Préparation de la souris Immunogène hypophysaires pour l'induction de hypophysite auto-immune expérimentale

L’hypophysite auto-immune se caractérise par une hypertrophie de l’hypophyse et une carence en une ou plusieurs hormones hypophysaires. Les auto-antigènes responsables restent inconnus. Ici, un protocole de préparation des protéines de la glande pituitaire de souris pour l’étude de cette maladie est démontré.

Tout d’abord, l’hypophyse est isolée chez des souris euthanasiées. Les hypophyses sont ensuite homogénéisées pour briser mécaniquement les cellules et libérer des protéines cytosoliques. L’homogénéité est clarifiée par centrifugation à basse vitesse et évaluée pour la quantité par colormétrie, dosage BCA et qualité par électrophorèse sur gel de poly acrylamide.

Enfin, l’homogénat de protéines aqueuses est mélangé à un adjuvant huileux. Ce mélange est ensuite injecté dans des souris pour créer un modèle de souris ressemblant à une hypophysite auto-immune. Comme le montre la vidéo d’accompagnement, quatre techniques ont été décrites pour induire une hypophysite chez des animaux de laboratoire.

La technique présentée dans cet article, c’est-à-dire l’injection de protéines hypophysaires, est la plus ancienne, datant des années 1960. D’autres approches ont été l’injection de glycoprotéines solubles du virus de la rubéole en 1992, l’injection stéréotaxique d’un adénovirus directement dans la glande pituitaire en 2002 et la transplantation de la glande pituitaire d’une souche de rat sous la capsule rénale d’une autre souche de rat en 2010. Le principal avantage de l’approche adjuvante de Florence est qu’elle est aujourd’hui moins invasive, plus consistante et surtout plus précise dans l’induction d’une maladie qui ressemble de près à son homologue humain.

Bien qu’elle ait été signalée depuis les années 1960, la technique adjuvante étrangère a donné de mauvais résultats pour l’induction de l’hypophysite. Lorsque j’ai commencé mon travail de doctorat, je n’ai pu obtenir qu’une instance et une gravité modestes de l’hypophysite en utilisant le protocole adjuvant étranger publié. Les choses s’améliorent considérablement lorsque j’ai l’idée de multiplier par dix la quantité de protéines pitu contenues dans l’émotion EM.

Bien que ces méthodes puissent fournir des informations sur la pathogenèse de l’hypophysite auto-immune, elles peuvent également être utilisées pour étudier d’autres maladies auto-immunes pour lesquelles les antigènes automatiques restent à identifier. Généralement, les personnes novices dans cette méthode auront du mal principalement avec la dernière étape, la préparation de la marge, car elle nécessite des compétences manuelles, du temps et du dévouement. Une démonstration visuelle est donc essentielle pour comprendre comment une émulsion appropriée doit être préparée.

Les implications de cette technique s’étendent au-delà du domaine de l’auto-immunité. Savoir comment préparer l’antigène in pour l’immunisation peut également être utilisé pour la production d’anticorps monoclonaux ou pour tester de nouveaux vaccins. La démonstration de cette technique sera faite par S Zoo heroic Ura et Mayland al gato de mon laboratoire.

L’hypophyse de souris est une glande de forme cylindrique qui se trouve à la base du crâne dans une dépression de l’os sphénoïde appelée térica. La glande est bordée latéralement par les nerfs trijumeaux et antérieurement par le chiasma du nerf optique. Il est composé d’un lobe antérieur plus grand et de lobes plus petits, intermédiaires et postérieurs.

Pour isoler la glande pituitaire, utilisez des ciseaux pour décapiter la souris euthanasiée, puis faites des coupes parallèles de l’arrière vers l’avant du crâne. Soulevez le cerveau et retournez-le vers l’arrière pour exposer la glande pituitaire, qui apparaît comme un cylindre dans le contexte d’un triangle isocèle. Ayant la glande pituitaire comme base, les nerfs trijumeaux comme côtés et le chiasma optique comme sommet.

Encerclez la glande avec les pointes d’une pince fermée pour briser la méninga environnante. Ensuite, à l’aide d’une pince fine, saisissez l’hypophyse de la cellule de Turca et placez-la dans un tube en plastique sur de la glace sèche. Pour une préparation, collectez 300 glandes pituitaires de souris.

Cette collecte nécessite environ neuf heures-personnes. Une fois la collecte terminée, stockez les glandes pituitaires à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles soient nécessaires. Placez un tube Falcon de 15 millilitres dans un bain de glace.

Ajouter au tube 250 microlitres de tampon d’homogénéisation. Pour chaque 100 hypophyses prélevées juste avant l’homogénéisation, ajoutez les glandes hypophysaires de souris au tampon. Ensuite, placez l’extrémité de l’homogénéisateur polytron, un générateur de cinq millimètres de diamètre, au fond du tube Falcon contenant les hypophyses de souris et tamponnez, homogénéisez à vitesse maximale pendant 30 secondes.

Déplacez doucement le tube de haut en bas tout en le maintenant sur de la glace. Laissez ensuite reposer l’homogénat sur de la glace pendant une minute. Répétez les étapes d’homogénéisation et de refroidissement deux fois de plus.

