Name: Stratégies pour létude de neuroprotection du froid préconditionnement (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-02T17:30:00.000+00:00
Duration: 16 min 27 s
Description: Découvrez les mécanismes de neuroprotection par préconditionnement froid dans des cultures de tranches d'hippocampe de rat. Cette méthode permet d'étudier la signalisation immunitaire neuronale impliquant le TNF-α et l'interleukine 11.

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Ce travail a été financé par des subventions de l&#39;Institut national des troubles neurologiques et des maladies (NS-19108), la Fondation pour la recherche Migraine, et la Fondation blanche à Richard P. Kraig. Mme Marcia P. Kraig aidé à la préparation des milieux de culture et d&#39;entretien des cultures tranche. Nous tenons à remercier Yelena Grinberg pour ses commentaires et révisions sur une version finale de cet article.

<ol><li>Aptowicz, C. O., Kunkler, P. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic+plasticity+in+hippocampal+slice+cultures+involves+changes+in+voltage-gated+Na%2B+channel+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Homeostatic plasticity in hippocampal slice cultures involves changes in voltage-gated Na+ channel expression.</a> Brain Res. 998, 155-163 (2004).</li>
<li>Beattie, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+synaptic+strength+by+glial+TNFalpha%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of synaptic strength by glial TNFalpha.</a> Science. 295, 2282-2285 (2002).</li>
<li>Breder, C. D., Dewitt, D., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+inducible+cyclooxygenase+in+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Characterization of inducible cyclooxygenase in rat brain.</a> J Comp Neurol. 355, 296-315 (1995).</li>
<li>Caggiano, A. O., Breder, C. D., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+elevation+of+cyclooxygenase-2%2C+but+not+lipoxygenase%2C+in+regions+synaptically+distant+from+spreading+depression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Long-term elevation of cyclooxygenase-2, but not lipoxygenase, in regions synaptically distant from spreading depression.</a> J Comp Neurol. 376, 447-462 (1996).</li>
<li>Caggiano, A. O., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eicosanoids+and+nitric+oxide+influence+induction+of+reactive+gliosis+from+spreading+depression+in+microglia+but+not+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Eicosanoids and nitric oxide influence induction of reactive gliosis from spreading depression in microglia but not astrocytes.</a> J Comp Neurol. 369, 93-108 (1996).</li>
<li>Caggiano, A. O., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandin+E2+and+4-aminopyridine+prevent+the+lipopolysaccharide-induced+outwardly+rectifying+potassium+current+and+interleukin-1beta+production+in+cultured+rat+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Prostaglandin E2 and 4-aminopyridine prevent the lipopolysaccharide-induced outwardly rectifying potassium current and interleukin-1beta production in cultured rat microglia.</a> J Neurochem. 70, 2357-2368 (1998).</li>
<li>Caggiano, A. O., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandin+E+receptor+subtypes+in+cultured+rat+microglia+and+their+role+in+reducing+lipopolysaccharide-induced+interleukin-1beta+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Prostaglandin E receptor subtypes in cultured rat microglia and their role in reducing lipopolysaccharide-induced interleukin-1beta production.</a> J Neurochem. 72, 565-575 (1999).</li>
<li>Calabrese, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+therapies+for+stroke+and+traumatic+brain+injury+often+display+U-shaped+dose+responses%3A+occurrence%2C+mechanisms%2C+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Drug therapies for stroke and traumatic brain injury often display U-shaped dose responses: occurrence, mechanisms, and clinical implications.</a> Crit Rev Toxicol. 38, 557-577 (2008).</li>
<li>Calabrese, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+stress+response+terminology%3A+Integrating+the+concepts+of+adaptive+response+and+preconditioning+stress+within+a+hormetic+dose-response+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Appl+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Biological stress response terminology: Integrating the concepts of adaptive response and preconditioning stress within a hormetic dose-response framework.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 222, 122-128 (2007).</li>
<li>Calabrese, E. J., Baldwin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormesis%3A+the+dose-response+revolution%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Hormesis: the dose-response revolution.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 43, 175-197 (2003).</li>
<li>Hansel, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+CD4%2B+T-cell+gene+expression+in+allergic+subjects+using+two+different+microarray+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%22%5BJournal%5D)">Analysis of CD4+ T-cell gene expression in allergic subjects using two different microarray platforms.</a> Allergy. 63, 366-369 (2008).</li>
<li>Hulse, R. E., Kunkler, P. E., Fedynyshyn, J. P., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+multiplexed+bead-based+cytokine+immunoassays+for+rat+serum+and+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of multiplexed bead-based cytokine immunoassays for rat serum and brain tissue.</a> J Neurosci Methods. 136, 87-98 (2004).</li>
<li>Hulse, R. E., Swenson, W. G., Kunkler, P. E., White, D. M., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monomeric+IgG+is+neuroprotective+via+enhancing+microglial+recycling+endocytosis+and+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Monomeric IgG is neuroprotective via enhancing microglial recycling endocytosis and TNF-alpha.</a> J Neurosci. 28, 12199-12211 (2008).</li>
<li>Hulse, R. E., Winterfield, J., Kunkler, P. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+clasmatodendrosis+in+hippocampal+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Astrocytic clasmatodendrosis in hippocampal organ culture.</a> Glia. 33, 169-179 (2001).</li>
<li>Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-alpha+and+Microglial+Hormetic+Involvement+in+Neurological+Health+and+Migraine%5BTitle%5D)+AND+%22International+Dose-Respose+Society%22%5BJournal%5D)">TNF-alpha and Microglial Hormetic Involvement in Neurological Health and Migraine.</a> International Dose-Respose Society. , (2010).</li>
<li>Kunkler, P. E., Hulse, R. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+cytokine+protein+expression+profiles+from+spreading+depression+in+hippocampal+organotypic+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Multiplexed cytokine protein expression profiles from spreading depression in hippocampal organotypic cultures.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 24, 829-839 (2004).</li>
<li>Kunkler, P. E., Hulse, R. E., Schmitt, M. W., Nicholson, C., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+current+source+density+analysis+in+hippocampal+organotypic+culture+shows+that+spreading+depression+occurs+with+uniquely+reversing+currents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optical current source density analysis in hippocampal organotypic culture shows that spreading depression occurs with uniquely reversing currents.</a> J Neurosci. 25, 3952-3961 (2005).</li>
<li>Kunkler, P. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+astrocytosis+from+excitotoxic+injury+in+hippocampal+organ+culture+parallels+that+seen+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Reactive astrocytosis from excitotoxic injury in hippocampal organ culture parallels that seen in vivo.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 17, 26-43 (1997).</li>
<li>Kunkler, P. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+waves+precede+electrophysiological+changes+of+spreading+depression+in+hippocampal+organ+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Calcium waves precede electrophysiological changes of spreading depression in hippocampal organ cultures.</a> J Neurosci. 18, 3416-3425 (1998).</li>
<li>Kunkler, P. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P%2FQ+Ca2%2B+channel+blockade+stops+spreading+depression+and+related+pyramidal+neuronal+Ca2%2B+rise+in+hippocampal+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">P/Q Ca2+ channel blockade stops spreading depression and related pyramidal neuronal Ca2+ rise in hippocampal organ culture.</a> Hippocampus. 14, 356-367 (2004).</li>
<li>Lambertsen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+protect+neurons+against+ischemia+by+synthesis+of+tumor+necrosis+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia protect neurons against ischemia by synthesis of tumor necrosis factor.</a> J Neurosci. 29, 1319-1330 (2009).</li>
<li>Lee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulator+of+G-protein+signaling+10+promotes+dopaminergic+neuron+survival+via+regulation+of+the+microglial+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulator of G-protein signaling 10 promotes dopaminergic neuron survival via regulation of the microglial inflammatory response.</a> J Neurosci. 28, 8517-8528 (2008).</li>
<li>Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormesis+and+disease+resistance%3A+activation+of+cellular+stress+response+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Exp+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Hormesis and disease resistance: activation of cellular stress response pathways.</a> Hum Exp Toxicol. 27, 155-162 (2008).</li>
<li>Ning, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+simultaneous+gene+profiling+of+84+drug-metabolizing+genes+in+primary+human+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Systematic and simultaneous gene profiling of 84 drug-metabolizing genes in primary human hepatocytes.</a> J Biomol Screen. 13, 194-201 (2008).</li>
<li>Oppenheim, J., Feldman, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOppenheim%2C+J+%22in+Cytokine+Reference%22">in Cytokine Reference</a>. Oppenheim, J. J., Feldman, M. 1, Academic. New York. (2001).</li>
<li>Pfaffl, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 29, e45-e45 (2001).</li>
<li>Stellwagen, D., Beattie, E. C., Seo, J. Y., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+AMPA+receptor+and+GABA+receptor+trafficking+by+tumor+necrosis+factor-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of AMPA receptor and GABA receptor trafficking by tumor necrosis factor-alpha.</a> J Neurosci. 25, 3219-3228 (2005).</li>
<li>Stellwagen, D., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+scaling+mediated+by+glial+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synaptic scaling mediated by glial TNF-alpha.</a> Nature. 440, 1054-1059 (2006).</li>
<li>Streit, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+as+neuroprotective%2C+immunocompetent+cells+of+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Microglia as neuroprotective, immunocompetent cells of the CNS.</a> Glia. 40, 133-139 (2002).</li>
<li>Wilde, G. J., Pringle, A. K., Sundstrom, L. E., Mann, D. A., Iannotti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+and+augmentation+of+ischaemia-related+neuronal+death+by+tumour+necrosis+factor-alpha+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Attenuation and augmentation of ischaemia-related neuronal death by tumour necrosis factor-alpha in vitro.</a> Eur J Neurosci. 12, 3863-3870 (2000).</li>
</ol>

