Name: Préparation des tendons de queue de rat pour les études biomécaniques et mécanobiologique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-30T17:30:00.000+00:00
Duration: 15 min 12 s
Description: Apprenez à préparer les tendons de queue de rat pour des études biomécaniques et mécanobiologiques. Cette méthode comprend l'extraction, la mesure de la section transversale, le rinçage et le chargement dans la chambre du bioréacteur.

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Cet article a été appuyé par le CRSNG # 299280 Grant, IRSST comme une bourse d&#39;études pour les parents et le FRSQ G. comme une bourse de recherche étudiant de premier cycle à M. Cyr. Nous remercions Yoan Lemieux-Laneville pour effectuer les manipulations enregistrées sur vidéo.

Avant toute manipulation, vous devez identifier le groupe de tendons à être utilisés en fonction de l'expérience que vous menez et l'appareil à votre disposition. Pour nos besoins, les tendons ventrale ont été choisis parce qu'ils sont plus petits et donc plus faciles à manipuler lors de la mesure de la section transversale et leur montage dans la chambre de bioréacteur. S'il vous plaît noter que tous les instruments sont stérilisés à l'autoclave ou 70% d'éthanol. Par ailleurs, un vaporisateur contenant de l'éthanol à 70% est placé à côté de chaque station de travail pour stériliser les gants expérimentateurs avant chaque opération. Partie 1: Extraction Après résection, la queue est soigneusement manipulé par ses extrémités pour éviter d'endommager les tissus. Aussi, pour conserver la viabilité des cellules, toutes les manipulations sont effectuées dans une solution saline froide. 1A) Matériaux: <ul><li> Froid solution saline (D-PBS) </li><li> Glace concassée </li><li> Surface protecteur </li><li> Planche à découper </li><li> Plaques manipulation individuelle </li><li> 2 500 plats ml </li><li> 2 plats en verre 2L </li><li> Ruban adhésif </li><li> 1 Pince à épiler </li><li> 1 pince </li><li> 1 Pince debout </li><li> Une paire de ciseaux chirurgicaux </li><li> 1 Scalpel </li><li> 1 paire de ciseaux chirurgicaux <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Manipulation individuelle avec l'identification d'orientation ("P" pour "proximale") </li></ul> 1B) station de travail: <ol><li> Etalez le protecteur de surface et le lieu de la planche à découper sur le dessus. </li><li> Remplir chaque verre de plus de deux plats à moitié avec de la glace pilée et les placer sur le papier. </li><li> Collez un morceau de ruban sur un coin de la plaque de manipulation et d'identifier avec une lettre pour indiquer l'extrémité proximale. </li><li> Remplissez les deux plats de petit verre à mi-course et tous les rainures des plaques de manipulation avec une solution saline froide. Placez-les dans des plats en verre de grande taille contenant de la glace. </li><li> Organiser tous les instruments stériles sur le protecteur de surface. </li><li> Transférer la queue dans l'un des plat en verre contenant une solution saline. </li></ol> 1C) Manipulations: <ol><li> Observez l'anatomie à l'extrémité proximale de la queue de distinguer la partie ventrale de la face dorsale. La face ventrale a un plus grand nombre de tendons et un vaisseau sanguin qui peut être vérifié en pressant doucement la queue pour produire de minuscules gouttes de sang. </li><li> En utilisant les ciseaux chirurgicaux, couper la peau le long de la face dorsale de la queue, si vous voulez extraire les tendons ventrale (ou le long de la face ventrale si vous avez besoin des tendons dorsaux). </li><li> Ouvrez l'incision à l'extrémité proximale et enlever la peau à l'aide de forceps ou vos doigts et en prenant soin de manipuler les extrémités de la queue. </li><li> Rincez le sang et les cheveux dans la solution saline et le transfert de l'échantillon dans le plat en verre contenant une solution restante frais. Changer de gants. Une section transversale considérée sous microscopie optique montre les groupes tendon six. Un tendon de chaque groupe est attaché à l'extrémité caudale de chaque vertèbre, donc on coupe au disque intervertébral pour exposer les tendons le long de la nouvelle coupe. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Coupe transversale de la queue du rat vu en microscopie optique. </li><li> Coupez l'extrémité distale du cartilage de 2-3 vertèbres courtes avec des ciseaux chirurgicaux. Placez la queue sur le plateau de coupe pour couper les tissus mous à l'aide d'un scalpel, puis immédiatement à le remplacer dans la solution. </li><li> En utilisant une pince à épiler, retirez un tendon de la queue distale. </li><li> Avec une prise douce aux deux extrémités, placez le tendon dans la plaque de manipulation individuelle. Répétez les deux dernières étapes jusqu'à ce que ne tendons plus peut être taquiné et couper court à chaque fois une vertèbre de nouveaux tissus ont besoin d'être exposée. </li></ol> Partie 2: mesure de la superficie transversale 7 Quand le tissu est soumis à la caractérisation mécanique ou de stimulation, ses propriétés mécaniques sont décrits en normalisant la force à l'intérieur du tendon au stress. C'est pourquoi nous évaluons section transversale. 2A) Matériaux: <ul><li> Micromètre optique </li><li> Stéréomicroscope </li><li> Appareil photo numérique </li><li> Edge et la reconnaissance des algorithmes de reconstruction Profil 5,6 </li><li> Froid solution saline (D-PBS) </li><li> 1 pipette de 20 200 pl de volume micro </li><li> Une clé hexagonale pour les réglages du micromètre optique </li><li> 2 pinces / Files/ftp_upload/2176/2176fig3.jpg "alt =" Figure 3 "/&gt; Figure 3. Micromètre optique </li></ul> 2B) station de travail: <ol><li> Ouvrez le logiciel (appareil photo numérique et algorithmes). </li><li> Placer le micromètre optique afin qu'il y ait assez de place pour charger le tendon dans l'appareil. </li><li> Organiser les instruments et un plat en verre contenant les tendons extrait à portée de main. </li></ol> 2C) Manipulations: <ol><li> Remplir le compartiment de mesure avec une solution saline froide jusqu'à ce que les deux systèmes d'ancrage sont submergés. </li><li> Transfert du tendon dans le compartiment en tenant les extrémités avec des pincettes. </li><li> L'utilisation de la pipette d'aspiration par l'intermédiaire de micro-volume, tirez une extrémité à un moment dans le tube de silicone. Aspirer jusqu'à la fin s'étend au-delà les cols de l'arbre. </li><li> Serrer les colliers d'arbre pour compresser les tubes et d'installer l'appareil sous la loupe binoculaire. </li><li> A un grossissement de 105X, étirer les tendons tout en observant le tissu jusqu'à ce que le plis ne sont plus perceptibles. Étirez par additionnels de 0,40%. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. Projection à un grossissement de 105x tendon avant et après étirement. </li><li> Ajustez la position et de se concentrer pour maintenir une image claire du tendon au cours d'une rotation de 180 °. </li><li> Prenez une photo à chaque rotation de 10 °, sans modifier la tension, l'accent ou la position. Utilisez uniquement l'arbre rotatif pour effectuer la rotation. Grâce à sa forme conique, ces étapes peuvent être répétées à différents points le long du tendon. </li><li> Activer la reconnaissance de pointe et les algorithmes de reconstruction de profil dans le but d'analyser la base de données que vous avez enregistrés. </li><li> Libre le tendon en desserrant les colliers d'arbre et soufflant de l'air dans les tubes de silicone à l'aide de la pipette du volume micro. </li><li> Réinsérer le tendon sur la plaque de la manipulation, à nouveau sa manipulation par les extrémités. </li><li> Vérifiez la forme de la reconstruction de profil obtenu et la valeur de la zone de coupe. </li></ol> Partie 3: Rinçage Pour éliminer la contamination qui pourrait avoir eu lieu pendant les manipulations précédentes, les tissus sont rincés sous l'enceinte de sécurité biologique. 