Cette homogénéisation douce devrait briser les cellules et libérer les protéines sans casser les noyaux de la centrifugeuse. L’homogénat à basse vitesse, environ 1000 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius jusqu’aux sédiments, les noyaux, les tissus ininterrompus et les matériaux insolubles tels que le tissu conjonctif et les complexes protéiques dénaturés. En prenant soin de ne pas déranger le granulé.

Transférer le SNA maintenant appelé post-nucléaire ou PNS vers un nouveau magasin de tubes Falcon. Le PNS sur la glace rétracte la pastille en utilisant le même volume de tampon d’homogénéisation qu’auparavant, homogénéise et centrifuge comme auparavant. Après avoir regroupé les deux échantillons de SNP, élaguez la solution dans de nombreux microtubes à centrifuger.

Stockez les microtubes à centrifuger à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient nécessaires. Cette préparation protéique est stable à moins 80 degrés Celsius, mais perd progressivement de sa puissance. Ainsi, il est recommandé de l’utiliser dans les six mois suivant la préparation.

Conserver une petite aliquote de SNP pour déterminer le rendement et la concentration en protéines par le dosage bi-acide. Déterminez ensuite la qualité des protéines par électrophorèse sur gel à partir de 300 glandes pituitaires de souris, qui pèsent en moyenne environ 570 milligrammes. Attendez-vous à un rendement de 60 milligrammes de protéines hypophysaires ou d’un milligramme de protéines pour 10 milligrammes de tissu.

La concentration en protéines est généralement d’environ 40 milligrammes par millilitre. L’exemple fourni ici concerne l’immunisation de 10 souris. Prévoyez d’injecter à chaque souris 100 microlitres d’émulsion contenant un milligramme de protéine hypophysaire, permettant à deux souris supplémentaires pour les pertes de matériau pendant la préparation ici, 12 milligrammes d’émulsion protéique sont préparés.

Commencez par décongeler rapidement les aliquotes protéiques congelées en les réchauffant dans vos mains. Ajustez la concentration en protéines à 20 milligrammes par millilitre avec du PBS. Ensuite, prélevez 600 microlitres d’extrait de protéine hypophysaire correspondant à 12 milligrammes dans une seringue Gas Tite Hamilton de 2,5 millilitres de remise en suspension, un adjuvant FRONS complet ou un CFA contenant cinq milligrammes par millilitre de mycobacterium tuberculosis tué par la chaleur en le secouant manuellement.

Ensuite, prélevez 600 microlitres de CFA dans une autre seringue Hamilton de 2,5 millilitres. Fixez et fixez une aiguille micro-émulsifiante de calibre 22 à la seringue remplie de CFA. Poussez lentement le piston de manière à ce que l’aiguille soit remplie de CFA.

Ensuite, fixez et fixez l’autre extrémité de l’aiguille à l’autre seringue remplie d’extrait de protéine hypophysaire. Évitez de piéger des bulles d’air à l’intérieur des seringues. Avancez lentement le piston de la seringue CFA pour pousser le composant d’huile dans l’extrait hypophysaire aqueux de sorte que seule une petite quantité soit mélangée.

Repoussez ensuite le piston de la seringue d’extrait hypophysaire dans la seringue CFA. Répétez cette action pour augmenter progressivement la quantité de matériau mélangé jusqu’à ce que tout le contenu soit mélangé. Ce matériau blanchâtre et uniformément réparti représente l’émulsion d’eau et d’huile.

Une fois l’émulsion formée, répétez le cycle complet de va-et-vient au moins 500 fois après le cycle final, les seringues contiendront une émulsion d’eau et d’huile où la concentration en protéines hypophysaires est maintenant de 10 milligrammes par millilitre. L’émulsion est prête à l’emploi pour tester la qualité de l’émulsion à une goutte de celle-ci dans un bécher d’eau. Si l’émulsion est préparée correctement, la goutte restera compacte et serrée sur la surface.

Si l’émulsion est de mauvaise qualité, elle s’étalera et se divisera en gouttes plus petites. L’émulsion est injectée le jour même de sa préparation chez des souris SJL pour induire une hypophysite auto-immune expérimentale. Ce protocole est détaillé dans le jo ci-joint de vertical.

Une fois que la glande pitu a été collectée et que les techniques sont maîtrisées, on peut effectuer l’instruction des protéines en une heure, en se rappelant de travailler rapidement et sur glace. Au cours de cette étape, lors de la préparation de l’immersion, qui nécessite environ une heure. N’oubliez pas de travailler lentement et patiemment dans la phase initiale de mélange après son développement.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’auto-immunité pour explorer les mécanismes par lesquels les lymphocytes autoréactifs reconnaissent et infiltrent l’organe cible. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer un extrait de protéine de l’hypophyse de souris et de la façon de le mélanger avec des aju de Crohn pour préparer une émulsion prête à être utilisée comme immunogène. N’oubliez pas que travailler avec des seringues et des seringues complètes contre la grippe, qui contiennent une tuberculose microbactérienne inactivée et sèche, peut être dangereux si vous vous percez accidentellement.

Utilisez donc toujours G glows et jetez correctement les aiguilles lors de cette procédure.