Name: Linduction de hypophysite auto-immune expérimentale chez la souris SJL (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Découvrez l'induction d'hypophysite auto-immune chez la souris SJL par injection d'immunogène hypophysaire et évaluation histopathologique. Ce modèle reproduit fidèlement la maladie humaine pour étudier les mécanismes auto-immuns.

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Ce travail a été soutenu par NIH DK080351 au PC, et par un généreux don de la course Terry et Kristine Gore famille.

Protocole expérimental Une fois que l&#39;immunogène hypophyse est préparé (voir article connexe), il est injecté par voie sous cutanée dans des souris SJL (Les Jackson Laboratories, stock 000686). Une seconde injection identique est répété 7 jours plus tard. Les souris sont ensuite utilisées pour recueillir in vivo et post mortem des résultats. Etape 1. Injection sous-cutanée d&#39;immunogène hypophysaire chez la souris SJL Sont d&#39;abord anesthésiés souris par l&#39;injection de 0,5 ml de 20 mg / ml de 2,2,2-tribromoéthanol (Avertin, TCI America, T-1420) par voie intrapéritonéale. Les souris sont ensuite injectés par voie sous cutanée avec 100 pi de l&#39;émulsion hypophyse qui, comme indiqué dans le compagnon JoVE 2181 article, contient 1 mg d&#39;extrait pituitaire et 0,25 mg d&#39;adjuvant complet de Freund. L&#39;émulsion est injectée dans la région dorsale de la jambe gauche derrière ((50 pi) et la région inguinale droite (50 pi). L&#39;émulsion hypophyse est injecté à nouveau sur 7 jours dans les sites opposée (50 pi dans la région de la jambe droite de derrière et dorsale 50 ul de la région inguinale gauche). Les souris sont surveillés tous les jours pour les 3 premiers jours, puis chaque semaine jusqu&#39;à ce que le jour du sacrifice, qui est généralement 28 jours après la première immunisation. Etape 2. Collecte des résultats en vivo: tests sanguins Le tissu le plus couramment utilisé pour évaluer les résultats expérimentaux alors que les souris sont encore vivants est le sang. Le sang est systématiquement établi 14 jours après la première immunisation pour mesurer les taux sériques d&#39;anticorps hypophyse ou d&#39;autres marqueurs comme les cytokines et chimiokines. Le sang est recueilli à partir des souris vivantes comme suit. Les souris sont solidement maintenu par la peau du cou et le dos de la mâchoire est situé. Une fois l&#39;arrière de la mâchoire est situé, 4 lancettes mm sont utilisées pour percer le bundle submandibulaires vasculaire. Après le sang est recueilli, la pression sur l&#39;endroit sur la surface à l&#39;aide d&#39;un tampon imbibé d&#39;alcool pour éviter un hématome. Sang recueilli est centrifugé à 2000 g pendant 20 minutes, et conservés à -80 ° C jusqu&#39;à leur utilisation. Étape 3. Collecte des résultats post-mortem: l&#39;hypophyse histopathologie Les souris sont généralement sacrifiés 28 jours après la première immunisation. La fonction cardinale nécessaires pour établir le diagnostic de l&#39;EAH est l&#39;infiltration de la glande pituitaire par les cellules mononucléées hématopoïétiques. Les souris sont euthanasiées en les plaçant dans une chambre de plastique scellé qui est perfusée avec du CO 2. Les souris sont conservés dans la chambre pour un total de 8 minutes. Après l&#39;euthanasie, la glande pituitaire est recueilli comme décrit dans l&#39;article compagnon. Une glande pituitaire malades apparaît enflée et plus fermement adhérente à la dure entourant mère. Pince de Sharp sont utilisés pour assouplir les méninges autour de la glande pituitaire. Une fois l&#39;hypophyse se déplace librement sur l&#39;os sphénoïde, un bout de la glande pituitaire est saisi avec une pince et la glande pituitaire est soigneusement levées. La glande est ensuite placé dans un microtube contenant 5 fixateur de Beckstead. La glande pituitaire est fixe pendant la nuit, enveloppés dans du papier lentille, et placé dans une cassette. Les glandes sont ensuite traitées selon le protocole suivant: <table border="1"><tbody><tr><td> Numéro de la station </td><td> Réactifs </td><td> Temps en minutes </td><td> De température (Celsius) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 70% d&#39;alcool </td><td> 5 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 70% d&#39;alcool </td><td> 15 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 95% d&#39;alcool </td><td> 15 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 95% d&#39;alcool </td><td> 15 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> D&#39;alcool à 100% </td><td> 15 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> D&#39;alcool à 100% </td><td> 7.5 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 7 </td><td> D&#39;alcool à 100% </td><td> 7.5 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 8 </td><td> xylène </td><td> 20 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 9 </td><td> xylène </td><td> 20 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 10 </td><td> xylène </td><td&gt; 20 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 11 </td><td> paraffine </td><td> 30 </td><td> 58 </td></tr><tr><td> 12 </td><td> paraffine </td><td> 5 </td><td> 58 </td></tr><tr><td> 13 </td><td> paraffine </td><td> 5 </td><td> 58 </td></tr></tbody></table> Après le traitement, l&#39;hypophyse sont inclus dans la paraffine et au moins 5 sections non consécutifs (5-um d&#39;épaisseur) sont découpées dans chaque glande. Après sectionnement, les glandes sont colorées à l&#39;hématoxyline et l&#39;éosine, et analysées afin de quantifier l&#39;infiltration de mononucléaires. La section avec l&#39;infiltration la plus sévère est sélectionné pour la notation. La gravité est marqué basée sur une estimation subjective de la mesure de remplacement hypophyse antérieure ou la destruction par les cellules immunitaires: grade 0, aucune maladie, grade 1, 2% -20% la participation; de grade 2, 20% -30%, grade 3, 30% -50%; grade 4, 50% -90%; grade 5, plus de 90%. Toutes les sections sont marqués par deux individus aveuglés à la source des sections.

