Name: Adénovirus suppression génétique des molécules de signalisation dans les cultures de fibroblastes de souris embryonnaires primaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Découvrez une méthode d'excision génique efficace par adénovirus dans des fibroblastes embryonnaires de souris. Cette technique permet d'étudier le rôle de Rac1 dans la dynamique de l'actine.

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Les auteurs tiennent à remercier le Dr Scott Rizaldy au Mount Sinai Hospital à Toronto, en Ontario, pour son don de la première Rac1 flox / flox fibroblastes embryonnaires de souris. Ce travail a été soutenu par des subventions de fonctionnement à NJ par les Instituts canadiens de recherche en santé du Canada (IRSC, MOP 2009 à 93526) et les sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG, RG 327372-06). SH et MW sont pris en charge par CGSMA et CGS-M prix des IRSC et du CRSNG, respectivement. Steve Wills Hawley et Mélanie ont contribué également à ce document.

La décongélation des cellules <ol><li> Obtenir des fibroblastes de souris embryonnaires congelés (FAE) (généré précédemment à partir de cultures d'embryons individuels primaire) de l'azote liquide. </li><li> Décongelez les cellules en plongeant le flacon dans l'eau 37 ° C en remuant jusqu'à ce contenu est complètement dégelée. </li><li> Ajouter 9 ml de DMEM qui a été complété avec 10% de sérum de veau fœtal et 1% de pénicilline-streptomycine à une plaque de culture cellulaire de 10cm. </li><li> Ajouter la suspension cellulaire décongelée goutte à goutte à la plaque, le rock doucement la plaque pour disperser les cellules et les placer dans une plaque de 37 ° C CO, 5% 2 incubateur de la nuit. Notez que si les cellules sont sensibles à DMSO (à partir du processus de congélation), les médias initiale peut être remplacé par du milieu frais après que les cellules ont adhéré à la plaque (environ quatre heures après plaquage). Notez également que la confluence des cellules après décongélation dépend du nombre de cellules congelées, le taux de récupération des cellules après congélation, et le taux de croissance des cellules. </li></ol> Le repiquage des cellules <ol start="5"><li> Lorsque les cellules se sont développées essentiellement à 100% de confluence (ie: le lendemain), aspirer hors des médias et laver les cellules avec 5 ml de PBS stérile. </li><li> Retirer du PBS et ajouter 1 ml de trypsine EDTA 10mM contenant et laisser reposer la plaque dans l'incubateur pendant environ 5 minutes pour permettre aux cellules de se détacher de la plaque. </li><li> Lorsque les cellules se sont détachées, ajouter 9 ml de médias pour les cellules traitées à la trypsine, une pipette 2-3 fois pour disperser des bouquets, ajouter 1 ml de cette suspension goutte à goutte sur une nouvelle plaque contenant 9 ml de médias, et la place dans le présent 37 ° C durant la nuit incubateur . La présence de SVF dans les médias sera inactiver la trypsine variante, les cellules peuvent être d'abord lavé à diluer la trypsine. </li></ol> Comptage et le placage des cellules sur des lamelles <ol start="8"><li> Retirer les cellules de l'incubateur, les laver et trypsiniser comme avant, sauf que cette fois ajouter 5-6ml média retour aux cellules trypsinisées lieu de 9 ml. </li><li> Cellules pipette soigneusement pour assurer la dissociation complète en une suspension cellulaire unique, et retirer 15μL à combiner avec 15μL du bleu trypan dans un tube de micro séparé. </li><li> Mélanger cette suspension cellulaire / bleu trypan par pipetage de haut en bas plusieurs fois, et d'ajouter 15μL à l'hématimètre. </li><li> Sous le microscope, les cellules mortes apparaissent bleues. Comptez le