La méthode de culture des embryons rongeurs entier en utilisant le système des rotateurs de type flacon de culture
28 août 2010
Whole technique de culture d'embryons de souris nous permet de culture et d'embryons de rat Ex vivo durant des périodes limitées correspondant aux stades midgestation. Dans ce protocole vidéo, nous démontrons nos procédures standard de la culture d'embryon de rat entière après E12.5 en utilisant le système des rotateurs de type flacon de culture.
En biologie du développement, divers animaux sont utilisés pour les expériences. La technique agricole hawaïenne de rotation des embryons a été mise au point dans les années 1950 et développée avant l'établissement de la manipulation génétique moderne en agriculture hawaïenne. Le directeur affaibli cible directement les zones vivantes par mort cellulaire ou transfection de gènes, puisque les embryons peuvent être manipulés et observés au microscope ; par conséquent, la culture complète d'embryons constitue un outil très utile.
Lorsque nous souhaitons étudier le processus dynamique de développement des embryons de maorian après le développement post-implantatoire, la croissance de ces embryons dépend fortement du présentateur fonctionnel, ce qui limite la durée de culture. En général, nous pouvons cultiver les embryons pendant la période allant du jour embryonnaire 8,5 à 14,5 chez le rat, et de E 6,5 à 12,5 chez la souris.
Dans le laboratoire, nous cultivons des embryons de rat et de souris en utilisant un système de culture rotatif. Ce système de culture est le plus répandu et le plus adapté à la culture d'embryons de rat et de souris pendant la période critique de la gestation, c'est-à-dire après le stade E 11,5 chez le rat et E 9,5 chez la souris.
Dans cette vidéo, nous aimerions présenter notre protocole standard de culture en milieu déficient en nutriments utilisant des embryons RU à E 12,5. Dans ces conditions, l'embryon peut être cultivé pendant deux jours, ce qui est largement suffisant pour examiner diverses manipulations efficaces en agriculture horizontale. Il existe deux étapes critiques pour la réussite.
Tout d'abord, la procédure de dissection doit être précise afin de ne pas endommager l'embryon, en particulier les vaisseaux sanguins. Deuxièmement, la procédure doit être aussi rapide que possible. Cela est particulièrement vrai pour les embryons plus âgés.
Par exemple, dans le cas des embryons de souris E 10,5, ceux-ci doivent être transférés dans les 30 minutes. Nous avons appliqué la technique de culture d'embryons entiers pour regrouper six embryons mutants de type droit. Par exemple, nous analysons le schéma de migration des cellules neurore dans le mutant en marquant un petit nombre de cellules avec un colorant ou en transplantant des cellules de niveau dans des embryons de type sauvage et de fond muté.
De plus, nous avons mis au point une méthode de transfert de gènes dans des embryons de souris et de grenouille en culture par électroporation, qui utilise un choc électrique. Nous pouvons introduire simplement des constructions de gènes exogènes, des formes dominantes négatives et des ARNsi dans la région des cerveaux en développement. Par conséquent, nous pouvons facilement analyser les fonctions des gènes par des expériences de perte de fonction et de gain de fonction.
Nous étudions également le comportement de cellules marquées avec GFP ou RFP en utilisant une culture d'organes ou une culture de tranches, suivie, ou une agriculture. Vous pouvez ainsi réaliser une variété d'expériences en combinant la culture Lio avec d'autres techniques.
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Aperçu
Ce protocole vidéo illustre la technique de culture de l'embryon entier pour des embryons de rat après le stade E12,5, en utilisant un système de culture en flacon de type rotatif. Cette méthode permet une culture ex vivo durant les stades critiques du milieu de la gestation.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie du développement
- Embryologie
- Techniques de culture ex vivo
Contexte
- La technique de culture de l'embryon entier est établie depuis les années 1950.
- Elle permet la manipulation des embryons pour des études génétiques.
- Les embryons peuvent être cultivés pendant des périodes de développement spécifiques.
- La croissance dépend de la présence fonctionnelle de l'embryon.
Objectif de l'étude
- Étudier les processus dynamiques de développement des embryons après l'implantation.
- Proposer une procédure normalisée pour la culture d'embryons entiers.
- Faciliter la recherche en biologie du développement.
Méthodes utilisées
- Technique de culture d'embryons entiers
- Système de culture en flacon de type rotatif
- Conditions ex vivo pour les embryons de rat
- Périodes de culture du jour embryonnaire 8,5 au jour 14,5
Résultats principaux
- Culture réussi d'embryons de rat après le 12,5 jpc.