<ol><li>Tzou, S. C., Lupi, I., Landek, M., Gutenberg, A., Tzou, Y. M., Kimura, H., Pinna, G., Rose, N. R., Caturegli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+Hypophysitis+of+SJL+mice%3A+Clinical+Insights+from+a+New+Animal+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Autoimmune Hypophysitis of SJL mice: Clinical Insights from a New Animal Model.</a> Endocrinology. , (2008).</li>
<li>Twarog, F. J., Rose, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+production+of+thyroid+autoantibodies+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The production of thyroid autoantibodies in mice.</a> J Immunol. 101, 242-2450 (1968).</li>
<li>Patrick, J., Lindstrom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+response+to+acetylcholine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Autoimmune response to acetylcholine receptor.</a> Science. 180, 871-872 (1973).</li>
<li>Caturegli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+hypophysitis%3A+an+underestimated+disease+in+search+of+its+autoantigen%28s%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Autoimmune hypophysitis: an underestimated disease in search of its autoantigen(s).</a> J Clin Endocrinol Metab. 92, 2038-2040 (2007).</li>
<li>Beckstead, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+preservation+of+fixation-sensitive+antigens+in+paraffin-embedded+tissues%3A+addendum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">A simple technique for preservation of fixation-sensitive antigens in paraffin-embedded tissues: addendum.</a> J Histochem Cytochem. 43, 345-345 (1995).</li>
<li>Levine, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allergic+adenophypophysitis%3A+new+experimental+disease+of+the+pituitary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Allergic adenophypophysitis: new experimental disease of the pituitary gland.</a> Science. 158, 1190-1191 (1967).</li>
<li>Yoon, J. W., Choi, D. S., Liang, H. C., Baek, H. S., Ko, I. Y., Jun, H. S., Gillam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+an+organ-specific+autoimmune+disease%2C+lymphocytic+hypophysitis%2C+in+hamsters+by+recombinant+rubella+virus+glycoprotein+and+prevention+of+disease+by+neonatal+thymectomy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Induction of an organ-specific autoimmune disease, lymphocytic hypophysitis, in hamsters by recombinant rubella virus glycoprotein and prevention of disease by neonatal thymectomy.</a> Journal of Virology. 66, 1210-1214 (1992).</li>
<li>Davis, J. R., McMahon, R. F., Lowenstein, P. R., Castro, M. G., Lincoln, G. A., McNeilly, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+the+ovine+pituitary+gland+is+associated+with+hypophysitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated gene transfer in the ovine pituitary gland is associated with hypophysitis.</a> J Endocrinol. 173, 265-271 (2002).</li>
<li>Rotondo, F., Quintanar-Stephano, A., Asa, S. L., Lombardero, M., Berczi, I., Scheithauer, B. W., Horvath, E., Kovacs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenohypophysitis+in+rat+pituitary+allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">Adenohypophysitis in rat pituitary allografts.</a> Int J Exp Pathol. , (2010).</li>
</ol>

Quatre techniques ont été signalés à induire hypophysite animaux de laboratoire. La technique décrite dans cet article, qui est l&#39;injection de protéines pituitaires mélangé avec un adjuvant de Freund s, est la plus ancienne, datant de 1967 6, et a été amélioré, plus récemment, 1. D&#39;autres techniques sont l&#39;injection de glycoprotéines solubles virus de la rubéole en 1992 7, l&#39;injection stéréotaxique d&#39;un adénovirus directement dans la glande pituitaire en 2002 8,<...