nombre de cellules claires / incolore (vivant) dans l'une des grilles 4X4 sur l'hématimètre. Répéter cette compter sur les trois grilles 4X4 autres (notés A, B, C et D) et utiliser l'équation suivante pour calculer le nombre de cellules par uL de suspension: <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq0.jpg" alt="Équation 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="L'équation 1"></li><li> Grâce à l'optimisation du protocole, nous avons déterminé que le placage 30000 résultats dans les cellules densité cellulaire appropriée pour la visualisation à l'issue de l'expérience. </li><li> Pour calculer le volume de suspension cellulaire nécessaire pour 30 000 cellules, utilisez l'équation suivante: <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq1.jpg" alt="Équation 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Équation 2"></li><li> Maintenant, placez un bordereau de verre stériles couvrent dans chaque puits d'un plat et ajouter six 2mL des médias dans chaque puits, puis ajouter goutte à goutte à partir de votre suspension cellulaire le volume requis pour 30.000 cellules dans chaque puits. Notez que des lamelles de verre sont utilisés pour cette expérience que nous serons visualisant les cellules en utilisant la microscopie à fluorescence à un stade ultérieur; toutes les applications ne seront nécessairement microscopie, et donc de couvrir glisse peut-être pas nécessaire. </li></ol> Transduction Virus <ol start="15"><li> Après plusieurs heures ou toute la nuit (un temps suffisant pour s'assurer que les cellules adhèrent au lamelles), retirez les médias et laver les cellules avec 1 ml de DMEM sans sérum. </li><li> Ajouter 1 ml de milieu sans sérum dans chaque puits pour l'ajout du virus. Pour cette expérience, les virus adéno-Cre virus est obtenue commercialement à partir Biolabs Vector. </li><li> Optimisation des protocoles antérieurs ont montré que la multiplicité d'infection (MOI) de 500 fournit transduction très efficace dans les primaires FAE avec peu ou aucun effet sur la viabilité cellulaire. MOI peut être calculée comme suit: <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq2.jpg" alt="Équation 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Équation 3"> <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq3.jpg" alt="Équation 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="L'équation 4"></li><li> Ajouter le volume calculé du virus directement dans chaque puits qui est d'être infectés, secouez légèrement la plaque pour disperser les cellules du virus et le placer dans l'incubateur à 37 ° C pendant la nuit. </li><li> Le lendemain matin, enlever le virus milieux contenant des cellules et laver les cellules dans 1 ml de PBS stérile, puis ajouter 2 mL de médias régulièrement à chaque puits. </li><li> Dans le cas de l'Rac1 cellules illustré dans cette expérience, les changements morphologiques survenus dans les cellules à environ 72 heures après la transduction. </li></ol> Les résultats représentatifs Les cellules ont été de visualiserD par coloration avec la phalloïdine actine colorant (à des fins d'imagerie uniquement) et imagée en utilisant le Leica TCS-SP5 microscope confocal à balayage laser multiphotonique au Centre d'analyse avancée à l'Université de Guelph. La figure 1 montre la morphologie contracté et allongée de la Rac1 flox / flox cellules qui ont été exposés à l'adénovirus Cre virus comparé aux mêmes cellules non exposées au virus. <img src="/files/ftp_upload/2160/2160fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Comparaison entre Rac1 flox / flox cellules infectées par le virus adéno-Cre (à gauche) par rapport aux cellules non infectées de la même source (à droite).

