Test activité Protozoacidal du ligand-lytique peptides contre Gut Termite protozoaires In vitro (Culture protozoaires) et In vivo (Microinjection dans Termite Intestin postérieur)

L'objectif général de cette procédure est de démontrer qu'un ligand synthétisé se lie spécifiquement aux protozoaires digestifs de la cellulose présents dans l'intestin des termites souterrains de la forme mosen, et que ce ligand associé à un peptide lytique tue ces protozoaires in vitro dans une culture anaérobie de protozoaires et in vivo par injection dans l'intestin postérieur du terme. Ceci est réalisé en extrayant d'abord les protozoaires intestinaux des termites ouvriers dans des conditions anaérobies. La deuxième étape de la procédure consiste à confirmer la liaison d'un ligand marqué par un fluorochrome aux protozoaires intestinaux des termites in vitro.

La troisième étape de la procédure consiste à démontrer que le peptide lytique couplé à un ligand tue les protozoaires intestinaux des termites in vitro. La dernière étape de la procédure consiste à injecter un ligand marqué par un fluorochrome et un peptide lytique couplé à un ligand dans l'intestin postérieur du terme afin de confirmer la liaison et la destruction des protozoaires intestinaux in vivo. À l'aide d'injections de cultures de protozoaires dans l'intestin postérieur du terme et de microscopie à fluorescence, nous montrons qu'un ligand couplé à un peptide lytique se lie et tue efficacement les protozoaires intestinaux des termites in vitro et in vivo.

L'attachement du ligand au peptide lytique a accru la toxicité vis-à-vis des protozoaires par rapport au peptide lytique seul. Bien qu'il ait réduit la toxicité envers les organismes non ciblés tels que E. coli, très probablement parce que le ligand ne se lie pas à la membrane cellulaire bactérienne, la disparition des protozoaires entraîne la mort des termites en moins de deux semaines. La technique présentée, utilisant des peptides colitiques LIG pour éliminer les protozoaires symbiotiques présents dans l'intestin des termites souterrains, s'inscrit dans le cadre des efforts visant à développer des méthodes alternatives de lutte contre les termites.

Avec une moindre dépendance aux produits chimiques en l'absence de symbiotes dans leurs intestins, les termites meurent. Nous extrayons les protozoaires de l'intestin des termites afin de démontrer que le ligand se fixe aux protozoaires et que le peptide lytique du ligand tue les protozoaires. Les particules de bois à l'intérieur des protozoaires présentent une autofluorescence. Il est donc important de comparer les résultats des protozoaires traités avec le ligand fluorescent à ceux des protozoaires non traités.

Pour éviter tout faux positif, nous injectons directement les peptides dans l'intestin postérieur, car si les peptides sont administrés par voie alimentaire aux termites, les protéases présentes dans l'intestin moyen et l'intestin antérieur les digéreraient. À l'aide de bibliothèques d'affichage Farge de New England Bio Labs, nous avons identifié 19 séquences peptidiques HEP qui se lient aux protozoaires. Nous avons choisi l'un des ligands portant une séquence peptidique présentant des similitudes avec des glycoprotéines putatives connues de la membrane de *Troma brucei*.

Après la synthèse du peptide, nous avons couplé le peptide synthétisé à une sonde fluorescente en C-terminal par une synthèse peptidique en phase solide en utilisant la résine E-D-A-N-S novatech afin d'évaluer les propriétés lytiques des conjugués peptidiques. Dans cette procédure, nous utilisons un conjugué du ligand synthétisé et du peptide lytique ate, qui avait été synthétisé précédemment au centre de protéines de l'LSU un jour avant l'expérimentation. Utilisez du sigma coat pour traiter tous les matériaux utilisés et empêcher l'absorption des protozoaires ou des peptides sur les surfaces.

