Génération d'ADN / ARN hybrides d'ADN génomique par la transformation en utilisant l'ARN contenant Oligonucléotides

L'objectif général de l'expérience suivante est de produire des hybrides ARN-ADN au niveau chromosomique dans des cellules de levure vivantes en transformant les cellules de levure avec des oligonucléotides contenant de l'ARN. Cela est réalisé en introduisant un oligonucléotide simple brin contenant de l'ARN dans des cellules de levure en division. L'oligonucléotide s'appariera ensuite avec la région complémentaire d'un gène marqueur muté situé sur un chromosome de levure, formant ainsi un hybride ARN-ADN. Dans une deuxième étape, les cellules transformées par l'oligonucléotide contenant de l'ARN sont étalées sur un milieu sélectif.

Cela permet la croissance de cellules dans lesquelles la portion ARN de l'oligo sert de modèle pour la correction du gène marqueur muté. Ensuite, les colonies de levures croissant sur les milieux sélectifs sont dénombrées afin de déterminer la fréquence de correction du gène par l'oligo contenant de l'ARN ; les résultats obtenus révèlent le transfert d'information génétique depuis la séquence d'ARN de l'oligo vers le gène marqueur muté dans le génome de la levure. Ceci est mis en évidence par l'analyse de restriction, l'analyse de séquençage et le test de sensibilité à l'alcali.

Bonjour, je suis le fondateur de HIN, le laboratoire de la Dre Francesca à l'école de biologie du Georgia Institute of Technology. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant de générer des hybrides ARN-ADN au niveau chromosomique dans des cellules de levure vivantes. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier comment la présence d'ARN intégrés dans l'ADN génomique est tolérée par les cellules et pour déterminer quels facteurs influencent la stabilité des hybrides ARN-ADN in vivo.

Commençons donc. Avant le début de cette procédure, nettoyez tous les matériaux qui seront utilisés pour l'expérience, y compris les tubes d'oligonucléotides, les pipettes, les supports de vortex, la zone expérimentale et les gants portés par l'expérimentateur, à l'aide d'une solution de décontamination anti-RNAses. Afin d'éliminer toute contamination potentielle par les RNAses, utilisez de l'eau sans RNAses, des réactifs chimiques, des tubes et des embouts de pipette exempts d'RNAses tout au long de la procédure.

Obtenez un oligonucléotide contenant de l'ARN afin de transférer l'information génétique à l'ADN génomique de cellules de levure. La souche de levure utilisée contient un gène trip cinq muté présentant une délétion de deux bases et une mutation non-sens. Une telle souche de levure est un mutant auxotrophe pour le tryptophane et ne forme pas de colonies sur un milieu dépourvu de tryptophane.

L'oligo contenant de l'ARN est un 65 MER avec une insertion d'ADN à deux bases conçue pour corriger la mutation par délétion. En outre, l'oligo possède un ribonucléotide destiné à corriger la mutation non-sens de l'allèle trip cinq. Une fois obtenu, préparez l'oligo contenant de l'ARN en une solution mère de 250 micromolaire comme décrit dans le protocole écrit. Inoculez 16 heures avant la transformation avec l'oligo contenant de l'ARN.

Cinq millilitres de milieu liquide riche YPD (extrait de levure, peptone, dextrose) contenant les cellules de levure mutantes trip cinq sont préparés et les cellules sont cultivées à 30 degrés Celsius pendant la nuit. Après l'incubation nocturne, transférer 1,5 millilitre de la culture de nuit dans 50 millilitres de milieu liquide YPD. Incuber les cellules dans un agitateur à 30 degrés Celsius à 225 tours par minute pendant quatre heures, juste avant la transformation par décongélation.

Les oligos contenant de l'ARN et les oligos d'ADN correspondants sur de la glace. Les oligos d'ADN correspondants sont utilisés comme témoin positif. Diluer les oligos à 50 micromolaire avec de l'eau exempte d'ARN dans des tubes exempts d'ARN.

Préparez 70 microlitres de chaque oligonucleotide afin d'obtenir suffisamment d'échantillon pour trois transformations d'un mol, avec un léger excès. Dénaturez les oligonucleotides contenant de l'ARN et les oligonucleotides d'ADN uniquement sur un bloc chauffant à 100 degrés Celsius pendant deux minutes afin d'éliminer les structures secondaires des oligonucleotides immédiatement après la dénaturation. Placez les tubes sur de la glace et maintenez-les au frais jusqu'au moment de la transformation. Préparez la solution un et la solution deux immédiatement avant la transformation dans des tubes exempts d'ARN. Transférez la culture cellulaire dans un tube de 50 millilitres exempt d'ARN et centrifugez à 3000 tours par minute, correspondant à 1 562 × g, pendant deux minutes.

Retirez le surnageant et lavez les cellules avec 50 millilitres d’eau exempte de RNAs. Centrifugez à nouveau les cellules à 3000 tours par minute pendant deux minutes. Répétez ce processus cinq fois afin d’éliminer le milieu de culture et tous les RNAs qui pourraient être présents après la dernière centrifugation.