Deux concepts fondamentalement important important à la délimitation du système de signalisation des cytokines impliquées dans la neuroprotection froid préconditionnement sont illustrés dans les figures 6 et 7. Tout d'abord, les cytokines sont extrêmement faibles molécules de signalisation de concentration dans le cerveau normal. Néanmoins, physiologiques des changements de concentration de cytokines ont un énorme potentiel de modifier la structure du cerveau et la fonction (c.-à-phénotype) en raison de leur capacité à modifier l'expression des gènes (Figure 6). De plus, les cytokines sont très redondantes et pléiotrope en ce que plusieurs cytokines peuvent avoir des effets similaires et une seule cytokine peut avoir des effets variables (figure 7). Ainsi, pour établir avec précision les cytokines innées des bases pour la neuroprotection du froid préconditionnement (ou d'autres stimuli physiologiques de préconditionnement), analyse composite des variables de signalisation connexes doit être déterminée. Ceci est accompli grâce à des stratégies d'analyse multiplexés. Ceci permettra d'établir la cytokine «signature» de froidpréconditionnement neuroprotection. <img src="/files/ftp_upload/2192/2192fig6.jpg" alt="Figure 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 6"> Figure 6. Puissance de signalisation des cytokines cerveau. Les illustrations transmettre le pouvoir immense de signalisation de concentrations physiologiques de cytokines cérébrales par rapport aux concentrations d'autres bien connus homologues. Concentration est représentée comme étant l'inverse de la distance, en commençant par une tige souple à ressort unique comme point de référence. De sodium (10 -1 M illustrée par un grain de poivre) et de potassium (10 -3 M illustrée par la tomate) sont présents dans l'espace interstitiel du cerveau à des niveaux de l'ordre de 150 et 3 mm, respectivement, et ont bien reconnu rôles dans fonction électrophysiologique des cellules neuronales. De même, le pH (par exemple, ~ 10 -7 M niveaux d'ions hydrogène et illustrés comme 780 mètres le long au bord du lac de Chicago) et de calcium (par exemple, ~ 10 -8 M niveaux montré que 7,8 kilomètres vu partir d'une image satellite de Google ainsi que Chicago du lac de McCormick Place à Promontory Point, à Hyde Park, près de l'Université de Chicago). En outre, des neurotransmetteurs libérés de l'espace interstitiel au cours de ces concentrations affecter l'activité locale région du cerveau. En revanche, les cytokines (comme le montre la distance entre la Terre et Mars) peuvent altérer le fonctionnement du cerveau à des concentrations de plus de dix millions de fois moins. <img src="/files/ftp_upload/2192/2192fig7.jpg" alt="Figure 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 7"> Figure 7. Signalisation interactifs de voies de cytokines innées. Cytokines sont très redondants et pléiotrope en ce que plusieurs cytokines peuvent avoir des effets similaires et une seule cytokine peut avoir des effets variables. Cette diversité provient de signalisation interactif complexe qui se produit au niveau des ligands, des récepteurs et des phosphoprotéines. Complexité supplémentaire provient du fait que le cerveau se compose de différents types de cellules, chaque cellule capable de cytokine spécifique innée, récepteur, et liée phosphoprotéine changes. À titre d'exemple ici, seules les voies de signalisation des cytokines innées (dérivée des études de cellules immunitaires) sont affichés. Par souci de simplicité, le cerveau est dessinée comme une seule cellule (ligne blanche) montrant les interactions potentielles de cytokines innées (IL-1α et l'IL-1β (appelée ici l'IL-1α / β), le TNF-α, IL-6, IFN-γ et l'IL-10), les récepteurs (IL-1R1, TNFR1, IL-6/gp130, IFNyR, et IL-10R), et phosphoprotéines (c.-à-kinases ERK1 / 2, P38 (P38-MAPK) et JNK) facteurs de transcription et (ATF-2, NFkB, et STAT3). Par exemple, le TNF-α signaux via TNFR1 à JNK, p38-MAPK et ERK1 / 2, ce qui déclenche l'expression des gènes par l'intermédiaire ATF-2. TNF-α modifie également l'expression des gènes directement par l'activation NFkB. Ensemble, l'activation de ces facteurs de transcription evoke augmenté (flèche) et une diminution (bout franc) l'expression de cytokines et de leurs récepteurs comme indiqué. Fait important, ces voies de montrer que les changements dans une cytokine (par exemple, le TNF-α) influence prouction d'autres (par exemple, l'IL-1β) des cytokines. Ainsi, pour déterminer de manière précise les cytokines bases pour la neuroprotection du froid préconditionnement, analyse composite des variables de signalisation connexes doit être déterminée. Ceci permettra d'établir la cytokine innée "signature" du froid préconditionnement. (L'image a été compilé à partir des données de référence n ° 25.)