3A) Matériaux: <ul><li> Froid solution saline (D-PBS) </li><li> Plaque de manipulations multiples rainures </li><li> Plaques manipulation individuelle </li><li> Ruban adhésif </li><li> 2 pinces </li><li> 1 Pince debout </li></ul> 3B) station de travail: <ol><li> Allumez le ventilateur dans l'enceinte de sécurité biologique 15 minutes à l'avance et nettoyer les surfaces à l'intérieur avec 70% d'éthanol. </li><li> Apportez tous les instruments à l'intérieur du poste de sécurité microbiologique. </li><li> Coller des morceaux de ruban adhésif sur un coin de chaque plaque d'identifier l'extrémité proximale. </li><li> Remplissez tous les rainures avec une solution saline stérile. </li></ol> 3C) Manipulations: <ol><li> Introduire la plaque contenant la manipulation du tendon d'extraits de l'armoire. </li><li> En utilisant une pince à épiler, retirez le tendon de son assiette avec une prise douce à chaque extrémité. </li><li> Plongez et remuer doucement le tendon dans la solution saline de chaque compartiment de la plaque de la manipulation de multiples rainures, à partir de la plus proche et de procéder à la rainure plus loin. </li><li> Enfin, immerger le tendon dans une plaque de manipulation individuelle. </li></ol> Partie 4: Chargement en bioréacteur Pour éviter une nouvelle contamination, les manipulations suivantes sont également menées dans le cabinet de biosécurité. 4A) Matériaux: <ul><li> Bioréacteur chambre 4 </li><li> Ancres stérile </li><li> Une boîte de Petri stérile </li><li> Moyen de cellules en culture froide (DMEM) </li><li> Cyanoacrylates </li><li> 2 pinces </li><li> Brucelles debout </li><li> 0.5-10 ul micro-pipettes de volume </li><li> Une règle <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig5.jpg" alt="Figure 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 5"> Figure 5. Bioréacteur </li></ul> 4B) station de travail: <ol><li> Depuis l'étape précédente a également été réalisé en enceinte de sécurité biologique, l'enlèvement d'outils inutiles vous donnera plus d'espace de travail. </li><li> Apportez tous les autres instruments à l'intérieur du coffret. </li></ol> 4C) Manipulations: <ol><li> Placez un point d'ancrage sur la plaque de la manipulation avec son tiroir centré sur l'extrémité du tendon et le tissu enroulé et autour de la bobine. </li><li> Rouler l'ancre sur et maintenez l'extrémité libre tout en s'assurant que le tissu reste attaché à l'ancre. Arrêt après ¾ de tour. </li><li> Effectuer les mêmesétapes avec l'autre extrémité. </li><li> Rouler les deux ancres plus égale jusqu'à ce qu'il y est de 6 cm entre leurs centres 1. </li><li> Desserrez le tendon de l'immerger dans la solution et permettre les sections ancré à sécher brièvement pour améliorer ses propriétés mécaniques 2-3. </li><li> Verser dans le plat cyanoacrylate Pétri et dessinez 2.5μL dans la pipette du volume micro. </li><li> Appliquez une goutte de cyanoacrylate au tissu liquidé sans laisser tomber la colle dans la solution saline. Répétez l'opération jusqu'à 2 gouttes ont été appliquées à chaque point d'ancrage. </li><li> Avec le tendon reste complètement immergé, attendre 5 minutes pour que la colle sèche complètement. </li><li> Pendant ce temps, remplir le compartiment de chambre avec une solution saline. </li><li> Réhydrater les tissus avec une solution saline pour éviter tout dommage. </li><li> En manipulant que les ancres, le transfert du tendon dans la chambre de bioréacteur et le fermer pour empêcher les fuites et la contamination pendant le transfert. </li></ol> Partie 5: Résultats du représentant: Le résultat du protocole montre que lorsqu'elle est effectuée correctement, notre isolement rigoureux et tissus procédure de préparation permettent de maintenir la stérilité des tissus, la viabilité et l'intégrité. Tout d'abord, en utilisant la méthode d'extraction simple et répétitive, nous sommes en mesure d'extraire tendons de queue sans endommager le réseau de collagène comme il peut être observé par une analyse microscopique des sections H &amp; E contaminé réalisé après l'extraction. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig6.jpg" alt="Figure 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 6"> Figure 6. Réseau de collagène des tendons après extraction (5 um section longitudinale colorés avec H &amp; E). Nous avons ensuite tendons cultivées pendant jusqu'à dix jours et mené des tests de stérilité. Chaque jour, nous plaqués solution de culture utilisé sur de l'agar et incubée pendant 24 heures. Comme aucune croissance bactérienne a été observée, nous avons conclu que nos manipulations ne pas entraîner de contamination. Avec l'algorithme de reconstruction le profil et le micromètre optique, nous sommes en mesure d'estimer la surface transversale au sein d'une marge de 2% d'erreur 7. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig7.jpg" alt="Figure 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 7"> Figure 7. La reconstruction d'un profil de RTT. Enfin, nous avons évalué la viabilité utilisant le Live / Dead viabilité / cytotoxicité Kit pour les cellules de mammifères après l'étape de rinçage et après une période de douze jours de culture. Depuis la grande majorité des vert fluorescent des cellules vivantes étaient évidents, nous pouvons confirmer que nos procédures d'isolement sont réussi à préserver les tissus vivants. Le même test a été effectué deux heures après la fixation du tendon dans la chambre de bioréacteur. Nous avons vérifié que la déshydratation et de la colle à l'ancre ne s'était pas propagé dans le tissu entre les deux ancres. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig8.jpg" alt="Figure 8" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 8"> Figure 8. Viabilité des tissus à l'ancre (vert = cellules vivantes, rouge = cellules mortes)

<ol><li>Bennett, M. B., Ker, R., Dimery, N., Alexander, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+various+mammalian+tendons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Zool.+Lond%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of various mammalian tendons.</a> J. Zool. Lond. A209, 537-548 (1986).</li>
<li>Dupuis, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22D%C3%A9shydratation+de+matrices+collag%C3%A9niques+reconstruites+in+vitro%3A+effets+sur+les+propri%C3%A9t%C3%A9s+m%C3%A9caniques+et+histologiques+%5B%5D%22">Déshydratation de matrices collagéniques reconstruites in vitro: effets sur les propriétés mécaniques et histologiques [dissertation]</a>. , Québec, Université Laval. Québec. 114-114 (1981).</li>
<li>Haut, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+influence+of+strain+rate+on+the+tensile+failure+of+rat+tail+tendon%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Age-dependent influence of strain rate on the tensile failure of rat tail tendon.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 105, 296-299 (1983).</li>
<li>Huppé, N., Lessard, J. -L., Langelier, E. A Bioreactor Design for the Mechanobiological Study of Soft Tissue Damage and Repair in Conditions that Provide the Best Approximation of Actual Use. 31st Canadian Medical and Biological Engineering Conference, 2008 Jun 11-12, Montreal, Canada, , Canadian Medical and Biological Engineering Society. (1985).</li>
<li>Langelier, E., Dupuis, D., Guillot, M., Goulet, F. &amp, Rancourt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-sectional+profiles+and+volume+reconstructions+of+soft+tissues+using+laser+beam+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech+Eng%22%5BJournal%5D)">Cross-sectional profiles and volume reconstructions of soft tissues using laser beam measurements.</a> J Biomech Eng. 126, 796-802 (2004).</li>
<li>Lee, T. Q., Woo, S. L. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+determining+cross-sectional+shape+and+area+of+soft+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech+Eng%22%5BJournal%5D)">A new method for determining cross-sectional shape and area of soft tissues.</a> J Biomech Eng. 110, 110-114 (1988).</li>
<li>Parent, G., Cyr, M., Cousineau-Pelletier, P., Desbiens-Blais, F. &amp, Langelier, E. Current Techniques for the Evaluation of Cross-Sectional Area in Rat Tail Tendons Generate Significant Errors. 31st Canadian Medical and Biological Engineering Conference, 2008 Jun 11-12, Montreal, Canada, , Canadian Medical and Biological Engineering Society. (1985).</li>
</ol>

En appliquant ces procédures expérimentales, nous pouvons mener une grande variété d'études in vitro sur ce type de tissus. Comme par exemple, une étude sur la dégénérescence des tissus a été réalisée par l'application de la sous-stimulation à la RTT, pour une période de dix jours. Chaque jour, nous avons évalué les propriétés mécaniques dans les tissus des essais non destructifs de relaxation des contraintes. A la fin, nous avons pu observer des variations de stress RTT et donc analyser la progression...

