Microscopie confocale cornéenne: A Novel technique non invasive pour quantifier Fibre petites pathologie dans les neuropathies périphériques

Ce vidéo montre une procédure d'imagerie des fibres C cornéennes à l'aide de la technique non invasive de microscopie confocale cornéenne, ou CCM, permettant la quantification des lésions des fibres nerveuses. Tout d'abord, le plan focal de l'objectif sur la CCM est ajusté et un gel visqueux pour les yeux est appliqué sur l'objectif avant de fixer le capuchon jetable. Ensuite, des gouttes anesthésiques et du gel visqueux pour les yeux sont appliqués sur l'œil.

Ensuite, on règle la caméra afin d’établir un contact entre le gel situé à l’avant de l’objectif et la cornée du patient. Enfin, on ajuste la profondeur du plan de mise au point et on capture des images des nerfs cornéens provenant de la partie centrale de la couche de Bowman. Des modifications morphologiques des fibres nerveuses cornéennes peuvent être observées afin de quantifier la neuropathie.

Il s'agit d'une technique très novatrice qui a en réalité déjà été utilisée dans le domaine de l'optométrie et de l'ophtalmologie, mais au cours des huit dernières années environ, nous l'avons employée de manière très efficace pour étudier et évaluer la neuropathie diabétique ainsi que d'autres neuropathies périphériques. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet de quantifier les lésions des fibres nerveuses fines à un stade très précoce, puis de stratifier la gravité de la neuropathie chez les patients de façon entièrement non invasive. Nous pouvons réaliser cela très rapidement grâce à un balayage de deux minutes, qui peut ensuite être quantifié en fonction de la sévérité de la neuropathie. Nous espérons ainsi remplacer certaines autres méthodes beaucoup plus invasives, telles que la biopsie cutanée ou la biopsie nerveuse. Bien qu'elle paraisse globalement simple, cette technique requiert en réalité des étapes bien définies pour capturer l'image de manière optimale, puis pour quantifier l'image.

Et nous souhaitons vraiment rendre tout ce processus clair et évident pour toute autre personne souhaitant utiliser cette technique. La première étape de l'examen à l'aide du microscope confocal cornéen HRT consiste à préparer l'extrémité de l'objectif au niveau du tube de l'objectif de la caméra à balayage laser. Régler la réfraction à +12 dioptries, puis ajuster la caméra à la position la plus basse et bloquer l'objectif en le tournant dans le sens antihoraire.

Appliquez une goutte de taille P, homogène et sans bulle, de visco tears sur l'extrémité de la lentille. Retirez un capuchon tomo de son récipient stérile et fixez-le au-dessus de l'extrémité de la lentille aussi loin que possible sur le support, de sorte que le gel forme un ménisque entre la lentille objective et le capuchon. Veillez à ne pas toucher la surface avant du capuchon tomo lors du montage.

Maintenant, déplacez la caméra de balayage laser aussi loin que possible vers l'arrière sur le support de caméra, de manière à visualiser la surface intérieure et extérieure du bouchon tomographique. Ces deux surfaces apparaissent sous forme de reflets laser brillants sur l'écran du moniteur. Réglez la molette d'ajustement du plan focal jusqu'à l'observation d'un reflet brillant, indiquant que l'objectif est focalisé à l'avant du bouchon.

La valeur de profondeur indiquée sur l'affichage de la position de mise au point doit maintenant se situer entre moins 150 micromètres et plus 150 micromètres. Réinitialisez le réglage de profondeur à zéro. Voyons maintenant comment préparer le patient.

Après avoir anesthésié les yeux du sujet avec une goutte de chlorhydrate d'oxybuprocaine à 0,4 %, lubrifiez la partie antérieure de l'œil avec des larmes artificielles. Placez le sujet confortablement, le menton sur l'appui-menton, en veillant à ce que son front soit fermement appuyé contre la barre frontale. L'examen est facilité en demandant au patient de fixer la lumière de fixation externe.

Avec l'œil non examiné, la taille compacte de la tête du microscope garantit que l'œil controlatéral du sujet n'est pas obstrué, permettant ainsi l'utilisation de cibles éloignées. Positionner la caméra CCD de sorte que son accès optique soit perpendiculaire à l'accès optique de la caméra de balayage laser.

La caméra doit être du côté droit du patient lors de l'imagerie de l'œil droit, et vice versa. Dans cette position, la surface antérieure du tomo cap apparaît au centre de la caméra CCD. Image en direct.

Déplacez la caméra de balayage laser vers le patient jusqu'à ce que la cornée du patient se trouve à une distance d'environ cinq à dix millimètres du tomo cap. Ensuite, utilisez les boutons de réglage vertical et horizontal sur le support de la caméra pour déplacer la caméra de balayage laser vers le haut et le bas, et vers la gauche et la droite, jusqu'à ce que le tomo cap soit positionné au centre de la cornée du patient. Demandez maintenant au patient d'ouvrir les yeux aussi grand que possible.

Déplacez lentement la caméra de balayage laser vers le patient jusqu'à ce que le capuchon tomographique entre en contact avec la cornée du patient. À ce stade, vérifiez que la lumière laser rouge est centrée sur la cornée et que le reflet du faisceau laser provenant de la cornée se produit exactement au pôle antérieur de la cornée. Le contact entre la lentille et la cornée est minimal lorsque le réglage est optimal.

Un fin pont de gel entre le capuchon tomographique et la cornée est visible sur l'image en direct de la caméra CCD. S'il y a une pression excessive entre le capuchon tomographique et la cornée, la cornée présente un aspect aplati sur l'image de la caméra CCD. L'image en direct et le strayer apparaissent sur l'image de la CCM.