<ol><li>Guo, F., Debidda, M., Yang, L., Williams, D. A., Zheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Deletion+of+Rac1+GTPase+Reveals+Its+Critical+Role+in+Actin+Stress+Fiber+Formation+and+Focal+Adhesion+Complex+Assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Genetic Deletion of Rac1 GTPase Reveals Its Critical Role in Actin Stress Fiber Formation and Focal Adhesion Complex Assembly.</a> J. Biol. Chem. 281, 18652-18659 (2006).</li>
<li>Glogauer, M., Marchal, C. C., Zhu, F., Worku, A., Clausen, B. E., Foerster, I., Marks, P., GP, D. owney, Dinauer, M., Kwiatkowski, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac1+deletion+in+mouse+neutrophils+has+selective+effects+on+neutrophil+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Rac1 deletion in mouse neutrophils has selective effects on neutrophil functions.</a> J. Immunol. 170, 5652-5657 (2003).</li>
<li>Prost, S., Sheahan, S., Rannie, D., Harrison, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+Cre+deletion+of+floxed+sequences+in+primary+mouse+cells+is+an+efficient+alternative+for+studies+of+gene+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated Cre deletion of floxed sequences in primary mouse cells is an efficient alternative for studies of gene deletion.</a> Nucleic Acids Res. 29, E80-E80 (2001).</li>
<li>Rijnkels, M., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-Cre-mediated+recombination+in+mammary+epithelial+early+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-Cre-mediated recombination in mammary epithelial early progenitor cells.</a> J. Cell. Sci. 114, 3147-3153 (2001).</li>
<li>Vidali, L., Chen, F., Cicchetti, G., Ohta, Y., Kwiatkowski, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac1-null+mouse+embryonic+fibroblasts+are+motile+and+respond+to+platelet-derived+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Rac1-null mouse embryonic fibroblasts are motile and respond to platelet-derived growth factor.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2377-2390 (2006).</li>
<li>Wang, H., Xie, H., Zhang, H., Das, S. K., Dey, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+gene+recombination+by+adenovirus-driven+Cre+in+the+mouse+uterus%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Conditional gene recombination by adenovirus-driven Cre in the mouse uterus.</a> Genesis. 44, 51-56 (2006).</li>
</ol>

Expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et les règlements énoncés par le Conseil canadien de protection des animaux.

La vidéo d&#39;accompagnement illustre bien comment un virus recombinant peut être utilisé pour exciser un gène spécifique in vitro en utilisant la recombinase Cre. L&#39;élaboration de ce protocole n&#39;a toutefois révéler certains points particuliers vaut adressage. <ul><li> Procédures de sécurité adéquates doivent toujours être employée lorsque l&#39;on travaille avec des adénovirus. Une blouse et les gants doivent être portés en tout temps tout en travaillant avec le virus. Médias et articles en plastique doivent être traitées avec l&#39;eau de Javel à 10% pendant au moins 30 minutes, et les articles en plastique doivent être autoclavés après. </li><li> Évitez répétés de gel-dégel du stock de virus car cela peut affecter titre du virus et réduire ainsi l&#39;efficacité de transduction. De petites quantités de stock de virus doivent d&#39;abord être répartie dans des tubes séparés. </li><li> MOI allant de 50 à 500 ont été testés pendant le développement de méthodes et les taux de transduction efficaces ont été observées dans la plupart des cas, sans effets négatifs sur la viabilité cellulaire. </li><li> Adéno-GFP a également été utilisé pendant le développement de méthodes pour déceler rapidement les efficacités de transduction. Ce contrôle (ou un vecteur vide) devrait être effectuée durant l&#39;expérience pour assurer que l&#39;infection virale ne suffit pas à entraîner des changements cellulaires. De même, si l&#39;excision du gène d&#39;intérêt floxés dans vos cellules ne résulte pas en des modifications cellulaires (changements de morphologie ou de la viabilité), puis infecter le même type de cellule avec des adéno-GFP est un contrôle important de l&#39;utiliser pour démontrer que la transduction du virus est produisent. </li></ul> Au-delà de l&#39;examen des cascades de signalisation dans la culture, l&#39;approche adéno-CRE a également été employée in vivo pour éliminer les gènes conditionnellement à partir d&#39;animaux expérimentaux 3,4, et d&#39;étiqueter des populations spécifiques de cellules dans un organisme 6. Le système de l&#39;adénovirus peut également être adapté pour introduire des gènes autres que la recombinase Cre dans les cellules hôtes. Deux principaux avantages de l&#39;utilisation de ce vecteur de livraison sont de sa transduction et une efficacité élevées livraison de gènes, et le manque d&#39;intégration avec les ADN de l&#39;hôte. Cependant, la génération de nouveaux adénovirus recombinants peut être beaucoup de travail. Le protocole décrit ici harnais donc la puissance du système en exploitant les adénoviraux précédemment développé adéno-Cre virus, et le couplage que grâce à notre allèle floxés d&#39;intérêt, Rac1. Grâce à ce coup conditionnelle à expérimenter, nous avons confirmé que la transduction utilisant le virus adéno-Cre du MEF portant un allèle Rac1 floxés en effet provoquer l&#39;excision de Rac1 menant à des changements dans la morphologie caractéristique cellulaire de cellules déficientes Rac1 2,5.