Retirez le surnageant et re-suspendez les cellules dans cinq millilitres de solution un. Faites centrifuger l'échantillon à 3000 tours par minute pendant deux minutes, jetez le surnageant et ajoutez 250 microlitres de solution un aux cellules. Cette quantité de cellules est suffisante pour sept à huit transformations.

Prélvez 50 microlitres de la suspension cellulaire dans chacun de sept tubes microcentrifuges exempts d'ARN. Ensuite, ajoutez 20 microlitres de l'oligo contenant l'ARN à 50 micromolaire dans trois tubes, 20 microlitres de l'oligo d'ADN uniquement à 50 micromolaire dans trois autres tubes, et 20 microlitres d'eau stérile sans oligo pour le témoin négatif dans un tube.

Ensuite, ajouter 300 microlitres de la solution deux pour chacune des sept réactions de transformation. Vortexer énergiquement les échantillons pour mélanger les composants. Incuber les réactions de transformation à 30 degrés Celsius pendant 30 minutes dans un agitateur après l'incubation.

Chauffer les échantillons à 42 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ensuite, centrifuger les cellules à 5 000 tours par minute, ce qui correspond à 2 236 ×g, pendant quatre minutes. Éliminer l'agent SUP et resuspendre les cellules dans 100 microlitres d'eau stérile pour plusieurs des trois tubes.

Prélevez un aliquot de cette suspension cellulaire et diluez chaque aliquot avec de l'eau stérile d'un facteur 100 000. Ajoutez environ 15 billes de verre stériles par boîte et déposez 100 microlitres des cellules diluées d'un facteur 100 000 sur trois boîtes de milieu YPD solide. Déposez 100 microlitres des cellules resuspendues provenant de chaque réaction de transformation sur une boîte de Pétri contenant un milieu synthétique complet solide sans tryptophane, puis agitez uniformément les boîtes.

Ensuite, retirez les billes. Incubez les cellules sur des géloses YPD à 30 degrés Celsius pendant deux jours et incubez les cellules étalées sur un milieu solide synthétique complet sans tryptophane à 30 degrés Celsius pendant quatre à cinq jours. Comptez et comparez le nombre de colonies développées sur le milieu sélectif ainsi que sur le milieu YPD afin de calculer la fréquence de correction génique pour l'oligonucléotide contenant de l'ARN, pour l'oligonucléotide d'ADN seul et pour le témoin sans oligonucléotide.

Aucune formation de colonie n'est attendue sur le milieu sélectif lorsqu'aucun oligonucléotide n'est ajouté aux cellules. Repiquer plusieurs colonies transformées choisies au hasard sur un milieu YPD afin d'obtenir des isolats de colonies uniques. Incuber les cellules pendant deux jours à 30 degrés Celsius pour permettre la croissance des colonies. Après l'incubation, prélever plusieurs colonies uniques et réaliser des taches sur milieu YPD et sur le milieu sélectif.

Un milieu solide synthétique complet sans tryptophane montre une croissance cellulaire après une incubation d'une journée chez les cellules transformées avec les oligonucléotides, mais pas chez la souche contrôle sans oligonucléotide sur le milieu solide synthétique complet sélectif sans tryptophane. Ensuite, concevoir une paire d'amorces permettant d'amplifier la région ciblée par l'oligonucléotide à ARN en utilisant la PCR sur colonies pour commencer la PCR sur colonies. Resuspendre les cellules prélevées à partir des colonies individuelles dans 50 microlitres d'eau contenant une unité de lyase, puis incuber les échantillons à température ambiante pendant 10 minutes, suivies d'une incubation dans un bloc chauffant à 100 degrés Celsius pendant cinq minutes afin de lyser les cellules et libérer l'ADN génomique en solution.

Préparez les réactions de PCR dans des tubes PCR, en ajoutant 10 microlitres de la suspension cellulaire à chaque tube préparé, puis effectuez la réaction d'amplification comme décrit dans le protocole écrit. Analysez les échantillons obtenus sur un gel d'agarose à 1 % afin d'observer le produit de PCR. Étant donné que l'information génétique transférée par l'oligo contenant l'ARN génère dans cette expérience un nouveau site de restriction VAN 91 1 dans la région cible du génome de levure, il est possible de vérifier le transfert correct de l'information en digérant le produit de PCR avec l'enzyme de restriction van 91 1.

Préparer la réaction de digestion en ajoutant six microlitres de produit PCR, un tampon BSA, 0,5 microlitre de l'enzyme de restriction et de l'eau stérile jusqu'à un volume final de 15 microlitres. Incuber les échantillons pendant une heure à 37 degrés Celsius. Faire migrer un échantillon non digéré en parallèle avec les échantillons digérés sur la même rangée d'un gel d'agarose à 2 % afin d'observer la modification génétique transférée par la séquence d'ARN de l'oligonucléotide contenant l'ARN.