<table><tbody><tr><td>D-PBS </td><td>Réactif</td><td>Wisent Inc.</td><td>311-410-CL</td><td>Solution saline</td></tr><tr><td>Glucose </td><td>Réactif</td><td>Wisent Inc.</td><td>609-037-EL</td><td>Solution saline&lt;br/&gt;1g/L</td></tr><tr><td>Antibiotiques-antimycosiques </td><td>Réactif</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>Solution saline&lt;br/&gt;1%</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Réactif</td><td>Invitrogen</td><td>12800-017</td><td>Solution de culture</td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium</td><td>Réactif</td><td>Wisent Inc.</td><td>600-105-CG</td><td>Solution de culture&lt;br/&gt;3,7g/L</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Réactif</td><td>Wisent Inc.</td><td>090150</td><td>Solution de culture&lt;br/&gt;10%</td></tr><tr><td>Antibiotiques-antimycosiques</td><td>Réactif</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>Solution de culture&lt;br/&gt;1%</td></tr><tr><td>Micromètre optique</td><td>Outil</td><td>Personnalisé</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plaque de manipulation</td><td>Outil</td><td>Personnalisé</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chambre de bioréacteur</td><td>Outil</td><td>Personnalisé</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

préparation des tendons de queue de rat pour les études biomécaniques et mécanobiologique

Preparation of Rat Tail Tendons for Biomechanical and Mechanobiological Studies

Tendons de queue de rat (RTT) sont un modèle commun biologiques utilisés dans études expérimentales in vitro dans les domaines de la physiologie des tendons et des tendinopathies. Travailler avec ces tissus est difficile car ils sont très fragiles, et jusqu&#39;à présent il n&#39;y avait pas de protocole rigoureusement détaillées de leur isolement. Face à ces défis, nous avons développé des méthodes et des instruments pour faciliter la manipulation des RTT et des tissus de contrôle de viabilité, la stérilité et l&#39;intégrité. Cet article décrit les procédures expérimentales utilisées pour préparer RTT pour les études biomécaniques et mécanobiologique. Notre travail est divisé en quatre grandes étapes: l&#39;extraction, la mesure de la superficie transversale, le rinçage et le chargement dans la chambre de bioréacteur. A chaque étape, toutes les procédures, les matériaux et les manipulations sont présentés en détail afin qu&#39;ils puissent être facilement reproduits. Par ailleurs, les instruments spécifiques développés sont présentés: une plaque de manipulation utilisée pour séparer RTT, un micromètre optique à la position du tissu pendant la mesure de la superficie transversale et un système d&#39;ancrage pour attacher les RTT sur un bioréacteur. Enfin, nous décrivons les résultats obtenus après plusieurs tests afin de valider nos méthodes. Évaluations de la viabilité, la stérilité et l&#39;intégrité de démontrer que nos procédures sont suffisamment rigoureux pour les manipulations des tissus fragiles tels que les tendons de queue de rat.