Préparation des cultures Slice <table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif / Equipement </td><td> Entreprise </td><td> Catalogue / Numéro de modèle </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Millicell-CM inserts de culture de tissus (30 mm) </td><td> Thermo Fisher </td><td> PICM0-3050 </td><td></td></tr><tr><td> Moyen de base de Eagle </td><td> Invitrogen </td><td> 21010 </td><td></td></tr><tr><td> Earle s Balanced Salt Solution </td><td> Sigma </td><td> E2888 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum de cheval </td><td> Invitrogen </td><td> 26050-088 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Invitrogen </td><td> 35050 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamicine </td><td> Invitrogen </td><td> 15710-064 </td><td></td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Invitrogen </td><td> 15295 </td><td></td></tr><tr><td> D-glucose </td><td> Sigma </td><td> G8769 </td><td></td></tr><tr><td> BSL-1 hotte </td><td> Boulanger </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tissue chopper McIlwain </td><td> Brinkmann </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Disques de téflon </td><td> Brinkmann </td><td> 023-49-310-1 </td><td></td></tr><tr><td> Spatule </td><td> Thermo Fisher </td><td> 14 à 373-25A </td><td></td></tr><tr><td> Courbe ciseaux à iris </td><td> Outils Fine Science </td><td> 14091-09 </td><td></td></tr><tr><td> Longs ciseaux droits </td><td> Outils Fine Science </td><td> 14002-14 </td><td></td></tr><tr><td> Pince à bec long </td><td> Thermo Fisher </td><td> 13-812-40 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> Pinces angulaires </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11808-02 </td><td></td></tr><tr><td> Pince courte </td><td> Thermo Fisher </td><td> 13-812-38 </td><td></td></tr><tr><td> N ° 5 Inox forceps </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11254-20 </td><td></td></tr><tr><td> 2 Iris spatules </td><td> Outils Fine Science </td><td> 10094-13 </td><td></td></tr><tr><td> 150 x 15 mm boîte de Pétri </td><td> Thermo Fisher </td><td> 08-757-148 </td><td></td></tr><tr><td> 60 x 15 mm boîte de Pétri </td&gt; <td> Thermo Fisher </td><td> 08 à 757-100B </td><td></td></tr><tr><td> Sauvage M8 stéréomicroscope </td><td> Wild Heerbrugg </td><td></td><td></td></tr><tr><td> La solution Gey équilibre salin </td><td> Sigma </td><td> G9779 </td><td></td></tr><tr><td> Blak-Ray mètre de mesure ultraviolet à ondes courtes </td><td> UVP </td><td> J-225 </td><td></td></tr><tr><td> 6-et boîtes de culture Falcon </td><td> Thermo Fisher </td><td> 08-772-1B </td><td></td></tr><tr><td> Neurobasal </td><td> Invitrogen </td><td> 21103</td><td></td></tr><tr><td> B27 supplément </td><td> Invitrogen </td><td> 17504 </td><td></td></tr><tr><td> Gem21 Neuroplex </td><td> Bioproduits Gémeaux </td><td> 400-160-010 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;acide ascorbique </td><td> Sigma </td><td> A4544 </td><td></td></tr><tr><td> Analyseur de CO 2 </td><td> Bacharach </td><td> # 2820 </td><td></td></tr></tbody></table> Pré-sélection pour la vitalité des cultures Slice <table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif / Equipement </td><td><strong&gt; Société </td><td> Catalogue / Numéro de modèle </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Sytox vert </td><td> Invitrogen </td><td> S7020 </td><td></td></tr><tr><td> DMIBRE microscope inversé </td><td> Leica </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Froid Préconditionnement <table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif / Equipement </td><td> Entreprise </td><td> Catalogue / Numéro de modèle </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> BSL-2 Hotte </td><td> NuAire </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Blessure excitotoxique <table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif / Equipement </td><td> Entreprise </td><td> Catalogue / Numéro de modèle </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> CooISNAP fx caméra CCD </td><td> Photométrie </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fluorescéine </td><td> Invitrogen </td><td> F36915 </td><td></td></tr><tr><td> MetaMorph logiciel </td><td> Molecular Devices </td><td> v 7.5.04 </td><td></td></tr><tr><td> 100 hématimètre um de profondeur </td><td> Hausser scientifique </td><td></td><td></td></tr><tr><td> N-méthyl-D-aspartate </td><td> Calbiochem </td><td> 454575 </td><td></td></tr><tr><td> SigmaStat logiciel </td><td> Systat Software Inc </td><td> version 3.5 </td><td></td></tr></tbody></table> Co-traitements appliqués à froid Préconditionnement <table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif / Equipement </td><td> Entreprise </td><td> Catalogue / Numéro de modèle </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> sTNFR1 </td><td&gt; R &amp; D Systems </td><td> 425-R1-050 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum Albumine Bovine </td><td> Sigma </td><td> A-4503 </td><td></td></tr></tbody></table> RNA Isolation <table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif / Equipement </td><td> Entreprise </td><td> Catalogue / Numéro de modèle </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Ater rne </td><td> Ambion </td><td> AM7021 </td><td></td></tr><tr><td> Micro RNeasy Kit </td><td> Qiagen </td><td> 74004 </td><td></td></tr><tr><td> β-mercaptoéthanol </td><td> Pêcheur </td><td> 03446-100 </td><td></td></tr><tr><td> Diposable 1,5 RNAse free Pilon </td><td> Outil de précision du Sud Jersey et à la moisissure, Inc </td><td> 749521-1590 </td><td></td></tr><tr><td> RNasin </td><td> Promega </td><td> N261A </td><td></td></tr><tr><td> Tris [hydroxyméthyl] aminométhane </td><td> Sigma </td><td> T3069 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA (acide éthylènediamine-hydrate de sel disodique </td><td> Sigma </td><td> # E7889 </td><td></td></tr></tbody></table> Quantification ARN <table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif / Equipement </td><td> Entreprise </td><td> Catalogue / Numéro de modèle </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> RiboGreen Assay </td><td> Invitrogen </td><td> R11491 </td><td></td></tr><tr><td> ARNt de levure </td><td> Invitrogen </td><td> 15401-011 </td><td></td></tr><tr><td> Tubes de 1,5 ml à centrifuger </td><td> USA Scientific </td><td> 16155500 </td><td></td></tr><tr><td> Plaque de 96 puits dosage par fluorescence </td><td> Nunc </td><td> DK-4000 </td><td></td></tr><tr><td> 96-et lecteur de plaque fluorescente </td><td> Tecan </td><td> Safire II </td><td></td></tr></tbody></table> PCR quantitative <table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif / Equipement </td><td> Entreprise </td><td> Catalogue / Numéro de modèle </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> kit iScript transcription inverse </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-8891 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green </td><td> Invitrogen </td><td> S7563 </td><td></td></tr><tr><td> Platinum Taq polymérase </td><td> Invitrogen </td><td> ARN Ultrasense 11732-927 </td><td></td></tr><tr><td> iCycler thermocycleur </td><td> Bio-Rad </td><td> iCycler Module Optique </td><td></td></tr><tr><td> Système logiciel iCycler </td><td> Bio-Rad </td><td> version 3.1 </td><td></td></tr></tbody></table> PCR quantitative pour puces à ADN <table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif / Equipement </td><td> Entreprise </td><td> Catalogue / Numéro de modèle </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> RNase Away </td><td> Molecular BioProducts </td><td> # 7000 </td><td></td></tr><tr><td> RT 2 Kit First Strand </td><td> SABiosciences </td><td> C-03 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green PCR basée mélange </td><td> SABiosciences </td><td> PA-011 </td><td> Spécifique pour iCycler </td></tr><tr><td> RT 2 Profiler PCR array </td><td> SABiosciences </td><td> PARN-011A </td><td></td></tr></tbody></table> Essai protéomique <table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif / Equipement </td><td> Entreprise </td><td> Catalogue/ Numéro de modèle </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Kit de lyse cellulaire </td><td> Bio-Rad </td><td> 171-304011 </td><td></td></tr><tr><td> Microcentrifugeuse </td><td> Fisher Scientific </td><td> Micro 7 </td><td></td></tr><tr><td> Stocks protéine BSA </td><td> Bio-Rad </td><td> 500-0007 </td><td></td></tr><tr><td> Kit BCA protein assay </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23225 </td><td></td></tr><tr><td> Immuno des plaques de 96 puits MicroWell </td><td> Nunc </td><td> 449824 </td><td></td></tr><tr><td> Bande d&#39;étanchéité </td><td> Bio-Rad </td><td> 2239444 </td><td></td></tr><tr><td> Lecteur de plaque à 96 puits </td><td> Perkin Elmer </td><td> 1420-mulilabel contre </td><td></td></tr><tr><td> Bioplex Rat test cytokine TNF-α </td><td> Bio-Rad </td><td> X0000001T </td><td></td></tr></tbody></table> Immunocoloration <table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif / Equipement </td><td> Entreprise </td><td> Catalogue / Numéro de modèle </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Paraformaldéhyde 16% </td> &lt;td&gt; Alfa Aesar </td><td> 43368 </td><td></td></tr><tr><td> Lysine </td><td> Sigma </td><td> L-6001 </td><td></td></tr><tr><td> Phosphate de sodium </td><td> Fisher Scientific </td><td> S374-1 </td><td></td></tr><tr><td> Periodate de sodium </td><td> Sigma </td><td> S-1878 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;azoture de sodium </td><td> Sigma </td><td> S-2002 </td><td></td></tr><tr><td> Peroxyde d&#39;hydrogène (30%) </td><td> Sigma </td><td> H1009 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum de chèvre</td><td> Colorado Serum Company </td><td> CS 0920 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma </td><td> T-8787 </td><td></td></tr><tr><td> Bacs de coloration </td><td> Ted Pella, Inc </td><td> 14511 </td><td></td></tr><tr><td> Plate Shaker </td><td> Lab-Line Instruments, Inc </td><td> 3520 </td><td></td></tr><tr><td> # 1 Papiers filtres (185 mm) </td><td> Whatman </td><td> 1001-185 </td><td></td></tr><tr><td> 3,3-diaminobenzidine </td><td> Sigma </td><td> D8001 </td><td> &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> Le diméthylsulfoxyde </td><td> Sigma </td><td> D8418 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;éthanol </td><td> Pharmco-AAPER </td><td> 111000200 </td><td></td></tr><tr><td> Xylène </td><td> Fisher Scientific </td><td> X3-4 </td><td></td></tr><tr><td> Permount milieu de montage </td><td> Fisher Scientific </td><td> SP15-100 </td><td></td></tr><tr><td> Cryostat </td><td> Leica </td><td> cm 3 050 S </td><td></td></tr><tr><td> Tissue-Tek </td><td> Ted Pella, Inc </td><td> 27050 </td><td></td></tr><tr><td> À pointe fine pinceau </td><td> Ted Pella </td><td> 11806 </td><td></td></tr><tr><td> Stylo PAP blocage </td><td> Ted Pella, Inc </td><td> 22309 </td><td></td></tr><tr><td> SFX signal de renforceur </td><td> Invitrogen </td><td> A31631 </td><td></td></tr><tr><td> ProLong Antifade </td><td> Invitrogen </td><td> P7481 </td><td></td></tr></tbody></table>