<table><tbody><tr><td>Souris SJL (The Jackson Laboratories)</td><td></td><td>stock 000686</td><td></td></tr><tr><td>2,2,2-Tribrom&amp;#8211;éthanol (Avertin)</td><td>TCI America</td><td>T-1420</td><td></td></tr><tr><td>Fixateur de Beckstead&amp;rsquo;s</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;induction de hypophysite auto-immune expérimentale chez la souris sjl

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Hypophysite auto-immunes peuvent être reproduits expérimentalement par l&#39;injection de protéines pituitaires mélangé à un adjuvant dans des souris sensibles 1. Des modèles murins nous permettra d&#39;étudier comment les maladies se dérouler, offrant souvent une bonne réplique des mêmes processus survenant chez les humains. Pour certaines maladies auto-immunes, comme le diabète de type 1A, il existe des modèles (la souris NOD) qui développent spontanément une maladie similaire à l&#39;homologue humain. Pour beaucoup d&#39;autres maladies auto-immunes, cependant, le modèle doit être induite expérimentalement. Une approche commune à cet égard consiste à injecter de la souris avec un antigène dominant dérivé de l&#39;organe étudié. Par exemple, les enquêteurs s&#39;intéressent à injecter de thyroïdite auto-immune des souris avec de la thyroglobuline 2, et ceux qui s&#39;intéressent à la myasthénie les injecter avec le récepteur 3 acétylcholine. Si l&#39;autoantigène pour une maladie auto-immune particulière n&#39;est pas connu, les enquêteurs injecter un extrait protéique brut de l&#39;organe ciblé par la réaction auto-immune. Pour hypophysite auto-immunes, l&#39;autoantigène pathogène (s) restent à identifier 4, et donc une préparation de protéine brute pituitaire est utilisé. Dans cet article, nous montrons comment la vidéo pour induire expérimentale auto-immune dans hypophysite souris SJL.

Cette vidéo montre comment provoquer hypophysite auto-immunes chez la souris SJL et comment évaluer sa gravité par histopathologie.

L&#39;induction de hypophysite auto-immune expérimentale chez la souris SJL

L'hypophysite autoimmune peut être reproduite expérimentalement par l'injection de protéines hypophysaires mélangées à un adjuvant chez des souris sensibles1. La souris...