<table><tbody><tr><td>Virus Ad-CMV-Cre</td><td>Vector Biolabs</td><td>1045</td><td></td></tr><tr><td>Milieu DME à haute teneur en glucose, 500 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002201</td><td></td></tr><tr><td>Sérum FBS origine canadienne, 500 mL</td><td>VWR international</td><td>CAA15-701</td><td></td></tr><tr><td>Solution de pénicilline-streptomycine 1X, 100 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidine Texas Red-X</td><td>Invitrogen</td><td>T7471</td><td></td></tr><tr><td>Tripsine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4549</td><td></td></tr></tbody></table>

adénovirus suppression génétique des molécules de signalisation dans les cultures de fibroblastes de souris embryonnaires primaires

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

La capacité de supprimer des composants génétiquement spécifiques de diverses cascades de signalisation cellulaire a été un outil essentiel dans l&#39;analyse du signal de transduction moderne. Une méthode particulière pour réaliser cette suppression conditionnelle est via l&#39;utilisation du système Cre-loxP. Cette méthode consiste à flanquant le gène d&#39;intérêt avec des sites loxP, qui sont des séquences de reconnaissance spécifiques de la protéine recombinase Cre. L&#39;exposition de la soi-disant floxés (flanqué de sites loxP) l&#39;ADN de cette enzyme dans les résultats un événement de recombinaison Cre-médiation sur les sites loxP, et l&#39;excision subséquente du gène intervenant 3. Plusieurs méthodes différentes existent pour administrer la recombinase Cre sur le site d&#39;intérêt. Dans cette vidéo, nous démontrons l&#39;utilisation d&#39;un adénovirus contenant le gène de la recombinase Cre pour infecter les fibroblastes primaires de souris embryonnaires (MEF) obtenu à partir d&#39;embryons contenant un floxés Rac1 allèle 1. Notre raison d&#39;être de la sélection Rac1 FAE pour nos expériences est-ce clair des changements morphologiques peuvent être vus sur la suppression de Rac1, due à des altérations du cytosquelette d&#39;actine 2,5. 72 heures après la transduction virale et l&#39;expression de Cre, les cellules ont été colorées en utilisant l&#39;actine colorant phalloïdine et imagées par microscopie confocale à balayage laser. On a observé que FAE qui avaient été exposés au virus adéno-Cre apparu sous contrat et en morphologie allongée par rapport aux cellules non infectées, compatible avec les précédents rapports 2,5. La méthode de la recombinase Cre adénovirus de livraison est avantageux que le virus adéno-Cre est facilement disponible, et une délétion du gène via Cre dans près de 100% des cellules peut être réalisé avec une infection adénovirale optimisé.

Dans cette vidéo, nous utilisons un adénovirus porteur du gène de la recombinase Cre pour infecter les fibroblastes de souris embryonnaires primaires portant un allèle floxés Rac1.

Adénovirus suppression génétique des molécules de signalisation dans les cultures de fibroblastes de souris embryonnaires primaires

La capacité de supprimer génétiquement des composants spécifiques de diverses cascades de signalisation cellulaire a été un outil essentiel de la transduction du signal moderne...