stratégies pour l&#39;étude de neuroprotection du froid préconditionnement

Strategies for Study of Neuroprotection from Cold-preconditioning

Lésion neurologique est une cause fréquente de morbidité et de mortalité liés à l&#39;anesthésie générale et les procédures chirurgicales qui pourraient être atténués par le développement d&#39;efficace, facile à administrer et traitements sécuritaires préconditionnement. Nous cherchons à définir les neurones de signalisation immunitaires responsables de froid préconditionnement comme moyen d&#39;identifier de nouvelles cibles pour le développement de thérapies pour protéger le cerveau avant l&#39;apparition des blessures. Faible niveau de médiateur pro-inflammatoire de signalisation des changements au fil du temps sont essentielles à froid préconditionnement neuroprotection. Cette signalisation est compatible avec les principes fondamentaux de l&#39;hormèse conditionnement physiologique, qui exigent que les stimuli irritatifs atteindre une amplitude seuil suffisamment de temps pour s&#39;adapter aux stimuli de protection à devenir évidents. En conséquence, la délimitation de la signalisation immunitaire impliquée dans le froid-préconditionnement neuroprotection exige que les systèmes biologiques et les manipulations expérimentales plNous capacités techniques sont hautement reproductibles et sensibles. Notre approche consiste à utiliser des cultures de tranches d&#39;hippocampe comme un modèle in vitro qui reflète le mieux leur homologues en vivo avec multi-synaptiques des réseaux neuronaux matures et influencés par de repos macroglia / microglie. Cet état gliale est particulièrement important pour les microglies, car ils sont la principale source de cytokines, qui sont actifs dans le domaine femtomolaire. En outre, les cultures tranche peuvent être maintenues in vitro pendant plusieurs semaines, ce qui est un délai suffisant pour évoquer des stimuli d&#39;activation et d&#39;évaluer les réponses adaptatives. Enfin, les conditions d&#39;environnement peut être contrôlée avec précision en utilisant des cultures de tranches de sorte que la signalisation des cytokines de préconditionnement à froid peut être mesurée, imité, et modulé à disséquer les aspects noeud critique. Analyses des cytokines du système de signalisation nécessitent l&#39;utilisation de techniques sensibles et reproductibles multiplexés. Nous utilisons PCR quantitative pour le TNF-α à l&#39;écran pour acte microglialeIvation suivie en temps réel quantitative PCR quantitative dépistage tableau pour évaluer les changements de cytokines tissu entier. Ce dernier est un moyen très sensibles et reproductibles pour mesurer de multiples changements de cytokines système de signalisation simultanément. Des changements importants sont confirmés par PCR quantitative ciblée et la détection de protéines. Nous sonder pour les tissus à base de modifications des protéines cytokine en utilisant des dosages multiplexés flux de microsphères de cytométrie en utilisant la technologie Luminex. La production de cytokine spécifique des cellules est déterminée à double étiquette immunohistochimie. Dans l&#39;ensemble, cette préparation du tissu cérébral et le style de l&#39;utilisation, couplée aux stratégies proposées enquête, peut être une approche optimale pour identifier des cibles potentielles pour le développement de nouveaux traitements qui pourraient imiter les avantages du froid préconditionnement.

Nous cherchons à définir les neurones de signalisation immunitaires responsables de froid préconditionnement comme moyen d&#39;identifier de nouvelles cibles pour le développement de thérapies pour protéger le cerveau avant l&#39;apparition des blessures. Nous présentons des stratégies pour de tels travaux qui exigent des systèmes biologiques, des manipulations expérimentales ainsi que des capacités techniques qui sont hautement reproductible et sensible.

Stratégies pour l&#39;étude de neuroprotection du froid préconditionnement

Les lésions neurologiques constituent une cause fréquente de morbidité et de mortalité liées à l'anesthésie générale et aux interventions chirurgicales associées, lesquelles pourraient être atténuées par...