Cet article décrit les procédures expérimentales utilisées pour préparer les tendons de queue de rat pour les études biomécaniques et mécanobiologique. Plusieurs caractéristiques des principales étapes de préparation sont démontrées, à commencer par l&#39;extraction, la mesure de la superficie transversale, le rinçage et le chargement dans la chambre de bioréacteur.

Préparation des tendons de queue de rat pour les études biomécaniques et mécanobiologique

Les tendons de queue de rat (RTT) sont un modèle biologique courant utilisé dans les études expérimentales in vitro dans les domaines de la physiologie tendineuse et de la tendinopathie. Travailler...

La vidéo que vous êtes sur le point de voir présente les procédures expérimentales utilisées pour isoler et préparer le tendon de la queue de rat en vue d'études biomécaniques et biologiques mécaniques. L'objectif de cet article est de démontrer les méthodes et instruments qui ont été mis au point et optimisés afin de préserver la viabilité, la stérilité et l'intégrité du tissu durant la procédure de préparation. Nous aborderons plusieurs aspects relatifs aux étapes principales de la préparation, en commençant par l'extraction, suivie de la mesure de la surface transversale, du rinçage, et enfin du chargement dans la chambre du bioréacteur.Commençons. L'extraction est la première étape de la préparation afin de préserver la viabilité cellulaire. Toutes ces manipulations sont effectuées dans une solution saline froide.Après l'assujettissement des rats, la queue est résectionnée, rincée avec de l'éthanol à 70 % et transférée dans une boîte contenant des cellules et une solution, puis maintenue sur glace. Pour faciliter l'extraction du tendon, il est nécessaire d'enlever la peau. Prendre en compte que nous travaillons avec des tendons ventraux.Étant donné leur petite taille et la facilité avec laquelle notre équipement permet de les manipuler, une incision est pratiquée sur toute la longueur du côté dorsal de la queue. L'orientation correcte de la queue est ensuite vérifiée en observant l'anatomie à l'extrémité proximale. Comme on peut le voir, le côté ventral présente un plus grand nombre de tendons, et la présence d'un vaisseau sanguin peut être confirmée par les gouttes de sang obtenues.En exerçant une légère pression sur la queue, l'incision est réalisée. Partir de l'extrémité proximale et utiliser une paire de ciseaux chirurgicaux. Il faut manipuler la queue par ses extrémités avec précaution.Une fois l'incision terminée, la peau est retirée en commençant également par l'extrémité proximale à l'aide des doigts ou d'une pince. Là encore, il convient de manipuler la queue par ses extrémités. Ensuite, la queue est rincée dans la solution afin d'éliminer les poils et le sang.L'échantillon est ensuite transféré dans une boîte contenant une solution fraîche et conservé sur de la glace. À ce stade, l'expérimentateur change de gants pour exposer le tendon. L'extrémité distale de la queue est résectionnée de deux à trois vertèbres plus courte.Les vertèbres sont les faisceaux visibles situés entre les faisceaux tendineux et peuvent également être palpées en faisant glisser les doigts le long de la queue. Vue au microscope optique d'une coupe transversale réalisée au niveau de la vertèbre. L'extrémité Skoal montre qu'il existe six groupes tendineux distincts, puisque le tendon de chacun d'eux s'insère sur la vertèbre, et que nous n'utilisons que les tissus ventraux.Quatre tendons sont extraits à chaque incision, deux provenant des groupes inférieurs et deux provenant des groupes latéraux. Pour réaliser la résection, vous pouvez utiliser une cisaille chirurgicale afin de sectionner le disque intervertébral et un scalpel sur une planche à découper pour les tissus mous. À ce stade, la face ventrale est identifiable par la présence de plus gros éponges tendineuses.Une fois l'orientation vérifiée, le tendon est doucement extrait de l'extrémité distale à l’aide d’une pince ; lorsque plus aucun tissu ne peut être séparé, la queue est sectionnée au niveau de l’épaule