L'analyse génétique moderne repose fortement sur des techniques qui facilitent la suppression ciblée de gènes spécifiques à partir de cellules, d'organes ou d'organismes entiers. Ces expériences d'invalidation génique permettent de révéler la fonction du gène dans son contexte cellulaire. Les phénotypes moléculaires, morphologiques et physiologiques observés chez les organismes invalidés fournissent tous des indices sur le rôle des produits géniques codés par la séquence supprimée.Dans les organismes modèles tels que la souris, une méthode courante pour obtenir une délétion génique conditionnelle consiste à encadrer le gène ou l'exon d'intérêt avec des sites loxP, qui servent de séquences de reconnaissance pour l'enzyme recombinase Cre. L'excision irréversible de l'allèle dit « flanqué » est ensuite catalysée par Cre, éliminant ainsi la séquence du génome. Plusieurs méthodes différentes existent pour introduire la recombinase Cre dans le système, y compris celles réalisées in vivo et celles qui concernent directement des cellules établies.Pour cette application particulière, nous utiliserons un adénovirus pour délivrer Cre à des cellules de fibroblastes qui ont été isolées et cultivées à partir d'une souris transgénique portant un allèle flock. Cette méthode permet d'obtenir une efficacité de délivrance du transgène proche de 100 %. Lorsque le virus est administré aux cellules, il est internalisé au sein d'une vésicule endocytaire et transporté jusqu'à l'enveloppe nucléaire, où son ADN, incluant le transgène d'intérêt, peut pénétrer dans le noyau en passant par le complexe nucléaire.Le mécanisme cellulaire peut alors transcrire le gène injecté et permettre à ses produits protéiques d'agir sur la cellule. Dans ce cas, l'enzyme Cre Recombinase codée par le virus excise l'allèle floxé du génome de la cellule hôte. Nous sommes du laboratoire Jones à l'Université de Guelph à Guelph, Ontario, Canada.Dans notre laboratoire, nous nous intéressons au concept de transduction du signal et à ce qui se produit lorsque l'on supprime des composants spécifiques de diverses cascades de transduction du signal. Aujourd'hui, nous allons examiner une cascade liée à l'organisation de l'actine. La transduction du signal est assurée par une série de composants biochimiques qui transmettent l'information et provoquent des changements phénotypiques, tels que la réorganisation de l'actine.Notre protéine d'intérêt est RAC1, une petite GTPase qui joue un rôle important dans la régulation de la dynamique de l'actine, notamment l'adhésion cellulaire, la migration et la morphologie. Dans cette étude, nous utiliserons le système CRE LAX P pour supprimer ce gène et confirmer son rôle dans la cellule. Précédemment, des cellules de fibroblastes provenant de souris embryonnaires porteuses d'un allèle floxé de rack1 avaient été isolées 12 jours après la fécondation.Ces cellules ont ensuite été placées dans de l'azote liquide pour une conservation à long terme, et nous allons commencer par décongeler un flacon unique de ces cellules représentant un embryon. Lors de la réalisation d'expériences de culture cellulaire, il est important de maintenir un environnement stérile. Cela implique de nettoyer les surfaces exposées d'une hotte à flux laminaire homologuée, ainsi que de pulvériser avec de l'éthanol à 70 % tous les flacons de réactifs et tous les équipements de laboratoire entrant dans la hotte.Une fois la hotte à flux laminaire préparée, décongeler les cellules en plongeant le flacon dans un bécher d’eau à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que le contenu soit liquide. Ensuite, stériliser le flacon avec de l’éthanol à 70 %, puis ajouter la suspension cellulaire goutte à goutte sur une plaque de 10 centimètres contenant neuf millilitres de milieu DMEM, riche en glucose, supplémenté avec 10 % de sérum bovin fœtal et 1 % de pénicilline.Streptomycine, agiter doucement la plaque pour disperser les cellules et la placer dans l’incubateur à 37 degrés avec 5 % de CO2, en n’oubliant pas d’étiqueter la plaque avec les informations appropriées. Les cellules atteignent généralement une confluence de 100 % en 24 heures. À ce stade, nous pouvons repiquer les cellules dans une nouvelle plaque.Pour ce faire, commencez par aspirer l'ancien milieu. Ajoutez cinq millilitres de PBS stérile pour rincer les cellules, puis retirez également cette solution. Ajoutez ensuite un millilitre de trypsine contenant 10 millimolaire de EDTA.Placer la plaque dans l’incubateur à 37 degrés pendant environ cinq minutes afin de permettre aux cellules de se détacher du substrat. Revenir sous la hotte à flux laminaire et ajouter à nouveau neuf millilitres de milieu dans la plaque trypsée, diluant ainsi les cellules au 1/10. Prélever le liquide plusieurs fois à l’aide d’une pipette pour briser les agrégats cellulaires, puis prélever un millilitre de la suspension et l’ajouter goutte à goutte à neuf millilitres de milieu frais dans une nouvelle plaque de 10 centimètres. Agiter doucement la plaque afin de répartir les cellules, puis la placer dans l’incubateur à 37 degrés.Lorsque les cellules ont atteint la confluence, l'étape suivante consiste