des tubes à centrifuger stériles. </li><li> DNase / RNase, stériles tubes coniques. </li><li> DNase / RNase, stérile en aérosol embouts de pipette avec ZAP: 1-200 ml, 100-1000 ml. </li></ol> B. Colonie matériaux PCR. <ol><li> Amorces d&#39;ADN, dessalé et non purifiée. Dissoudre dans l&#39;eau stérile à 50 pmol / ul. Conserver à -20 ° C. </li><li> ADN-polymérase Taq, tampon, des dNTP. </li><li> Les tubes PCR. </li></ol> C. PCR purification. <ol><li> Kit de purification de PCR. </li></ol> D. gel d&#39;électrophorèse. <ol><li> Agarose. </li><li> 1 x tampon TBE de fonctionnement (45 tétracétate mM Tris-borate et 1 mM éthylènediamine) dilué de TBE 10x. </li><li> Précolorés marqueur de poids moléculaire. </li><li> Colorant de chargement d&#39;ADN. </li></ol> Digestion de restriction E.. <ol><li> Les enzymes de restriction, les tampons 10x, BSA. </li></ol> F. traitement alcalin pour les oligo-ARN contenant. <ol><li> 1 M de solution de NaOH. </li><li> 1,2 M de solution de HCl. </li><li> 1 M de Tris-HCl, pH 7,4 solution. </li></ol>

génération d&#39;adn / arn hybrides d&#39;adn génomique par la transformation en utilisant l&#39;arn contenant oligonucléotides

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthétique courte polymères d&#39;acides nucléiques, les oligonucléotides (oligos), sont les outils les plus fonctionnels et généralisée de la biologie moléculaire. Oligos peuvent être produites pour contenir toute l&#39;ADN ou l&#39;ARN désiré séquence et peut être prêt à inclure une grande variété de base et des modifications de sucre. Par ailleurs, les oligos peuvent être conçus pour imiter altérations spécifiques des acides nucléiques et par conséquent, peuvent servir d&#39;outils importants pour étudier les effets des dommages à l&#39;ADN et les mécanismes de réparation. Nous avons constaté que Thermo Scientific Dharmacon contenant de l&#39;ARN oligos avec une longueur entre 50 et 80 nucléotides peut être particulièrement adapté pour étudier, in vivo, les fonctions et les conséquences de l&#39;ARN chromosomiques / hybrides ADN et de ribonucléotides intégré dans l&#39;ADN. ADN / ARN hybrides peuvent facilement former lors de la réplication de l&#39;ADN, la réparation et la transcription, cependant, très peu est connu au sujet de la stabilité des ARN / ADN dans les cellules hybrides et dans quelle mesure ces hybrides peuvent affecter l&#39;intégrité génétique des cellules. Contenant de l&#39;ARN oligos, par conséquent, représenter un vecteur idéal pour introduire ribonucléotides dans l&#39;ADN chromosomique et de générer des hybrides ARN / ADN de longueur choisie et la composition de base. Nous présentons ici le protocole pour l&#39;incorporation des ribonucléotides dans le génome de la levure système modèle eucaryote / Saccharomyces cerevisiae /. Pourtant, notre laboratoire a utilisé Thermo Scientific Dharmacon contenant de l&#39;ARN oligos pour générer l&#39;ARN / ADN hybrides au niveau chromosomique dans différents systèmes cellulaires, des bactéries aux cellules humaines.

Ce travail montre comment former un hybride ARN / ADN au niveau chromosomique et de révéler le transfert de l&#39;information génétique à partir d&#39;ARN à l&#39;ADN génomique dans les cellules de levure.