L'hypophysite auto-immune se caractérise par un agrandissement de l'hypophyse et une carence en une ou plusieurs hormones hypophysaires. Les auto-antigènes responsables restent inconnus. Une vidéo accompagnante montre un protocole de préparation d'un immunogène hypophysaire murin, qui sera utilisé ici pour créer un modèle murin simulant l'hypophysite lymphocytaire auto-immune humaine.L'immunogène hypophysaire est injecté dans une souche de souris sensible. Ensuite, l'injection est répétée sept jours plus tard ; après 14 jours, le sang est prélevé pour des études de biomarqueurs. Au jour 28, les glandes hypophysaires sont prélevées sur des souris sacrifiées, sectionnées et colorées afin de déterminer l'importance de l'infiltration des leucocytes.L'hypophysite auto-immune est une maladie de reconnaissance croissante qui peut être difficile à distinguer des autres masses non sécrétantes d'hormones apparaissant dans la selle turcique. Bien que cette maladie ait été décrite pour la première fois il y a environ 50 ans, les auto-antigènes reconnus par le système immunitaire du patient dans l'hypophysite auto-immune sont restés insaisissables. En 2008, nous avons publié le développement d'un modèle murin qui reproduit fidèlement la maladie humaine qu'il était destiné à imiter.Ce modèle murin peut être utilisé pour découvrir les auto-antigènes hypophysaires impliqués et pour approfondir les connaissances sur la pathogenèse et l'évolution naturelle de l'hypophysite. Ce modèle repose sur l'injection de protéines hypophysaires murines dans une souche sensible, comme la souche SJL. Ces protéines doivent être mélangées à un adjuvant puissant afin de créer un environnement inflammatoire local qui induit finalement l'apparition de lymphocytes autoréactifs dirigés contre l'hypophyse.D'abord dans les ganglions lymphatiques drainant le site d'injection, puis dans l'hypophyse. Le modèle nécessite l'injection de quantités relativement importantes de protéines hypophysaires, soit un total de deux milligrammes par souris. Cela suggère que l'auto-antigène ou les auto-antigènes sont présents en quantité minime au sein de la glande de la fertilité. L'injection d'un adjuvant correctement préparé est essentielle à l'induction de la maladie, car elle permet une libération lente et continue de protéines hypophysaires au niveau des sites d'injection, favorisant ainsi la génération et l'activation de lymphocytes spécifiques de l'hypophyse.Dans la vidéo accompagnant ce texte, une méthode de préparation de l'immunogène hypophysaire est présentée. Les glandes hypophyaires isolées à partir de souris euthanasiées sont homogénéisées puis clarifiées par une centrifugation à faible vitesse. Le mélange protéique est évalué quantitativement par un dosage colorimétrique (BCA) et qualitativement par électrophorèse sur gel de polyacrylamide.L'homogénat protéique aqueux est ensuite mélangé à un adjuvant huileux contenant des bacilles inactivés de mycobactérie tuberculeuse afin de produire l'émulsion hypophysaire. Après avoir préparé l'émulsion comme indiqué dans la vidéo associée, retirez l'aiguille microémulsifiante de la seringue d'un millilitre et fixez-y une aiguille de calibre 25. Une quantité de 100 microlitres d'émulsion hypophysaire est nécessaire pour chaque souris à injecter.Après avoir anesthésié une souris avec de l'Everton, vérifiez qu'il n'y a aucune réponse à une pincée du orteil, puis injectez 50 microlitres de l'émulsion par voie sous-cutanée dans la région dorsale postérieure de la patte gauche. Assurez-vous que la pointe de l'aiguille est complètement sous la peau et qu'aucune émulsion ne suinte du site d'injection. Ensuite, injectez 50 microlitres dans la région inguinale droite.Veillez à nouveau à ce que rien ne s'écoule. Notez que l'émulsion est blanchâtre et peut être difficile à distinguer sur fond de la fourrure blanche de la souris SGL L après l'injection. Replacez la souris dans sa cage et surveillez sa récupération.Surveiller quotidiennement les souris injectées pendant les trois premiers jours suivant l'injection afin de s'assurer qu'aucune détresse extrême ne survient. L'adjuvant est pro-inflammatoire car il contient des Mycobacterium tuberculosis inactivés. Bacilles au jour sept, répéter l'injection sur les côtés anatomiques opposés.Injectez 50 microlitres dans la région dorsale de la patte arrière droite et 50 microlitres dans la région inguinale gauche. Surveillez la souris comme précédemment, car les résultats expérimentaux seront évalués après qu'une réponse immunitaire se soit produite. Le sang est le tissu le plus couramment utilisé pour évaluer les résultats expérimentaux pendant que les souris sont encore vivantes.Le prélèvement sanguin est effectué systématiquement 14 jours après la première immunisation afin de mesurer les taux sériques d'anticorps hypophysaires ou d'autres marqueurs tels que les cytokines et les chimiotactines. Pour prélever du sang sur une souris vivante, maintenez fermement l'animal par la peau du cou et repérez l'arrière de la mâchoire. Une fois cet emplacement identifié, piquez délicatement le faisceau vasculaire sous-mandibulaire à l'aide d'un lancette de quatre millimètres.Le sang commencera à s'écouler de la zone perforée. Recueillez six