à les ensemencer sur des lamelles en verre afin de pouvoir les observer par microscopie. Préparez les cellules en utilisant la même technique que celle utilisée pour l'emballage, jusqu'à l'ajout des plasmides dans les cellules et leur placement dans l'incubateur à 37 degrés Celsius. Pendant que les cellules se détachent de la plaque, préparez une plaque de six puits contenant des lamelles en verre, en utilisant une lamelle stérilisée par autoclave par puits.Une fois que les cellules se sont détachées de la plaque, ajoutez cinq à six millilitres de milieu aux cellules traitées à la trypsine. Pour l'étape suivante de l'expérience, un décompte cellulaire sera effectué afin de permettre l'ensemencement d'un nombre approprié de cellules pour une infection virale efficace. Pour compter les cellules, mélangez 15 microlitres d'échantillon avec une quantité égale de bleu de trypan en pipettant plusieurs fois vers le haut et vers le bas, puis ajoutez 15 microlitres de cette solution dans la cellule de numération hématométrique.Les cellules mortes apparaîtront en bleu. Dans ce cadre, comptez uniquement les cellules vivantes ou incolores sur la grille quatre par quatre afin de calculer le nombre de cellules par microlitre. Commencez par compter les cellules présentes dans quatre grilles distinctes, A à D, puis faites la moyenne. Multipliez ensuite cette valeur par deux pour tenir compte de la dilution dans le bleu de trypan.Étant donné que la grille contient un dixième de microlitre, multiplier par 10 pour exprimer la valeur en cellules par microlitre. Ensuite, déterminer le volume requis en divisant le nombre souhaité de cellules par la concentration cellulaire calculée précédemment. Ajouter le volume calculé de la suspension cellulaire goutte à goutte dans chaque puits de la plaque à six puits.Laisser ces cellules dans l’incubateur à 37 degrés pendant la nuit. Le jour suivant, le virus sera ajouté aux cellules. Le virus de la Den Creek, obtenu auprès de Vector B Labs, a été aliquoté et stocké à −80 degrés Celsius.Récupérez ce virus et revenez à la hotte à flux laminaire. Retirez la plaque à six puits de l’incubateur et apportez-la dans la hotte. Aspirez le milieu et lavez les cellules avec un millilitre de DMEM sans sérum.Ajoutez maintenant un millilitre de milieu sans sérum dans chaque puits pour l'ajout du virus. Pour l'application virale, nous utilisons une multiplicité d'infection (MOI) de 500. Une optimisation du protocole a été précédemment réalisée à l'aide de différentes MOI, et nous avons constaté qu'une MOI de 500 permettait des taux d'infection très élevés, avec peu ou pas d'effet sur la viabilité cellulaire.Pour calculer le MOI, utilisez l'équation suivante. Commencez par déterminer le nombre de virus requis, ce qui peut être obtenu en multipliant le MOI cible, dans ce cas 500, par le nombre de cellules par puits, soit 30 000. Pour déterminer le volume de stock de virus à utiliser, multipliez le nombre de virus par 1000 et divisez ce résultat par la concentration initiale du virus. Dans ce cas, nous ajouterons 1,5 microlitre de stock de virus dans chaque puits devant être infecté.Agitez doucement la plaque pour disperser le virus et placez-la dans l’incubateur à 37 degrés pendant la nuit. Le lendemain matin, retirez le milieu viral des cellules, rincez avec du PBS et ajoutez deux millilitres de milieu ordinaire aux cellules. Dans cette expérience, nous avons observé que des modifications phénotypiques survenaient dans les cellules après environ 72 heures.Les cellules marquées à l’aide du colorant Acton din ont été observées à l’aide du microscope confocal à balayage laser multiphoton Leica T-C-S-S-P cinq, situé au Centre d’analyse avancée de l’Université de Guelph. Cette observation a révélé des modifications de la morphologie entre les cellules infectées et non infectées. Celles dépourvues de RAC un apparaissent allongées et minces par rapport aux cellules larges et aplaties qui n’étaient pas infectées.Ici, nous avons montré que le système de creusement ADOC est une méthode robuste pour une livraison efficace de gènes aux cellules, au-delà de l'étude de la transduction du signal. Toutefois, vous pouvez également utiliser cette méthode pour éliminer des gènes chez des animaux expérimentaux ou peut-être pour marquer des populations cellulaires spécifiques dans un organisme. Le système d'adénovirus peut aussi servir à introduire dans un principe d'autres gènes que Cree.Les avantages de l'utilisation de cette méthode de délivrance incluent sa forte affinité, son efficacité et l'absence d'intégration dans l'ADN des cellules hôtes. Toutefois, la production d'adénovirus courants peut être laborieuse. Le protocole décrit ici exploite donc la puissance du système adénoviral en utilisant le virus ocre précédemment développé avec notre système RAC floqué un par l'intermédiaire de ce gène conditionnellement inactivé, nous avons démontré que.Ainsi, la morphologie dépend en effet en partie de la petite GTPase RAC1. En conclusion, nous, du laboratoire Jones, tenons simplement à vous remercier d'avoir regardé notre vidéo et nous vous souhaitons bonne chance dans toutes vos recherches futures.