Génération d&#39;ADN / ARN hybrides d&#39;ADN génomique par la transformation en utilisant l&#39;ARN contenant Oligonucléotides

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L'objectif général de l'expérience suivante est de produire des hybrides ARN-ADN au niveau chromosomique dans des cellules de levure vivantes en transformant les cellules de levure avec des oligonucléotides contenant de l'ARN. Cela est réalisé en introduisant un oligonucléotide simple brin contenant de l'ARN dans des cellules de levure en division. L'oligonucléotide s'appariera ensuite avec la région complémentaire d'un gène marqueur muté situé sur un chromosome de levure, formant ainsi un hybride ARN-ADN. Dans une deuxième étape, les cellules transformées par l'oligonucléotide contenant de l'ARN sont étalées sur un milieu sélectif.Cela permet la croissance de cellules dans lesquelles la portion ARN de l'oligo sert de modèle pour la correction du gène marqueur muté. Ensuite, les colonies de levures croissant sur les milieux sélectifs sont dénombrées afin de déterminer la fréquence de correction du gène par l'oligo contenant de l'ARN ; les résultats obtenus révèlent le transfert d'information génétique depuis la séquence d'ARN de l'oligo vers le gène marqueur muté dans le génome de la levure. Ceci est mis en évidence par l'analyse de restriction, l'analyse de séquençage et le test de sensibilité à l'alcali.Bonjour, je suis le fondateur de HIN, le laboratoire de la Dre Francesca à l'école de biologie du Georgia Institute of Technology. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant de générer des hybrides ARN-ADN au niveau chromosomique dans des cellules de levure vivantes. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier comment la présence d'ARN intégrés dans l'ADN génomique est tolérée par les cellules et pour déterminer quels facteurs influencent la stabilité des hybrides ARN-ADN in vivo.Commençons donc. Avant le début de cette procédure, nettoyez tous les matériaux qui seront utilisés pour l'expérience, y compris les tubes d'oligonucléotides, les pipettes, les supports de vortex, la zone expérimentale et les gants portés par l'expérimentateur, à l'aide d'une solution de décontamination anti-RNAses. Afin d'éliminer toute contamination potentielle par les RNAses, utilisez de l'eau sans RNAses, des réactifs chimiques, des tubes et des embouts de pipette exempts d'RNAses tout au long de la procédure.Obtenez un oligonucléotide contenant de l'ARN afin de transférer l'information génétique à l'ADN génomique de cellules de levure. La souche de levure utilisée contient un gène trip cinq muté présentant une délétion de deux bases et une mutation non-sens. Une telle souche de levure est un mutant auxotrophe pour le tryptophane et ne forme pas de colonies sur un milieu dépourvu de tryptophane.L'oligo contenant de l'ARN est un 65 MER avec une insertion d'ADN à deux bases conçue pour corriger la mutation par délétion. En outre, l'oligo possède un ribonucléotide destiné à corriger la mutation non-sens de l'allèle trip cinq. Une fois obtenu, préparez l'oligo contenant de l'ARN en une solution mère de 250 micromolaire comme décrit dans le protocole écrit. Inoculez 16 heures avant la transformation avec l'oligo contenant de l'ARN.Cinq millilitres de milieu liquide riche YPD (extrait de levure, peptone, dextrose) contenant les cellules de levure mutantes trip cinq sont préparés et les cellules sont cultivées à 30 degrés Celsius pendant la nuit. Après l'incubation nocturne, transférer 1,5 millilitre de la culture de nuit dans 50 millilitres de milieu liquide YPD. Incuber les cellules dans un agitateur à 30 degrés Celsius à 225 tours par minute pendant quatre heures, juste avant la transformation par décongélation.Les oligos contenant de l'ARN et les oligos d'ADN correspondants sur de la glace. Les oligos d'ADN correspondants sont utilisés comme témoin positif. Diluer les oligos à 50 micromolaire avec de l'eau exempte d'ARN dans des tubes exempts d'ARN.Préparez 70 microlitres de chaque oligonucleotide afin d'obtenir suffisamment d'échantillon pour trois transformations d'un mol, avec un léger excès. Dénaturez les oligonucleotides contenant de l'ARN et les oligonucleotides d'ADN uniquement sur un bloc chauffant à 100 degrés Celsius pendant deux minutes afin d'éliminer les structures secondaires des oligonucleotides immédiatement après la dénaturation. Placez les tubes sur de la glace et maintenez-les au frais jusqu'au moment de la transformation. Préparez la solution un et la solution deux immédiatement avant la transformation dans des tubes exempts d'ARN. Transférez la culture cellulaire dans un tube de 50 millilitres exempt d'ARN et centrifugez à 3000 tours par minute, correspondant à 1 562 × g, pendant deux minutes.Retirez le surnageant et lavez les cellules avec 50 millilitres d’eau exempte de RNAs. Centrifugez à nouveau les cellules à 3000 tours par minute