Appliquer une couche uniforme et laisser sécher toute la nuit avant de l'utiliser le jour suivant. Préparer une boîte à ventilateur dans une boîte à gants afin de faire circuler en continu de l'air à température ambiante à travers des cartouches empilées contenant un agent desséchant et un catalyseur de type D, afin de réduire l'humidité et les niveaux d'oxygène pendant plus d'une heure. Remplir la boîte à gants d'un flux continu d'azote pendant 20 à 30 minutes et utiliser de l'azote supplémentaire pour maintenir des conditions anaérobies si nécessaire.

Ensuite, préparez le milieu Traeger U et ajustez le pH à sept. Placez le milieu stérilisé par filtration dans la boîte à gants à l’aide d’une pipette de 200 microlitres fixée à un tube contenant une mixture de 2,5 % d’hydrogène, 5 % de dioxyde de carbone et 92,5 % d’azote, pendant une heure afin d’éliminer les résidus d’oxygène présents dans la boîte à gants. Une fois les matériaux prêts, utilisez une pince pour prélever un ouvrier termitien d’une boîte de Pétri et immergez l’ensemble du corps dans un bécher rempli d’éthanol à 70 % en tenant délicatement le terme avec la pince pendant environ 10 secondes. Pour éliminer les contaminants de surface, retirez l’ouvrier de l’éthanol et laissez-le sécher sur une lingette Kim propre pendant environ 20 secondes.

Dans la boîte à gants, préparez une lame de microscope silanisée avec 100 microlitres de milieu Trager U pour recueillir l'intestin de termite, ainsi qu'un tube contenant 900 microlitres de milieu Trager U pour recueillir les protozoaires. Ensuite, à l’aide d’un microscope stéréoscopique et d’une paire de pinces stériles à extrémité fine, maintenez l’abdomen de l’ouvrier et saisissez l’extrémité de l’abdomen avec une autre paire de pinces afin de tirer doucement l’intestin vers le haut ou vers le bas selon un angle de 45 degrés. Essayez de prélever quatre intestins, comprenant le mésentéron et l’intestin postérieur, en un seul morceau. Placez les intestins ainsi obtenus dans une goutte de 100 microlitres de milieu Trager U sur une lame de microscope.

Faites glisser l'échantillon suivant, percez les intestins postérieurs à l'aide d'une paire de sondes de dissection stériles et fines pour libérer les protozoaires, puis transférez délicatement le contenu intestinal à l’aide d’une pipette de 200 microlitres dans un tube microcentrifuge de un millilitre contenant 900 microlitres de milieu Traeger. Laissez reposer pendant cinq secondes pour permettre la sédimentation des fragments de paroi intestinale, puis transférez 900 microlitres du surnageant dans un tube propre. Transférez te microlitres de la culture de protozoaires sur un microscope recouvert de sigma.

Faites glisser et vérifiez l'état des protozoaires au microscope à un grossissement de 200 fois. Préparez des cultures témoins de protozoaires aérobies, de *Tetrahymena piriformis*, d'amibe, d'*ug*, de *gleaner*, de paramécie, ainsi qu'une culture d'*E. coli* sur une nuit dans le milieu de culture, conformément aux recommandations du fournisseur, immédiatement après avoir obtenu les protozoaires. Fixez les protozoaires intestinaux de termites et tout autre témoin protozoaire, ainsi que l'*E. coli*, avec du formaldéhyde à 10 % à quatre degrés Celsius pendant 12 heures. Ensuite, centrifugez la solution de protozoaires à 30 fois la gravité pendant 10 minutes.

Jetez le surnageant et lavez le culot contenant les protozoaires fixés deux fois avec un millilitre de milieu Trager U réutilisé, redispensez le culot dans un millilitre de milieu Traeger, incubez les micro-organismes fixés pendant une à deux heures avec 100 microlitres d'une solution de ligand synthétisé couplé au colorant fluorescent E-D-A-N-S, en utilisant une concentration finale de 50 micromolaire de ligand dissous dans l'eau. Observez les micro-organismes traités avec les ligands ainsi que les témoins non traités au microscope à fluorescence avec un grossissement de 400 fois, à une longueur d'onde d'absorption maximale de 341 nanomètres et une émission dans la région bleue à 471 nanomètres.