vertébrale, comme indiqué précédemment. Après l’extraction, le tissu est immédiatement plongé dans la solution et, en tenant les deux extrémités, le tendon est transféré dans une plaque de manipulation contenant également la solution cellulaire, et sur laquelle un ruban adhésif sert à identifier l’extrémité proximale. Une analyse microscopique d’une coupe longitudinale colorée à l’hématoxyline et à l’éosine montre qu’en utilisant cette méthode simple et répétitive, l’obturateur tissulaire extrait possède un réseau de collisions bien délimité et fortement compacté.Après manipulation, lorsque les tissus subissent une stimulation mécanique, nous décrivons leurs propriétés mécaniques en normalisant la force interne par rapport à la contrainte. Par conséquent, nous devons évaluer leur section transversale. Pour ce faire, le profil du tendon est reconstruit à l’aide d’une microscopie stéréo équipée d’une caméra numérique.Avec cette méthode, l'intégrité du tissu est préservée, car la charge ou la contrainte de neige est directement appliquée sur celui-ci. L'appareil photo numérique prend des images de la projection du locataire sur un champ de vision de 180°. Dans un repère, un algorithme d'analyse d'image localise les bords supérieur et inférieur de l'échantillon.Ensuite, un algorithme utilisant le logiciel MATLAB est employé pour effectuer la reconstruction du profil. Un micromètre optique a été conçu pour maintenir le tissu dans la zone de focalisation. En effet, en dehors de cette région, la projection est floue et un recadrage déplacerait le repère local.Le micromètre comprend un compartiment de mesure destiné à prévenir la déshydratation du tissu. Deux systèmes de positionnement sont équipés d'un plateau rotatif, permettant la rotation de l'échantillon, ainsi que deux dispositifs d'ancrage constitués de tubes en silicone comprimés contre des axes colorés. Tout d'abord, le compartiment de mesure est rempli de solution cellulaire froide jusqu'à ce que l'entrée des tubes en silicone soit immergée.Ensuite, le spationaute est transféré dans le compartiment de mesure à l'aide de pinces, en ne tenant que ses extrémités. À l'aide d'une pipette à microvolume, les extrémités du tendon sont introduites par section dans les tubes en silicone. Une aspiration est ensuite effectuée jusqu'à ce que l'extrémité dépasse les couleurs du manche.Une fois les deux côtés terminés, les couleurs de l'arbre sont serrées à l'aide d'une clé de collier pour comprimer le tube. Maintenant que le tendon est fixé, l'appareil est installé sous le microscope stéréo. Le tendon peut être observé directement sur l'écran d'ordinateur avec un grossissement de 105.Pour assurer une cohérence, le tendon est étiré jusqu'à ce que les plis ne soient plus perceptibles, puis soumis à une déformation supplémentaire de 0,4 %. Étant donné que l'échantillon est photographié de 0 à 170 degrés, une position initiale et un réglage du focus sont nécessaires afin d'obtenir une image nette sur toute la circonférence. En effet, 18 images sont prises, l'angle de rotation de l'échantillon augmentant de 10 degrés entre chaque vue.Avec cette méthode, il est possible d'estimer la surface de la section transversale d'un tendon de queue de rat sans endommager le tissu. À la fin, une reconstruction du profil est obtenue avec une marge d'erreur de 0,5 à 2 %. Après la mesure, les tissus sont rincés afin de prévenir toute contamination pouvant avoir eu lieu lors des manipulations précédentes.Une plaque de manipulation stérile contenant une solution de prise fraîche est placée dans l'enceinte, l'une étant utilisée pour la procédure de rinçage tandis que l'autre recevra le tendon rincé. L'expérimentateur nettoie son gant avec de l'éthanol à 70 % avant d'introduire le tendon extrait dans la cabine de sécurité biologique. En ne tenant que les extrémités, le tendon est transféré soigneusement d'un puits à l'autre.Enfin, il est transféré dans une plaque de manipulation individuelle contenant également une solution cellulaire stérile. Pour la validation du protocole, nous