- Démonstration des procédures standard de manipulation des embryons.
- Apercus sur les périodes critiques de croissance des embryons.
- Mise en place d'une méthode fiable pour les études futures.
Conclusions
- La technique de culture d'embryon entier est un outil précieux en biologie du développement.
- Elle permet l'étude du développement embryonnaire dans des conditions contrôlées.
- Des méthodes normalisées améliorent la reproductibilité des recherches.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
Le système de culture d'embryons entiers (WEC) de type rotatif permet une manipulation directe et une observation des embryons de rongeur durant les stades critiques du milieu de la gestation, soutenant ainsi la réduction des risques mécanistiques en phase précoce de découverte. Cette plateforme ex vivo autorise des interventions génétiques et cellulaires précises, facilitant la validation fonctionnelle des cibles et l'analyse des voies biologiques avant les études in vivo. Sa reproductibilité et son adaptabilité en font un atout précieux pour la recherche translationnelle et le tri des projets dans la modélisation du développement et des maladies.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet une manipulation génétique ou cellulaire directe pour la validation fonctionnelle de cibles dans les embryons de mammifères.
- Permet de réduire les risques mécanistiques en autorisant des études de perte et de gain de fonction dans un système ex vivo contrôlé.
- Facilite l'élucidation des voies biologiques et la vérification d'hypothèses aux points critiques d'inflection du développement.
- Offre une plateforme pour évaluer l'impact d'interventions candidates sur le développement embryonnaire.
Élaboration de tests et criblage
- Prépare des systèmes embryonnaires validés et manipulables pour des criblages phénotypiques ou des tests mécanistiques en aval.
- Permet une évaluation reproductible et quantitative des résultats du développement après une perturbation génétique ou chimique.
- Facilite la standardisation et l'évolutivité des tests pour des études comparatives entre génotypes ou interventions.
- Permet une évaluation fiable de la fonction d'un composé ou d'un gène dans un contexte physiologiquement pertinent.
Recherche translationnelle et préclinique
- S'aligne sur les stades développementaux pertinents pour la modélisation de troubles congénitaux ou de la fonction génique.
- Assure une continuité allant de la découverte à la validation préclinique en permettant des études mécanistiques sur des embryons intacts.
- Permet des décisions d'avancement ajustées au risque en clarifiant précocement les atteintes développementales dans le processus.
- Facilite la découverte et la validation de biomarqueurs dans un système contrôlé et manipulable.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Le système WEC de type rotatif fait le lien entre la découverte précoce et la recherche préclinique en permettant la manipulation fondée sur des hypothèses et l'analyse quantitative du développement embryonnaire. Situé entre les tests in vitro et les modèles in vivo, il offre une plateforme unique pour les études mécanistiques et la réduction des risques associés aux cibles.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses et la clarification des voies biologiques par intervention génétique ou cellulaire directe.
- Écrans de sélection : Fournit des systèmes embryonnaires prêts à l'emploi et reproductibles pour des lectures phénotypiques quantitatives.
- Analytique : Permet la mesure de résultats développementaux, migratoires ou moléculaires en vue d'analyses comparatives.
- Recherche translationnelle : Relie les découvertes mécanistiques précoces à la modélisation préclinique des maladies et à la validation de biomarqueurs.
- Réutilisation en entreprise : Offre une plateforme standardisée et adaptable pour une utilisation répétée dans plusieurs programmes de découverte.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la validation des cibles.
- Valeur opérationnelle : Fournit des protocoles ex vivo standardisés, reproductibles et évolutifs pour les études de développement.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'avancement ou d'abandon et l'efficacité du capital en clarifiant précocement les risques biologiques.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation et une progression ajustées au risque des actifs en phase de découverte.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en embryologie, en microdissection et en techniques de manipulation ex vivo.
- Exige un équipement spécialisé de culture en bouteille de type rotatif et une infrastructure microscopique adaptée.
- Implique une standardisation rigoureuse entre équipes pour assurer la reproductibilité et la comparabilité des données.
- Une adaptation peut être nécessaire selon les souches de rongeurs ou les stades de développement.
- La durée de la culture est limitée par la dépendance embryonnaire à la fonction placentaire, ce qui restreint la fenêtre d'analyse.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
Chapters in this video
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The Method of Rodent Whole Embryo Culture Using the Rotator-type Culture System
2:06
Setting up Whole Embryo Culture System
3:53
Removal of Embryos from the Uterus
2:52
Preparation of Culture Medium
4:52
Dissection of Rat Embryos
7:27
Results and Discussion
0:07
Introduction