Pour évaluer les propriétés des peptides lytiques conjugués à un ligand, pipeter six aliquotes de 198 microlitres de culture de protozoaires préparée comme indiqué à la section trois dans des tubes Eppendorf de 0,5 millilitre. Ajouter deux microlitres d'une solution de peptide lytique à ligand à 100 micromolaire à la moitié des aliquotes de la culture de protozoaires intestinaux de termites. Pour obtenir une concentration finale d'un micromolaire, ajouter deux microlitres d'eau stérile comme témoin à l'autre moitié des aliquotes.

Après une heure, transférez 10 microlitres de chaque culture de protozoaires sur une lame. Comparez la survie des protozoaires traités par le peptide lytique conjugué à un ligand à celle des témoins au microscope avec un grossissement de 200 fois, en utilisant un tire-embouts NGI PC avec un micropipeteur à deux niveaux de chauffe. Pour obtenir une taille de pointe comprise entre 20 et 30 microns, vérifiez la taille de la pointe en la mesurant au microscope.

À l’aide d’un micromètre, remplir une aiguille avec environ 30 microlitres de ligand marqué par fluorescence à 50 micromolaire, suspendu dans l’eau. À l’aide d’une seringue fixée, remplir une autre aiguille avec de l’eau pour le témoin. Fixer une micropipette à un support et à un micromanipulateur. Fixer une aiguille au support du système d’injection sur un second micromanipulateur.

Régler les paramètres initiaux d'injection sur une durée d'impulsion d'environ une seconde et une pression d'injection de 10 à 12 PSI. Ensuite, avancer lentement l'aiguille dans la micropipette et injecter la solution à l'aide d'une pédale après l'injection. Retirer la micropipette et noter la longueur de la solution injectée.

À l'aide d'un pied à coulisse, calculez le volume injecté à partir des paramètres connus de la micropipette et ajustez la pression et la durée de l'impulsion pour expulser 0,3 microlitre de solution. Ensuite, préparez 20 termites pour chaque traitement destiné à l'injection. Commencez par serrer délicatement l'extrémité de l'abdomen avec une pince douce afin d'éliminer toute excrétion présente dans le rectum.

Ensuite, immobilisez les ouvrières de termites en les refroidissant sur de la glace pendant cinq minutes, le temps qu'elles s'immobilisent. Préparez des réceptacles pour maintenir les ouvrières de termites en sectionnant les embouts de pipettes de 100 microlitres. À l’aide d’une lame de scalpel, coupez l’embout sur une longueur de 10 à 12 millimètres, en fonction de la taille des termites, puis placez-les dans un flacon.

Avec un bouchon à vis, fixez le récepteur au micromanipulateur. Placez une ouvrière sur une boîte de Pétri en position dorsale et aspirez-la tête la première dans le récepteur à l’aide d’une pompe à aspiration à l’azote, de sorte que l’extrémité de l’ouvrière dépasse du récepteur. Tout en maintenant le termite fermement dans le récepteur, faites avancer prudemment l’aiguille remplie à l’aide du micromanipulateur afin de l’insérer dans l’anus de l’ouvrière. Injectez 0,3 microlitre du ligand marqué au fluorochrome ou du contrôle d’eau.

Placer les ouvriers injectés avec le ligand ou de l'eau dans des boîtes de Pétri séparées contenant du papier filtre humide et les maintenir toute la nuit à 26 degrés Celsius avec une humidité relative de 78 %. Après 24 heures, extraire les intestins des termites injectés et recueillir les protozoaires comme indiqué précédemment. Observer la liaison du ligand aux protozoaires provenant des termites injectés à l'aide de la microscopie à fluorescence afin d'évaluer les propriétés lytiques des peptides lytiques conjugués au ligand chez les termites vivants.