pendant deux minutes. Répétez ce processus cinq fois afin d’éliminer le milieu de culture et tous les RNAs qui pourraient être présents après la dernière centrifugation.Retirez le surnageant et re-suspendez les cellules dans cinq millilitres de solution un. Faites centrifuger l'échantillon à 3000 tours par minute pendant deux minutes, jetez le surnageant et ajoutez 250 microlitres de solution un aux cellules. Cette quantité de cellules est suffisante pour sept à huit transformations.Prélvez 50 microlitres de la suspension cellulaire dans chacun de sept tubes microcentrifuges exempts d'ARN. Ensuite, ajoutez 20 microlitres de l'oligo contenant l'ARN à 50 micromolaire dans trois tubes, 20 microlitres de l'oligo d'ADN uniquement à 50 micromolaire dans trois autres tubes, et 20 microlitres d'eau stérile sans oligo pour le témoin négatif dans un tube.Ensuite, ajouter 300 microlitres de la solution deux pour chacune des sept réactions de transformation. Vortexer énergiquement les échantillons pour mélanger les composants. Incuber les réactions de transformation à 30 degrés Celsius pendant 30 minutes dans un agitateur après l'incubation.Chauffer les échantillons à 42 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ensuite, centrifuger les cellules à 5 000 tours par minute, ce qui correspond à 2 236 ×g, pendant quatre minutes. Éliminer l'agent SUP et resuspendre les cellules dans 100 microlitres d'eau stérile pour plusieurs des trois tubes.Prélevez un aliquot de cette suspension cellulaire et diluez chaque aliquot avec de l'eau stérile d'un facteur 100 000. Ajoutez environ 15 billes de verre stériles par boîte et déposez 100 microlitres des cellules diluées d'un facteur 100 000 sur trois boîtes de milieu YPD solide. Déposez 100 microlitres des cellules resuspendues provenant de chaque réaction de transformation sur une boîte de Pétri contenant un milieu synthétique complet solide sans tryptophane, puis agitez uniformément les boîtes.Ensuite, retirez les billes. Incubez les cellules sur des géloses YPD à 30 degrés Celsius pendant deux jours et incubez les cellules étalées sur un milieu solide synthétique complet sans tryptophane à 30 degrés Celsius pendant quatre à cinq jours. Comptez et comparez le nombre de colonies développées sur le milieu sélectif ainsi que sur le milieu YPD afin de calculer la fréquence de correction génique pour l'oligonucléotide contenant de l'ARN, pour l'oligonucléotide d'ADN seul et pour le témoin sans oligonucléotide.Aucune formation de colonie n'est attendue sur le milieu sélectif lorsqu'aucun oligonucléotide n'est ajouté aux cellules. Repiquer plusieurs colonies transformées choisies au hasard sur un milieu YPD afin d'obtenir des isolats de colonies uniques. Incuber les cellules pendant deux jours à 30 degrés Celsius pour permettre la croissance des colonies. Après l'incubation, prélever plusieurs colonies uniques et réaliser des taches sur milieu YPD et sur le milieu sélectif.Un milieu solide synthétique complet sans tryptophane montre une croissance cellulaire après une incubation d'une journée chez les cellules transformées avec les oligonucléotides, mais pas chez la souche contrôle sans oligonucléotide sur le milieu solide synthétique complet sélectif sans tryptophane. Ensuite, concevoir une paire d'amorces permettant d'amplifier la région ciblée par l'oligonucléotide à ARN en utilisant la PCR sur colonies pour commencer la PCR sur colonies. Resuspendre les cellules prélevées à partir des colonies individuelles dans 50 microlitres d'eau contenant une unité de lyase, puis incuber les échantillons à température ambiante pendant 10 minutes, suivies d'une incubation dans un bloc chauffant à 100 degrés Celsius pendant cinq minutes afin de lyser les cellules et libérer l'ADN génomique en solution.Préparez les réactions de PCR dans des tubes PCR, en ajoutant 10 microlitres de la suspension cellulaire à chaque tube préparé, puis effectuez la réaction d'amplification comme décrit dans le protocole écrit. Analysez les échantillons obtenus sur un gel d'agarose à 1 % afin d'observer le produit de PCR. Étant donné que l'information génétique transférée par l'oligo contenant l'ARN génère dans cette expérience un nouveau site de restriction VAN 91 1 dans la région cible du génome de levure, il est possible de vérifier le transfert correct de l'information en digérant le produit de PCR avec l'enzyme de restriction van 91 1.Préparer la réaction de digestion en ajoutant six microlitres de produit PCR, un tampon BSA, 0,5 microlitre de l'enzyme de restriction et de l'eau stérile jusqu'à un volume final de 15 microlitres. Incuber les échantillons pendant une heure à 37 degrés Celsius. Faire migrer un échantillon non digéré en parallèle avec les échantillons digérés sur la même rangée d'un gel d'agarose à 2 % afin d'observer la modification génétique transférée par la séquence d'ARN de l'oligonucléotide contenant l'ARN.Purifiez