Les lésions neurologiques constituent une cause fréquente de morbidité et de mortalité liées à l'anesthésie générale. L'objectif du travail présenté dans cette vidéo est d'examiner l'effet d'une préconditionnement au froid sur la signalisation immunitaire neuronale chez le rat, afin d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques permettant de protéger le cerveau avant l'apparition d'une lésion. Ceci est réalisé en produisant des cultures de tranches d'hippocampe de rats adultes saines et à longue survie.Les cultures sont exposées à un préconditionnement au froid afin d'induire une neuroprotection d'origine immunitaire. Ensuite, la toxine anci est ajoutée et les cultures de tranches sont observées en imagerie. L'analyse des images suggère que le préconditionnement au froid entraîne une réduction marquée du niveau de perte neuronale sélective.Je m'appelle Richard Craig, et voici Heidi Mitchell. Nous travaillons à l'Université de Chicago, au sein du Département de neurologie, et aujourd'hui nous allons vous expliquer comment la préparation de cultures de tranches peut être utilisée pour répondre à des questions concernant la neuroprotection, notamment par le biais de signaux immunitaires pro-inflammatoires à faible intensité, afin de renforcer le cerveau contre les maladies cérébrales. De manière générale, les personnes novices dans cette technique éprouvent des difficultés en raison de la nécessité de garantir la viabilité à long terme et la santé des cultures, qui doivent être capables de présenter une signalisation pro-inflammatoire à faible niveau.Heidi va maintenant vous montrer un certain nombre de procédures que nous utilisons en laboratoire pour surmonter ces obstacles, afin de mesurer une faible activation de la signalisation pro-inflammatoire comme moyen de développer des neuroprotecteurs pour le cerveau. Les expériences suivantes doivent être réalisées en portant une blouse de laboratoire propre et des gants stériles recouvrant entièrement les manches de la blouse. Commencez par placer tous les éléments nécessaires à la procédure dans une hotte de sécurité biologique de niveau 1, y compris un hachoir McIlwain pour tissus, des inserts en téflon, une lame de rasoir, des instruments chirurgicaux et des boîtes de Pétri pour dissection.La hotte doit être installée dans une salle de culture à pression positive équipée d'un filtre HIPAA, l'air étant purifié par des ventilateurs autonome de nettoyage de l'air à lumière ultraviolette au moins 30 minutes avant le début des expériences. Placer une plaque froide de dissection dans la hotte et la relier à un bain-marie à proximité dans la hotte de culture cellulaire. Insérer une chambre de culture MilliCell dans chaque puits d'une plaque de six puits, puis ajouter 1,1 millilitre de milieu de culture dans chacun.Placer la plaque dans une étuve à 36 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone et 95 % d'humidité pendant au moins 20 minutes. Garder les ratons au chaud jusqu'à ce qu'ils soient nécessaires en les plaçant sous une lampe chauffante. Anesthésier le raton en le plaçant dans du dioxyde de carbone à 100 %. Une fois anesthésié, plonger le raton dans de l'éthanol à 100 %, puis le décapiter et placer le corps dans une boîte de Pétri de 100 millimètres et la tête dans une autre.Ensuite, utilisez des ciseaux courbes pour iris pour ouvrir le crâne par une incision médiane suivie de deux coupes latérales à gauche et à droite, derrière les yeux. Utilisez une pince angulée pour écarter le crâne recouvrant le cerveau et une spatule pour commencer à extraire le cerveau. Retirez le cerveau en sectionnant les nerfs trijumeaux à l’aide de la spatule, puis placez-le dans la moitié inférieure d’une boîte de Pétri de 60 millimètres contenant 10 millilitres de solution saline tamponnée stérile froide enrichie en glucose.Ensuite, utilisez la pince n°5 IOx sous une spatule à iridectomie n°2 pour disséquer les hippo campi de chaque hémisphère et les placer sur un disque en téflon destiné au hachoir de McIlwain. À l’aide de la spatule, écartez le milieu de la préparation tissulaire à l’aide du hachoir réglé sur une épaisseur de section comprise entre 350 et 400 micromètres. Sectionnez les hippo campi perpendiculairement à leur axe longitudinal avec un hachoir de un millilitre effectué rapidement.Lavez les tranches fraîchement coupées hors des inserts en téflon et déposez-les dans la moitié supérieure d'une boîte de Pétri de 60 millimètres contenant du BSS froid. Placez les tranches sous un microscope stéréo et examinez-les. Identifiez les tranches présentant un gyrus denté intact et une couche cellulaire paramédiale.Placez ensuite délicatement les trois tranches les plus grandes sur une membrane, en préparant un total de 12 tranches par prélèvement. Placez les membranes dans un plateau à six compartiments et incubez à 36 degrés Celsius, en renouvelant le milieu de croissance tous les trois à quatre jours. Renouvelez le milieu de croissance en remplaçant l'ancien milieu par du milieu frais et tiède.Remettez les cellules dans l’incubateur à 36 degrés après sept jours. Remplacez le milieu par 1,1 millilitre de milieu neurobasal sans sérum et supplémenté. Au jour 18, examinez la vitalité des cultures de tranches.Commencez par placer 1,1 millilitre d'ox poel dans des boîtes de culture à six puits. Placez la boîte dans l'incubateur afin de la réchauffer à 36 degrés Celsius. Pendant ce temps, allumez une source de lumière fluorescente équipée d'un filtre fitzy pour le microscope et laissez-la chauffer pendant au moins 20 minutes.Cela permettra d'assurer une intensité lumineuse uniforme. Ensuite, utilisez une pince pour placer les inserts de culture de tranches dans un milieu inox pendant 10 minutes. Puis, transférez-les à nouveau dans le milieu exempt de SIM.Placer l'insert de culture sur la platine du microscope et marquer l'orientation afin de détecter de manière irréversible une lésion d'une couche paramétrale. Placer les cultures sur une surface aseptique d'un microscope inversé sous un grossissement de cinq fois, les tranches étant maintenues dans une orientation similaire à celle utilisée lors du préscreening.Passer au cube d'émission de citation FIT CX. Sélectionner les cultures présentant moins de 30 cellules positives à cytx dans la région ca une pour le préconditionnement au froid. Placer 1,1 millilitre de milieu sans sérum dans une boîte de culture à six puits et mettre la boîte dans un incubateur à 30 degrés avec 5 % de dioxyde de carbone et 95 % d'humidité pendant au moins 20 minutes afin d'équilibrer le milieu une fois les 20 minutes écoulées.Retirer le milieu d'équilibre de l'incubateur. Transférer les inserts de culture avec les tranches du milieu sans sérum normal vers le milieu à 30 degrés. Puis les placer dans l'incubateur à 30 degrés pendant 90 minutes après l'incubation.Replacer les cultures de tranches dans le milieu normal sans sérum et incuber à 36 degrés pendant 24 heures. Commencer le préscreening pour l'utilisation expérimentale des cultures de tranches en transférant les inserts de culture dans le milieu cyt pendant 20 minutes. Pendant que les tranches incubent, allumer la lampe ultraviolette et la caméra CCD et les laisser chauffer pendant 20 minutes.Si nécessaire, utilisez le logiciel pour effacer le CCD en l'exposant à la lumière pendant 50 cycles. Ensuite, déposez une solution contenant 10 microlitres de fluorescéine dans 90 microlitres de PBS sur un cytomètre hématologique de profondeur 100 micromètres et placez-le sur la platine du microscope. À l'aide du logiciel, réglez le temps d'exposition de manière à ce que la plage dynamique soit de 1000 sur 4 096.Placez ensuite la boîte contenant les cultures de tranches préconditionnées au froid sur le microscope et acquérez des images. Celles-ci serviront à déterminer le niveau de fluorescence de fond, qui sera soustrait de la fluorescence émise par les tranches lésées. Si le préconditionnement au froid