Préparez les matériaux d'injection, l'équipement et les termites comme précédemment pour les injections, puis injectez 0,3 microlitre d'une solution de peptide lytique à 500 micromolaire ou de l'eau en tant que témoin dans le tube digestif postérieur de 20 ouvriers termites. Après 24 heures, prélèvent des intestins supplémentaires sur plusieurs ouvriers et observent le contenu intestinal au microscope à un grossissement de 200 fois dès que la mort de tous les protozoaires dans l'intestin des termites traités est confirmée. Conservez les termites traités restants et les témoins dans des boîtes de Pétri contenant du papier filtre humide et observez la mortalité quotidiennement. Nous confirmons que le ligand couplé à une sonde fluorescente se lie aux trois espèces de protozoaires, P. grassi, H. hartmanni et S. leidyi.

À partir de l'intestin postérieur de quatre termites souterrains de mousse, à des densités indétectables, la liaison du ligand se produit sur toute la surface cellulaire et est concentrée dans la région antérieure des protozoaires selon l'axe, près d'une lame de microtubules et du noyau MP œil d'herbe. Nous avons également détecté une fluorescence chez toutes les espèces de protozoaires aérobies libres testées, ce qui suggère que le ligand se lie à des structures génériques aux protozoaires. Aucune liaison du ligand n'ayant été observée pour E. coli, un micromolaire de ligand peptidique lytique a tué les trois espèces de protozoaires provenant de l'intestin des ouvrières de termites souterrains et d'omo, ainsi que le protozoaire libre Tetrahymena piriformis in vitro en moins de 10 minutes, tandis que les témoins sont restés vivants.

Cette image montre la perte progressive de l'intégrité membranaire des protozoaires intestinaux de termites traités avec un peptide lytique porteur d'un ligand. Aucune différence n'a été observée dans le nombre de colonies d’*E. coli* entre les traitements au peptide lytique porteur d'un ligand et à l'eau. Cependant, le peptide lytique sans ligand réduit considérablement le nombre de colonies d’*E. coli*. Ceci suggère que l'attachement d'un ligand au peptide lytique protège dans une certaine mesure les micro-organismes non ciblés de la lyse. L'injection de 0,3 microlitre d'une solution de peptide lytique porteur d'un ligand à 500 micromolaire a tué les trois espèces de protozoaires présentes dans l'intestin des termites supérieurs et souterrains dans les 24 heures, et les termites sont morts après 10 jours lorsque le peptide lytique couplé à un ligand a été injecté.

Les protozoaires et les termites sont morts trois fois plus rapidement que lorsqu'on injectait des peptides lytiques non conjugués à un ligand, comme indiqué dans Husen et Colia, 2009, suggérant que le ligand augmente l'efficacité cydale des peptides lytiques contre les protozoaires en conditions optimales de culture. Les trois espèces de proa extraites de l'intestin des termites souterrains de Omo. devraient rester vivantes et en bonne santé pendant au moins trois jours.

Cependant, s'il reste des résidus d'oxygène dans le milieu, le déplacement des protozoaires cesse immédiatement. Si le mauvais milieu est utilisé et que la pression osmotique dans les cellules devient trop élevée, les membranes des protozoaires gonflent et les protozoaires éclatent. Si la pression osmotique dans les cellules devient trop faible ou si les membranes sont altérées, les protozoaires se flétrissent et rétrécissent. La fixation des protozoaires facilite la détection de la liaison d'un ligand marqué par un fluorochrome aux protozoaires.

Il est difficile de détecter la fluorescence et de la distinguer de l'autofluorescence des particules de bois lorsque les protozoaires se déplacent librement. Une fois cette technique maîtrisée, environ 30 termites peuvent être injectés par heure à l’aide d’un assistant. Bien que le peptide ligand colitique ait été conçu pour éliminer les symbiotes protosomiques dans l’intestin des termites souterrains, et donc pour la lutte contre les termites, il pourrait également s’avérer utile pour développer des médicaments contre les parasites protosomiques tels que slash mania, ponoma, te et odium, responsables de nombreuses maladies chez l’humain.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment obtenir et maintenir en culture des protozoaires extraits de l'intestin des termites, comment montrer la liaison spécifique d'un ligand aux protozoaires par microscopie de fluorescence, comment démontrer in vitro l'action proto-suicidaire du peptide colitique ligand. Et enfin, comment injecter des peptides dans l'intestin du terme pour une confirmation in vivo.