les produits PCR en utilisant un kit de purification PCR et préparez-les pour le séquençage de l'ADN. Soumettez les échantillons au séquençage avec les mêmes amorces utilisées pour amplifier le produit. Enfin, analysez les résultats de séquençage de l'ADN à l'aide d'un logiciel permettant l'alignement de plusieurs séquences avec une séquence de référence choisie afin de réaliser un traitement alcalin de l'oligo contenant l'ARN pour chaque réaction, avec un mole de l'oligo contenant l'ARN ou de l'oligo d'ADN uniquement, dans un tube de 1,5 millilitre.Ensuite, ajoutez quatre microlitres d'hydroxyde de sodium un molaire pour l'hydrolyse ou quatre microlitres d'eau pour le témoin négatif. Incubez les échantillons à 65 degrés Celsius dans un bain-marie pendant une heure après l'incubation. Transférez la réaction sur de la glace.Neutraliser la réaction d'hydrolyse avec deux microlitres d'acide chlorhydrique 1,2 molaire, quatre microlitres de tris hydrochlorure un molaire et quatre microlitres d'eau pour le témoin négatif. Ajouter six microlitres d'eau et quatre microlitres de tris hydrochlorure un molaire. Conserver les échantillons sur de la glace jusqu'à ce que la transformation puisse être effectuée.Comme vient d'être décrit, les cellules de levure transformées sans oligo ne forment aucune colonie sur le milieu solide synthétique complet sans tryptophane fan. En revanche, les cellules cultivées sur milieu solide synthétique complet sans tryptophane après transformation avec un oligonucléotide ARN contenant un oligo montrent maintenant des colonies.Des colonies de levure poussent également sur un milieu solide synthétique complet sans tryptophane après transformation des cellules avec un nanomole de l'oligo témoin correspondant. La détection du transfert d'information génétique de l'oligo contenant l'ARN vers l'ADN chromosomique de levure est évidente par la digestion de restriction VAN 91 1 du produit PCR amplifiant la région génomique ciblée, comme illustré. Le produit PCR du locus trip. Five amplifié à partir de l'ADN génomique de la souche mutante trip. Five peut être observé.On voit également le produit de PCR amplifié à partir d'ADN génomique issu d'une colonie trip plus ciblée par l'oligo ADN uniquement. Les produits de PCR amplifiés à partir d'ADN génomique provenant de colonies trip plus ciblées par l'oligo contenant de l'ARN ont également été analysés sur le gel. Les résultats de la digestion par la restriction van 91 1 des mêmes produits de PCR révèlent une bande amplifiée de 278 paires de bases et les bandes des produits de digestion par van 91 1 de 177 paires de bases et 101 paires de bases.Séquençage de l'ADN révélant la correction du gène par l'oligo contenant l'ARN ici. Un électrophérogramme d'ADN de la région génomique ciblée par l'oligo contenant l'ARN est présenté. Le g dans la séquence d'ADN provient du RG sur l'oligo contenant l'ARN go.Est également encadrée l'insertion des séquences de base CG de la région trip cinq des transformants trip plus ciblés par l'oligo ADN uniquement et l'oligo contenant de l'ARN, qui correspondent à la séquence consensus et sont comparées à celle du trip. Cinq cellules mutantes avant le ciblage par les oligos. L'oligo contenant l'ARN de réparation situé en bas présente une insertion de deux bases d'ADN et une substitution d'une base d'ARN.La région encadrée en bleu avec une teinte jaune montre que l'oligo contenant de l'ARN ainsi que l'oligo d'ADN uniquement ont corrigé avec précision la mutation par délétion et la mutation non-sens dans tous les échantillons testés ; les lignes en pointillés indiquent la position de la séquence de l'oligo contenant de l'ARN. Le traitement alcalin empêche la correction du gène par l'oligo contenant de l'ARN ; la fréquence de transformation par l'oligo contenant de l'ARN et par l'oligo d'ADN uniquement est indiquée. Les barres d'erreur représentent l'erreur type de la moyenne pour trois transformations indépendantes pour chaque oligo.L'oligo d'ADN uniquement présente une fréquence de transformation similaire en l'absence et en présence d'un traitement à l'hydroxyde de sodium. En revanche, la fréquence de transformation par l'oligo contenant de l'ARN chute à zéro après un traitement à l'hydroxyde de sodium. Par conséquent, la préparation contenant l'oligo à ARN n'est pas contaminée par l'oligo d'ADN uniquement.Ainsi, la fréquence de transformation observée est spécifique à l'oligo contenant l'ARN. Nous venons de vous montrer comment former un hybride A-R-N-A-D-N-A au niveau chromosomique et le transfert de l'information génétique de l'ARN vers l'ADN génomique dans les cellules de levure. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d'utiliser des oligos contenant de l'ARN de qualité excellente et de travailler dans des conditions exemptes d'ARN.Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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