Purifiez les produits PCR en utilisant un kit de purification PCR et préparez-les pour le séquençage de l'ADN. Soumettez les échantillons au séquençage avec les mêmes amorces utilisées pour amplifier le produit. Enfin, analysez les résultats de séquençage de l'ADN à l'aide d'un logiciel permettant l'alignement de plusieurs séquences avec une séquence de référence choisie afin de réaliser un traitement alcalin de l'oligo contenant l'ARN pour chaque réaction, avec un mole de l'oligo contenant l'ARN ou de l'oligo d'ADN uniquement, dans un tube de 1,5 millilitre.

Ensuite, ajoutez quatre microlitres d'hydroxyde de sodium un molaire pour l'hydrolyse ou quatre microlitres d'eau pour le témoin négatif. Incubez les échantillons à 65 degrés Celsius dans un bain-marie pendant une heure après l'incubation. Transférez la réaction sur de la glace.

Neutraliser la réaction d'hydrolyse avec deux microlitres d'acide chlorhydrique 1,2 molaire, quatre microlitres de tris hydrochlorure un molaire et quatre microlitres d'eau pour le témoin négatif. Ajouter six microlitres d'eau et quatre microlitres de tris hydrochlorure un molaire. Conserver les échantillons sur de la glace jusqu'à ce que la transformation puisse être effectuée.

Comme vient d'être décrit, les cellules de levure transformées sans oligo ne forment aucune colonie sur le milieu solide synthétique complet sans tryptophane fan. En revanche, les cellules cultivées sur milieu solide synthétique complet sans tryptophane après transformation avec un oligonucléotide ARN contenant un oligo montrent maintenant des colonies.

Des colonies de levure poussent également sur un milieu solide synthétique complet sans tryptophane après transformation des cellules avec un nanomole de l'oligo témoin correspondant. La détection du transfert d'information génétique de l'oligo contenant l'ARN vers l'ADN chromosomique de levure est évidente par la digestion de restriction VAN 91 1 du produit PCR amplifiant la région génomique ciblée, comme illustré. Le produit PCR du locus trip. Five amplifié à partir de l'ADN génomique de la souche mutante trip. Five peut être observé.

On voit également le produit de PCR amplifié à partir d'ADN génomique issu d'une colonie trip plus ciblée par l'oligo ADN uniquement. Les produits de PCR amplifiés à partir d'ADN génomique provenant de colonies trip plus ciblées par l'oligo contenant de l'ARN ont également été analysés sur le gel. Les résultats de la digestion par la restriction van 91 1 des mêmes produits de PCR révèlent une bande amplifiée de 278 paires de bases et les bandes des produits de digestion par van 91 1 de 177 paires de bases et 101 paires de bases.

Séquençage de l'ADN révélant la correction du gène par l'oligo contenant l'ARN ici. Un électrophérogramme d'ADN de la région génomique ciblée par l'oligo contenant l'ARN est présenté. Le g dans la séquence d'ADN provient du RG sur l'oligo contenant l'ARN go.

Est également encadrée l'insertion des séquences de base CG de la région trip cinq des transformants trip plus ciblés par l'oligo ADN uniquement et l'oligo contenant de l'ARN, qui correspondent à la séquence consensus et sont comparées à celle du trip. Cinq cellules mutantes avant le ciblage par les oligos. L'oligo contenant l'ARN de réparation situé en bas présente une insertion de deux bases d'ADN et une substitution d'une base d'ARN.

La région encadrée en bleu avec une teinte jaune montre que l'oligo contenant de l'ARN ainsi que l'oligo d'ADN uniquement ont corrigé avec précision la mutation par délétion et la mutation non-sens dans tous les échantillons testés ; les lignes en pointillés indiquent la position de la séquence de l'oligo contenant de l'ARN. Le traitement alcalin empêche la correction du gène par l'oligo contenant de l'ARN ; la fréquence de transformation par l'oligo contenant de l'ARN et par l'oligo d'ADN uniquement est indiquée. Les barres d'erreur représentent l'erreur type de la moyenne pour trois transformations indépendantes pour chaque oligo.

L'oligo d'ADN uniquement présente une fréquence de transformation similaire en l'absence et en présence d'un traitement à l'hydroxyde de sodium. En revanche, la fréquence de transformation par l'oligo contenant de l'ARN chute à zéro après un traitement à l'hydroxyde de sodium. Par conséquent, la préparation contenant l'oligo à ARN n'est pas contaminée par l'oligo d'ADN uniquement.

Ainsi, la fréquence de transformation observée est spécifique à l'oligo contenant l'ARN. Nous venons de vous montrer comment former un hybride A-R-N-A-D-N-A au niveau chromosomique et le transfert de l'information génétique de l'ARN vers l'ADN génomique dans les cellules de levure. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d'utiliser des oligos contenant de l'ARN de qualité excellente et de travailler dans des conditions exemptes d'ARN.

Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.