Intracrânienne allogreffe orthotopique de cellules dans des souris immunodéprimées Médulloblastome

Ce protocole décrit l'isolement et la dissociation des tissus médulloblastome de la souris, et après allogreffe de cellules tumorales dans des souris immunodéprimées bénéficiaires afin d'initier un médulloblastome secondaire.

L’objectif global de cette procédure est de créer des cellules tumorales de médulloblastome allogreffes topiques dans un hôte immunodéprimé pour initier une tumeur secondaire. Ceci est accompli en associant d’abord le tissu primaire du médulloblastome en cellules uniques et en petits agrégats cellulaires. La deuxième étape de la procédure consiste à préparer des souris immunodéprimées à l’injection intracrânienne.

La troisième étape de la procédure consiste à effectuer une micro-injection de cellules tumorales dans le cervelet hôte. Les dernières étapes de la procédure consistent à maintenir et à observer les hôtes greffés de cellules tumorales. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent la formation secondaire d’un médulloblastome chez les hôtes par les symptômes neurologiques affichés et l’analyse histologique.

Cette technique peut aider à répondre à des questions clés en biologie du cancer, telles que la détermination de l’origine cellulaire d’une tumeur et des facteurs importants pour l’initiation et la propagation des tumeurs, Microdisecter et dissocier le tissu tumoral de m épargnant le médulloblastome comme décrit dans l’article vidéo d’accompagnement, l’isolement, l’enrichissement et la maintenance des lignées cellulaires de médulloblastome diluent la suspension de cellules tumorales dans un milieu de cellules souches neurologiques, de sorte que quatre microlitres de solution contiennent le nombre approprié de cellules tumorales dissociées. Ici, cinq fois 10 puissance six cellules. Conservez la suspension cellulaire diluée dans un microtube à centrifuger de 200 microlitres sur de la glace.

Utilisez une tondeuse à cheveux pour raser la région postérieure de la tête dorsale d’une souris hôte immunodéprimée anesthésiée, révélant le crâne postérieur. Appliquez la solution de bétadine sur le cuir chevelu exposé, puis essuyez avec un tampon imbibé d’alcool. Répétez deux fois ces deux étapes de stérilisation.

Utilisez un scalpel stérile pour faire une incision d’un quart de pouce dans le cuir chevelu postérieur. Utilisez une perceuse dentaire stérile pour percer un trou de fraise de 0,5 millimètre, deux millimètres à droite et deux millimètres en arrière du lambda. Accrochez les souris hôtes en tailles sur un cadre stéréotaxique.

Pour sécuriser la souris, chargez une seringue biseautée de 10 microlitres. Avec quatre microlitres de suspension de cellules tumorales, fixez la seringue à un micromanipulateur sur le cadre. Sous le microscope, descendez avec précaution et positionnez la pointe de l’aiguille dans le trou de la fraise.

Lorsque le biseau de la seringue se trouve sous la surface du crâne, descendez sur trois millimètres. Reculez ensuite les 0,5 millimètres pour créer un espace entre la pointe de l’aiguille et le tissu cérébelleux. Lentement avec une force constante sur 30 secondes, injectez quatre microlitres de suspension de cellules tumorales dans le cervelet de la souris hôte.

Laissez l’aiguille en place pendant deux minutes. Retirez l’aiguille et la seringue. Utilisez un clip automatique stérile pour sceller la plaie.

Laissez la souris récupérer sur une couverture chauffante. Après l’opération, replacez la souris dans une cage d’habitation stérile et surveillez le comportement et l’infection au site d’injection. Sept jours après l’opération, retirez le clip automatique.

Les souris présenteront des symptômes typiques du médulloblastome, des symptômes entre deux et six mois. Voici un exemple typique de tissu de médulloblastome secondaire développé 26 jours après l’injection de cinq fois 10 dans les cinq cellules tumorales primaires. La coloration à l’hématoblastome révèle la morphologie cellulaire typique du médulloblastome, y compris un rapport nucléaire/cytoplasmique élevé et un polymorphisme nucléaire.

Ces cellules tumorales secondaires sont très prolifératives, comme l’indique l’expression de KI 67, et elles expriment également de manière robuste M two YFP lissé membraneux. Utilisation du protocole compagnon pour les blastes de modelo de souris primaires, cellules de stomie. Ces cellules de stomie secondaires peuvent être cultivées et élargies pour plusieurs passages.

Les flèches rouges pointent vers des globules rouges. Voici la même colonie tumorale représentative cultivée à quatre jours et à 14 jours. Les cellules tumorales cultivées sont bipolaires, allongées avec un cytoplasme à balayage et rayonnent souvent à partir d’un noyau dense d’agrégats cellulaires.

Lors de ces procédures, il est important de créer un espace approprié entre le tissu céréral et la pointe de l’aiguille d’injection en l’envoyant à 0,5 millimètre après l’avoir abaissé à trois millimètres sous la surface du crâne.