induit lui-même une lésion, des cellules présentant une fluorescence accrue seront observées par la suite.Pour examiner l'effet d'une lésion par exotoxine, transférez les inserts dans un milieu sans sérum contenant de 20 à 50 micromolaire de MDA préalablement équilibré à 36 degrés Celsius pendant au moins 20 minutes. Incubez pendant 60 minutes à 36 degrés Celsius ; après l'incubation, le NMDA imite les effets du neurotransmetteur glutamate. Rincez le NMDA des inserts en plongeant chaque insert trois fois dans trois boîtes de 60 millimètres distinctes.Chaque compartiment contenant 10 millilitres de milieu neurobasal préchauffé à 36 degrés Celsius. N'utilisez pas plus de trois inserts pour chaque boîte de culture de 360 millimètres. Après le lavage, placez les inserts dans un plateau contenant du milieu frais et remettez-les dans l'incubateur à 36 degrés.Après 24 heures, étalonner la caméra à l’aide d’un étalon de fluorescéine comme précédemment. Ensuite, placer les cultures dans du milieu OX pendant 20 minutes avant les acquisitions d’images. Si les niveaux de lésion sont faibles un jour après la lésion, prolonger l’expérience de deux à trois jours selon les besoins afin de quantifier la lésion à l’aide du logiciel metamorph.Définissez une zone d’intérêt autour de la région CA1 pour mesurer l’intensité d’une région sélectionnée en cas de lésion. Copiez et collez la zone d’intérêt de la lésion vers l’image de fond. Ensuite, saisissez les valeurs provenant de la lésion et du fond dans Excel à l’aide d’un logiciel statistique.Quantifiez le numérateur moins le fond pour les cultures témoins et celles préconditionnées au froid, puis effectuez le test statistique approprié pour comparer les lésions dans le groupe expérimental par rapport au groupe témoin, qui doit toujours être inclus dans chaque série expérimentale. Cette image montre une coloration typique d'une culture de tranches hippocampiques matures après 21 jours de culture in vitro. L'étiquetage terminal nouveau, représenté en vert, est utilisé pour illustrer l'architecture cyto de certains neurones principaux.Les neurones paramédians sont visibles dans les régions CA1 et CA3 de l'hippocampe, et les neurones du gyrus dentelé ou DG apparaissent à gauche ici. La région CA1, montrée à un grossissement plus élevé, illustre l'aspect ramifié des microglies quiescentes. Dans des cultures de tranches matures, les cellules ont été marquées avec le marqueur de surface des microglies CD11b. Cette figure montre les effets d'une préconditionnement au froid, de la neuroprotection et des cultures de tranches hippocampiques incubées avec le marqueur Cytx vert pour les cellules mortes.Les images de présélection à gauche montrent l'absence de lésion ca une ici. Les cultures témoins « sham » sont présentées en haut, et les cultures préconditionnées au froid sont présentées en bas. Les images de la rangée du milieu montrent la lésion relative des cultures de tranches 24 heures après exposition à 20 micromolaire de NMDA.Remarquez que la lésion du témoin « sham » est supérieure à celle des cultures exposées à la préconditionnement au froid, étiqueté cp. L'échelle de calibration des couleurs de lésion relative est indiquée dans l'image en haut à gauche. Traditionnellement, les cultures sont ensuite exposées à un niveau maximal de lésion, tel que 20 micromolaire et MDA toute une nuit, afin de maximiser les niveaux de lésion neuronale CA un et la lésion relative du préconditionnement au froid par rapport au témoin « sham », exprimée comme un rapport de la lésion sur la lésion maximale.Cependant, l'exposition à des stimuli lésionnels maximaux peut ne pas suffire à surmonter la neuroprotection induite par un conditionnement préalable. Par conséquent, l'utilisation de rapports entre la lésion et la lésion maximale pourrait ne pas refléter avec précision la neuroprotection conférée par le conditionnement préalable. Cela est évident sur les images de droite, qui montrent que les niveaux maximaux après un conditionnement à froid sont inférieurs à ceux des témoins faux opérés.Dans cette étude, on a constaté que l'utilisation des rapports entre lésion et lésion maximale pouvait masquer la neuroprotection conférée par la préconditionnement au froid. On peut observer cela sur le schéma où la lésion témoin est indiquée en rouge et celle survenant après préconditionnement au froid en bleu, un jour après l'exposition au NMDA : après préconditionnement au froid, le niveau de lésion a été déterminé à trois, contre un niveau cinq observé dans le témoin. Ceci est compatible avec une neuroprotection de 40 %.Cependant, si un format traditionnel utilisant des rapports tels que lésion par rapport à la lésion maximale est utilisé, aucune protection n'est évidente. En d'autres termes, 50 % pour le groupe témoin versus 50 % pour la préconditionnement au froid. Une PCR quantitative a été réalisée en utilisant des échantillons d'ARNm comme indiqué ici.Les niveaux de TNF alpha après préconditionnement au froid, représentés par la ligne bleue, étaient plus élevés que ceux des témoins, représentés par les lignes verte, jaune et violette. Cela suggère que le préconditionnement au froid déclenche une production accrue de TNF alpha dans le cerveau ; afin de confirmer les résultats de la PCR quantitative et du tableau de PCR quantitative, une coloration immunohistochimique a été réalisée. Cette culture de tranches a été traitée pour l'interleukine 11, montrée en rouge, et une nouvelle extrémité permet de visualiser les neurones, montrés en vert.Remarquez que certains neurones paramétaux, indiqués par les flèches, présentent une coloration pour l'interleukine 11 et un nouveau marquage end, et apparaissent en jaune. Les flèches indiquent quelques cellules plus petites, supposées être des astrocytes, qui ne montrent qu'une augmentation de la coloration pour l'interleukine 11. Lors de la délimitation du système de signalisation des cytokines impliqué dans la neuroprotection par préconditionnement au froid, il est important de noter quelques concepts fondamentaux.Bien que les cytokines soient présentes à des concentrations extrêmement faibles dans le cerveau normal, de légers changements de concentration en cytokines modifient l'expression des gènes. Ainsi, même à de faibles concentrations, les cytokines ont un potentiel considérable à modifier la structure et la fonction cérébrales, et par conséquent le phénotype d'un organisme. Ce concept est illustré ici par l'inverse de la distance, en partant d'un poil de moustache de chat comme point de référence, et en comparant le sodium, le potassium, le pH et le calcium au TNF alpha.Il est également important de garder à l'esprit que les cytokines sont fortement redondantes et pluritropes : plusieurs cytokines peuvent avoir des effets similaires, et une seule cytokine peut exercer des effets variables. Ainsi, pour déterminer avec précision la base innée des cytokines dans la neuroprotection induite par la préconditionnement au froid, une analyse composite de variables de signalisation connexes doit être réalisée. Ceci est accompli par des stratégies de dosage multiplexe, qui permettront d'établir la signature cytokinique de la neuroprotection par préconditionnement au froid. Une fois maîtrisées, ces cultures peuvent être préparées en environ trois heures, ainsi que les manipulations destinées à leur étude.La réponse au conditionnement à froid peut être évaluée sur une période d'environ trois jours tout en réalisant ces procédures. Il est essentiel de se rappeler que des techniques stériles et une manipulation minimale sont nécessaires pour préserver la capacité de détecter des signaux pro-inflammatoires de faible intensité après ces procédures. D'autres méthodes, telles que les analyses protéomiques et biologiques moléculaires, peuvent être appliquées aux cultures afin de comprendre les mécanismes par lesquels le conditionnement à froid exerce son effet nutritif et protecteur sur le cerveau.