avons réalisé des tests de viabilité et d'asepsie. La viabilité cellulaire a d'abord été évaluée à l'aide d'un kit de viabilité et de cytotoxicité « live/dead » pour cellules de mammifères.Après une culture de 12 jours, une grande majorité de cellules vivantes vertes fluorescentes ont été visualisées, confirmant que les procédures d'isolement réussissent à préserver le tissu vivant. Des examens ont ensuite été réalisés pour vérifier la contamination de la culture utilisée. Le milieu a été ensemencé sur gélose et incubé pendant 10 jours, aucune croissance bactérienne n'ayant été observée.Nous avons vérifié que nos manipulations étaient stériles. Le système d'ancrage utilisé exploite l'avantage de la déshydratation des tissus et de la colle pour de petits échantillons tels que la queue de rat ou les tendons, la colle pénétrant alors dans le tissu. Cela assure la fixation de toutes les sous-unités, tandis que la déshydratation améliore leurs propriétés mécaniques afin d'éviter toute contamination ultérieure.Toute la procédure de chargement est effectuée sous hotte de sécurité biologique, où tous les instruments et composants de la chambre sont stériles. Pour l'opération de chargement, la chambre du bioréacteur est fixée sur un gabarit de positionnement. Deux bras mobiles sont configurés pour recevoir les ancres des tendons.Un couvercle ferme la chambre afin d'éviter toute contamination. Tout d'abord, les ancres sont déposées aux extrémités de la plaque de manipulation. Leurs bobines sont centrées par rapport à l'axe longitudinal de la rainure et au-dessus du tendon.Le tendon est ensuite enroulé autour d'une ancre. L'ancre est roulée d'environ trois quarts de tour tandis que le corps du tissu reste en solution. En tenant l'extrémité libre, on assure l'attachement du tissu à l'ancre.La même procédure est ensuite répétée pour l'autre extrémité. Une fois les deux côtés fixés, les ancres sont enroulées ou déroulées de manière égale jusqu'à ce qu'il y ait six centimètres entre les deux extrémités. Sur la partie blessée des tendons, deux gouttes de 2,5 microlitre d'ocreate sont déposées.Pour procéder à l'adhésion, on prend des précautions. Afin d'éviter de mettre de la colle dans la solution cellulaire, un minimum de cinq minutes est nécessaire pour que la colle sèche complètement. Afin de valider notre protocole, nous avons effectué des tests pour vérifier l'influence de la colle et de la déshydratation du point d'ancrage sur la viabilité du tissu.Après deux heures, nous avons observé que la condition extrême ne s'était pas propagée au-delà du tissu. En effet, une limite de couleur bien définie marque la frontière entre les cellules mortes fluorescents rouges situées au point d'ancrage et la majorité des cellules vivantes vertes du corps du tissu. Entre-temps, la chambre du bioréacteur est remplie de milieu de culture frais.Une fois que la plaie d'une partie du tendon est sèche, elle est réhydratée avec la solution cellulaire. Ensuite, le tissu ancré est transféré dans la chambre à l'aide d'une pince. Le couvercle est fermé afin d'éviter toute contamination supplémentaire.Le gabarit de positionnement sera retiré une fois que la chambre sera installée dans le bioréacteur. Nous venons de montrer comment préparer un tendon de queue de rat pour des études biomécaniques et biologiques mécaniques. En appliquant ces procédures, nous pouvons réaliser une grande variété d'études in vitro sur ces tissus.Par exemple, une étude sur la dégénérescence tissulaire a été réalisée en appliquant une sous-stimulation pendant une période de 10 jours. Chaque jour, nous avons évalué le tissu, ses propriétés mécaniques et effectué un essai de relaxation de contrainte non destructif. À la fin, nous avons pu observer une variation de la contrainte.Nous avons fourni des preuves que nos procédures rigoureuses d'isolement et de préparation permettent de maintenir la viabilité du tissu, l'intégrité et l'anti. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos propres expériences.

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