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Ce protocole décrit le processus de génération et de caractérisation des organoïdes urothéliaux de souris hébergeant des délétions dans les gènes d’intérêt. Les méthodes comprennent la récolte de cellules urothéliales de souris, la transduction ex vivo avec adénovirus conduisant l’expression de Cre avec un promoteur CMV, et la caractérisation in vitro et in vivo .

Ex Vivo Modèle organoïde de délétions de gènes médiés par l’adénovirus-Cre dans des cellules urothéliales de souris

Ce protocole décrit comment l’injection intrasplénique de petits ARN en épingle à cheveux délivrés par AAV8 atteint la même efficacité d’inactivation génique dans le foie que l’injection dans la veine porte, représentant une procédure plus simple avec une mortalité et des complications périopératoires et postopératoires beaucoup plus faibles.

Inactivation efficace d’un gène dans le foie par injection intrasplénique d’un petit ARN en épingle à cheveux délivré par le virus adéno-associé de sérotype 8 (AAV8)

Découvrez une méthode d'excision génique efficace par adénovirus dans des fibroblastes embryonnaires de souris. Cette technique permet d'étudier le rôle de Rac1 dans la dynamique de l'actine.

Adénovirus suppression génétique des molécules de signalisation dans les cultures de fibroblastes de souris embryonnaires primaires (Vidéo) | JoVE Journal

Adénovirus suppression génétique des molécules de signalisation dans les cultures de fibroblastes de souris embryonnaires primaires

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