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Occlusion bilatérale de l&#39;artère carotide commune comme un stimulus suffisant pour provoquer le préconditionnement précoce Tolérance ischémique à une ischémie cérébrale focale

Source : Zheng, Y., et al. Modèles expérimentaux pour étudier la neuroprotection du post-conditionnement acide contre l’ischémie cérébrale. J. Vis. Exp. (2017)Cette vidéo démontre l’application du postconditionnement acide (APC) pour évaluer ses effets neuroprotecteurs contre les lésions ischémiques dans un modèle murin d’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (MCAO). Il décrit les étapes impliquées dans la reperfusion dans le modèle MCAO et l’application de l’APC pendant la reperfusion pour...

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Source : Poinsatte, K., et al., Quantification de la protection neurovasculaire à la suite d’un préconditionnement hypoxique répétitif et d’une occlusion transitoire de l’artère cérébrale moyenne chez la souris. J. Vis. Exp. (2015)Cette vidéo montre la méthode de préconditionnement hypoxique répétitif (RHP) en exposant une souris à des cycles d’hypoxie contrôlés avant d’induire un AVC ischémique. L’expérience évalue ses effets sur la stabilité de la barrière hémato-encéphalique, l’adaptation...

Adaptation neuronale au préconditionnement hypoxique répétitif chez la souris

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Préconditionnement ischémique non invasif d’un membre dans un modèle de rat pour la neuroprotection

Préconditionnement ischémique à distance (RIP) est une méthode de tissus de conditionnement contre le stress dommageable. Nous avons établi une méthode d'ischémie à distance à la patte postérieure, en gonflant un brassard de tensiomètre pendant 5-10 min. Les capacités neuroprotecteurs de RIP a été démontré dans un modèle de dégénérescence rétinienne chez les rongeurs.

Limb distance ischémique préconditionnement: Une technique neuroprotecteur chez les rongeurs

Ce protocole décrit un préconditionnement hypoxique répétitif, ou de brèves expositions à une hypoxie systémique qui réduisent les volumes d’infarctus et la perturbation de la barrière hémato-encéphalique suite à une occlusion transitoire de l’artère cérébrale moyenne chez la souris. Il détaille également la double quantification du volume de l’infarctus et de la perturbation de la barrière hémato-encéphalique après un AVC afin d’évaluer l’efficacité de la protection neurovasculaire.

Quantification de la protection neurovasculaire Après répétitive hypoxique préconditionnement et transitoire Moyen Cerebral Artery Occlusion chez la souris

occlusion chirurgicale d'une branche distale de l'artère cérébrale moyenne (MCAo) est un modèle fréquemment utilisé dans la recherche de course expérimentale. Ce manuscrit décrit la technique de base de MCAo permanente, combinée à l'insertion d'une fenêtre crânienne latérale, ce qui offre la possibilité pour la microscopie intravitale longitudinale chez la souris.

Préparation Fenêtre latérale chronique Cranial Active In Vivo Observation Suite Distal cérébrale moyenne Artère Occlusion chez la souris

Le postconditionnement acide protège contre l'ischémie cérébrale. Nous présentons ici deux modèles pour exécuter APC. Ils sont obtenus respectivement en transférant des tranches corticostriatales à un tampon acide après une privation d'oxygène-glucose in vitro et en inhalant 20% de CO 2 après l'occlusion de l'artère cérébrale moyenne in vivo .

Modèles expérimentaux pour étudier la neuroprotection du postconditionnement acide contre l&#39;ischémie cérébrale

Locomotion complexe en milieux naturalistes nécessitant une étroite coordination des membres concerne les régions du cortex pariétal. Le protocole suivant décrit l’utilisation de réversible désactivation par refroidissement à démontrer le rôle de région pariétale 5 en évitement d’obstacles guidée par mémoire chez le chat marche.

Réversible par refroidissement désactivations pour étudier les Contributions corticales à Obstacle mémoire chez le chat marche

Les effets distincts des différents degrés d’hypothermie sur la protection myocardique n’ont pas été soigneusement évalués. L’objectif de la présente étude était de quantifier les niveaux de mort cellulaire à la suite de différents traitements d’hypothermie dans un modèle humain à base de cardiomyocytes, jetant les bases d’une recherche moléculaire approfondie future.

Évaluation in vitro de la protection myocardique après hypothermie-préconditionnement dans un modèle de myocytes cardiaques humains

Cet article décrit deux méthodes d’induction de l’hypothermie de courte durée du corps entier chez le rat. La première méthode d’induction rapide utilise un refroidissement actif à l’aide de ventilateurs et de pulvérisation d’éthanol pour une diminution rapide de la température. La deuxième méthode est une méthode de refroidissement progressif. Ceci est réalisé en utilisant la combinaison de l’anesthésie à l’isoflurane et de la réduction des réglages de température sur le tapis chauffant...

Induction d’hypothermie de courte durée chez le rat à l’aide de modèles pour des études examinant la pertinence clinique et les mécanismes

Découvrez les mécanismes de neuroprotection par préconditionnement froid dans des cultures de tranches d'hippocampe de rat. Cette méthode permet d'étudier la signalisation immunitaire neuronale impliquant le TNF-α et l'interleukine 11.

Stratégies pour l'étude de neuroprotection du froid préconditionnement

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