Après avoir positionné le patient, activez la caméra laser HR trois, puis la fenêtre d'acquisition d'image apparaîtra à l'écran. Utilisez l'image CCD pour positionner le capot tomo et le faisceau laser sur la cornée du patient. Le CCM offre trois options pour la capture d'images.

L'analyse de séquence permet d'acquérir jusqu'à 100 images avec une fréquence d'images réglable. Une fréquence d'images comprise entre 30 et 1 image par seconde est sélectionnée. Et en fonction de cela, une vidéo peut être acquise avec une durée comprise entre trois et 100 secondes.

Dans le mode de balayage volumique, la caméra acquiert automatiquement une série de 40 images provenant de plans focaux consécutifs. Une profondeur totale de 85 micromètres peut être balayée, et la distance focale entre deux images consécutives est d'environ 2,1 micromètre. La dernière option est le mode section, qui sera utilisé pour cette expérience.

Ce mode permet une imagerie optimale avec des images uniques nettes acquises et stockées à chaque pression sur la pédale. Ce mode est utilisé pour capturer des images de l'ensemble de la couche cornéenne, y compris la couche de Bowman au centre de la cornée. Après avoir capturé un nombre suffisant d'images, d'autres modes peuvent être utilisés, notamment le mode séquence et le mode volume.

Après quelques balayages, le plan focal de l'objectif peut être modifié afin de mesurer la profondeur d'une couche cellulaire cornéenne par rapport à la surface cornéenne, en mettant la couche cellulaire épithéliale au point, puis en cliquant sur le bouton de réinitialisation pour régler la valeur de profondeur à zéro. Une fois l'examen terminé, éteignez la caméra en cliquant sur le bouton d'alimentation de la caméra dans la fenêtre d'acquisition. Informez le patient qu'il ne doit pas se frotter les yeux jusqu'à ce que l'anesthésie locale se soit dissipée.

Retirez le capuchon du capteur de la caméra, jetez-le, puis nettoyez l’objectif du microscope avec un coton-tige humidifié à l’eau distillée. Voyons maintenant comment analyser une image et quantifier les paramètres des fibres nerveuses afin de revoir et d’analyser des examens existants. Tout d’abord, sélectionnez le dossier du patient approprié dans la fenêtre de la base de données.

La fenêtre de visualisation des images fournit un aperçu des examens de la cornée déjà réalisés pour le patient sélectionné. Les examens effectués à des dates différentes sont stockés dans des onglets de visite distincts. Les trois types de balayage différents sont représentés par trois icônes différentes. Dans l'onglet de visite cornéenne HRT trois du module de visualisation des images de l'Heidelberg Eye Explorer.

Pour examiner l'image de la cornée, double-cliquez sur l'icône d'image appropriée, puis appuyez sur afficher maintenant pour exporter les images appropriées en vue d'une analyse ultérieure. Cliquez sur exporter dans la barre d'outils, puis sélectionnez le dossier dans lequel enregistrer les images. Étant donné que l'objectif principal de cette recherche porte sur la couche de Bowman et les nerfs cornéens, seules les images de cette couche seront analysées. Cinq à six images de la couche de Bowman sont sélectionnées pour chaque sujet à différentes profondeurs de la cornée.

L'analyse d'image est réalisée à l'aide d'un logiciel spécialisé développé par notre équipe, appelé CCM Image Analysis Tools, version 0.64. Les principaux paramètres des nerfs cornéens sont mesurés avec le logiciel : la densité des fibres nerveuses, définie comme le nombre de nerfs principaux par image. La densité des branches nerveuses correspond au nombre total de branches principales par image.

La longueur des fibres nerveuses correspond à la longueur totale des nerfs principaux et de leurs branches principales par image de fibre nerveuse. La tortuosité est la tortuosité des nerfs principaux par image. Pour ouvrir une image CCM, allez dans le fichier puis ouvrez.

Une fois l'image chargée, sa taille et son type s'affichent dans la zone d'information sur l'image située en haut à gauche du panneau de contrôle, et l'échelle par défaut s'affiche dans la ligne d'édition de l'information sur l'image. Si l'échelle est différente, modifiez le nombre dans la ligne d'édition. Pour commencer à analyser l'image, sélectionnez le paramètre que vous souhaitez mesurer dans la zone de métriques située en haut à droite du panneau de contrôle.

Dans la zone de résultats située en bas de la page, les valeurs NFD et MBD sont présentées sous forme de nombres réels. La NFL est exprimée en millimètres et la tortuosité sous la forme d'un coefficient de tortuosité. Les résultats peuvent être exportés vers une feuille Excel.

Lorsque vous ouvrez la page Excel, les résultats seront présentés en nombre par millimètre carré pour la DFN et en millimètres par millimètre carré pour la LFN, ainsi qu'en coefficient de tortuosité pour la TDF. Pour effectuer ces mesures, commencez par marquer chaque nerf principal, puis marquez chaque branche du nerf principal. Enfin, tracez chaque nerf dans le cadre.

Un stylet numérique peut être utilisé pour une meilleure précision. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une minute si elle est effectuée correctement lors de la tentative de cette procédure. Il est important de suivre attentivement les instructions détaillées.

Après avoir visionné cette vidéo, nous espérons que vous avez acquis une bonne compréhension de la manière de travailler et de capturer des images de la couche des fibres nerveuses en mouvement de la cornée à l’aide de la microscopie confocale cornéenne, ainsi que de quantifier et d’analyser les images provenant de cette couche chez les patients atteints de neuropathie périphérique, en particulier de neuropathie diabétique. Et n’oubliez pas que le travail avec la MCC nécessite une expertise, et il a été recommandé que les professionnels formés à l’examen ophtalmologique effectuent cette procédure.