gouttes de sang dans un tube de microcentrifugeuse. Nettoyez la zone perforée avec une serviette en papier humide pour arrêter l'hémorragie.Placer les tubes de sang dans une centrifugeuse et centrifuger à 2000 G pendant 20 minutes. Cette centrifugation sépare les cellules sanguines, qui se retrouveront dans le culot, du surnageant sérique. Transférer le sérum dans un nouveau tube de microcentrifugeuse.Conserver le sérum à moins 80 degrés Celsius jusqu'à ce qu'il soit nécessaire. Il faut environ un mois pour que les souris immunisées développent une hypophysite auto-immune complète. Par conséquent, les souris sont généralement sacrifiées 28 jours après la première immunisation.Après avoir coupé le crâne, soulevez le cerveau et retournez-le vers l'arrière pour exposer l'hypophyse. Une hypophyse malade apparaît gonflée et adhère plus fermement aux méninges environnantes. Déplacez la pointe de la pince fine autour de l'hypophyse pour détacher les méninges.Une fois que l'hypophyse se déplace librement sur cet os phén, saisissez une extrémité de la glande avec une pince et soulevez-la délicatement de cet os phén. Placez le tissu dans un tube de microcentrifugeuse contenant un millilitre de solution de Bétadine, un fixateur à base de zinc, et fixez la glande toute la nuit à température ambiante. Le lendemain, transférez l'hypophyse sur un morceau de papier pour lentilles.Enveloppez la glande pituitaire dans du papier filtre et placez-la dans une cassette d'histologie. Traitez l'échantillon en l'incubant dans des concentrations croissantes d'alcool, puis de xylène après traitement. Retirez le papier filtre et placez la glande pituitaire dans un moule métallique.Ensuite, recouvrir l'hypophyse avec du paraffine. Placer la cassette à tissus au-dessus du moule et la remplir de paraffine supplémentaire. Enfin, placer l'ensemble sur de la glace pour laisser la paraffine durcir.Une fois que le paraffin a solidifié, utilisez un microtome pour découper des sections de cinq micromètres d'épaisseur. Ramassez les sections sur une lame en verre. Récoltez au moins cinq sections non consécutives sur la même lame provenant de chaque glande pituitaire de souris.Colorer les lames avec de l'hématine et de l'éosine à l'aide d'une station automatisée de coloration tissulaire. Examiner les lames au microscope optique afin de recueillir les résultats. Le critère histologique principal d'une glande pituitaire ayant développé une hypophysite est son infiltration par des lymphocytes, qui apparaissent comme de petites cellules bleues s'insinuant à travers le parenchyme pituitaire, isolément ou en formant des agrégats.Les lymphocytes sont associés à divers degrés de destruction des cellules endocrines normales de l'hypophyse. La coupe présentant l'infiltration lymphocytaire la plus sévère et la destruction la plus importante de la glande pituitaire est choisie pour la cotation par deux investigateurs aveugles aux conditions expérimentales. La cotation est basée sur une estimation subjective de l'ampleur des lésions.Un score de zéro indique une glande pituitaire normale ou que les lymphocytes et autres cellules mononucléaires hématopoïétiques sont rarement observés. Un score de un indique que l'infiltration mononucléaire occupe entre deux et 20 % de la zone totale de l'hypophyse antérieure. Un score de deux indique que l'infiltration mononucléaire occupe entre 20 et 30 % de la zone totale de l'hypophyse antérieure.Un score de trois indique que l'infiltration mononucléaire occupe entre 30 et 50 % de la surface totale de l'hypophyse antérieure. Un score de quatre indique que l'infiltration mononucléaire occupe entre 50 et 90 % de la surface totale de l'hypophyse antérieure, et un score de cinq indique que l'infiltration mononucléaire occupe presque toute la surface de l'hypophyse antérieure. Une fois maîtrisée, l'injection de l'immunogène dans une souris peut être réalisée en 15 minutes.Le prélèvement de sang périphérique sur une souris peut être réalisé en cinq minutes, et la préparation des lames pour l'histopathologie en six heures, tout en tentant la procédure d'immunisation. Il est important de surveiller attentivement l'état de santé de la souris après l'anesthésie et l'injection de l'immunogène. En complément de l'histopathologie pituitaire.Cette procédure peut être utilisée pour recueillir une grande variété de résultats expérimentaux à l’aide de différentes méthodes, telles que l’évaluation des sous-populations cellulaires dans les ganglions lymphatiques drainants par cytométrie en flux. La technique d’immunisation à l’aide d’un extrait tissulaire pour induire une maladie auto-immune ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de l’auto-immunité afin de découvrir les événements clés de la pathogénie de la maladie. Après avoir visionné cette vidéo, on devrait bien comprendre comment immuniser des souris afin d’induire une hypophysite auto-immune expérimentale, ainsi que la manière d’évaluer ses incidents et sa gravité.N'oubliez pas que le travail avec des lames microtomes peut présenter un danger. Des précautions telles que le port de gants et le travail dans des conditions d'éclairage adéquates doivent toujours être prises.

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