Name: Microscopie confocale cornéenne: A Novel technique non invasive pour quantifier Fibre petites pathologie dans les neuropathies périphériques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-03T17:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Découvrez la microscopie confocale cornéenne pour quantifier les lésions des fibres nerveuses dans les neuropathies périphériques. Cette technique non invasive permet d'évaluer la sévérité neuropathique rapidement.

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Ce travail a été soutenu par la Juvenile Diabetes Research Foundation International (subvention 17-2008-1031) et les National Institutes of Health (subvention 1R01DK077903-01A1).

Introduction: La quantification précise de la neuropathie périphérique est important de définir les patients à risque, d'anticiper la dégradation, et d'évaluer de nouvelles thérapies. Les méthodes conventionnelles d'évaluer les déficits neurologiques et l'électrophysiologie et de tests sensoriels quantitatifs quantifie altérations fonctionnelles pour détecter la neuropathie. Cependant, les premiers dégâts semble être de petites fibres et pourtant ces tests avant d'évaluer le dysfonctionnement des fibres grandes et ont une capacité limitée pour démontrer la régénération et la réparation. Les seules techniques qui permettent un examen direct des lésions nerveuses amyéliniques de fibres et de réparation sont une biopsie du nerf sural avec la microscopie électronique et de la peau-biopsie. Toutefois, les deux sont des procédures invasives et nécessitent de longues procédures de laboratoire et l'expertise considérable. Cornée microscopie confocale est une technique non invasive qui permet cliniques en imagerie in vivo des fibres nerveuses cornéennes. HRT III-Rostock module cornéen (MRC) Manuel de l'opération 1. Préparation de la caméra L'étape initiale de l'examen en utilisant THS est la préparation de la pointe objectif. <ol><li> D'abord au niveau du tube objectif de la caméra à balayage laser, réglez la réfraction de 12 dioptries et ensuite ajuster la caméra à la position la plus basse. </li><li> Appliquez une grande homogénéité, sans bulle, chute de petit pois, des Viscotears sur le bout de l'objectif. </li><li> Supprimer un TomoCap de son récipient stérile et montez sur la pointe optique tel que le gel se forme un ménisque entre l'objectif et le bouchon. Poussez aussi loin que possible sur le support. Soyez prudent de ne pas toucher la surface avant du TomoCap lors du montage. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Préparation de la pointe objectif (en haut) en appliquant un gel viscotear (en bas) Application de la TomoCap. </li><li> Déplacez la caméra à balayage laser aussi loin que possible vers l'arrière sur le support de caméra. </li><li> La surface intérieure et extérieure de la TomoCap apparaissent tous deux comme un reflet laser brillant. La roue plan focal ajustement devrait être ajustée jusqu'à un reflet lumineux est observée, indiquant que la lentille est centrée dans le devant de la casquette. La valeur de la profondeur affichée à l'écran la position accent doit désormais être comprise entre -150 et +150 um um. </li><li> Réinitialiser le réglage de la profondeur à zéro. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Réglage du plan focal. </li></ol> 2. Préparation du patient Les yeux du sujet sont anesthésiés en utilisant une goutte de chlorhydrate benoxinate 0,4%, et Viscotears est utilisé sur le devant de l'œil pour la lubrification. Le sujet est assis confortablement, avec le menton sur la mentonnière et a demandé à la presse leur front fermement contre la barre le front. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Préparation du patient 3. Alignement de la caméra Il rend l'examen plus facile si vous demandez au patient de fixer sur la lumière de fixation externe avec l'œil non examiné. La taille compacte de la tête de microscope signifie que l'oeil controlatéral sujet n'est pas obscurci, permettant l'utilisation de cibles à distance. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. Lentilles Objectif du module cornéen. <ol><li> Position de la caméra CCD de telle sorte que son axe optique est perpendiculaire à l'axe optique de la caméra à balayage laser. La caméra doit être sur le côté droit du patient lorsque l'imagerie de l'oeil droit et vice versa. À cette position, vous devriez voir la surface avant de la TomoCap dans le centre de l'image CCD de caméra en direct. </li><li> Déplacez la caméra à balayage laser vers le patient jusqu'à ce que la cornée du patient est à une distance d'environ 5 à 10 mm de la TomoCap, puis déplacer la caméra à balayage laser haut / bas et gauche / droite en utilisant les boutons noirs sur la monture de la caméra jusqu'à ce que le TomoCap est positionné au centre de la cornée du patient. A ce stade, vous pouvez vérifier que la lumière laser rouge est au centre de la cornée et de réglage fin, observer la réflexion du faisceau laser de la cornée, ce qui est visible dans l'image de la caméra CCD. Cette réflexion doit se faire exactement au pôle antérieur de la cornée. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig5.jpg" alt="Figure 5" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 5"> Figure 5. Alignement du faisceau laser sur le pôle antérieur de la cornée pour capturer des images centrale cornée. </li><li> Demandez au patient d'ouvrir l'oeil de son / sa aussi large que possible. Déplacez la caméra à balayage laser lentement en avant vers le patient jusqu'à ce que les contacts TomoCap du patient cornée. S'il est nécessairepour corriger la position de la caméra à balayage laser, puis déplacez la caméra loin de la première patiente, ne la correction, puis déplacez-le vers l'avant à nouveau contact avec la cornée. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig6.jpg" alt="Figure 6" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 6"> Figure 6. Démonstration du pont gel mince entre le TomoCap et la cornée. </li><li> Contact minimal entre la caméra et la cornée est suffisante. Dans un ajustement optimal, un pont entre le gel mince TomoCap et la cornée est visible sur l'image CCD de caméra en direct. </li></ol> Si vous appuyez sur la TomoCap ou déplacer la cornée trop près de la caméra alors vous verrez la pression sur la cornée avec un aspect aplati de la cornée par l'intermédiaire de l'image CCD de caméra en direct. Toujours dans les images obtenues une ligne indiquant la pression va apparaître, ne s'appliquent donc pas trop de pression à la cornée. Une fois le contact a été établi, ne pas déplacer la position de la headrestto éviter un glissement de la cornée sur le TomoCap. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig7.jpg" alt="Figure 7" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 7"> Figure 7 (à gauche) Apparition d'une straie raison de l'application d'une pression excessive sur la cornée par le TomoCap;. (À droite) Une image avec un aspect normal, sans excès de pression. 4. Examinant le patient Après le champ de vision a été sélectionné, le HRT III laser caméra est allumée et la fenêtre d'acquisition d'image apparaît sur l'écran. Utiliser l'image CCD à la position du TomoCap et de la lumière laser sur la cornée du patient. Examen en utilisant le mode sélectionné peut alors être engagée. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig8.jpg" alt="Figure 8" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 8"> Figure 8. Regarde un mode de sur le moniteur lors de l'acquisition d'images. Le mode d'acquisition Dans le mode de la section, une seule image est acquise et enregistrée chaque fois que vous appuyez sur le commutateur au pied. Nous utilisons ce mode pour capturer des images de la couche cornée entière, y compris la couche de Bowman dans le centre de la cornée. Et puis après la capture d'images en nombre suffisant, on peut essayer les autres modes, y compris la séquence et le volume. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig9.jpg" alt="Figure 9" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 9"> Figure 9. Affichage avec choix pour les différents modes d'acquisition d'image. Avec la numérisation de séquences, on peut acquérir une séquence de 100 images avec une cadence réglable. Vous pouvez choisir une cadence de 30 images et une image par seconde (fps) et basé sur ce mode, il vous permet d'acquérir un film d'une durée de 3 à 100 secondes. En mode de balayage du volume, la caméra acquiert automatiquement une série de 40 images à consécutives plans focaux. Une profondeur totale de 85 um peuvent être scannées avec le «FOV 400 um" lentille de champ et la distance focale entre deux images consécutives sera d'environ 2,1 um. Après quelques scans du plan focal de la lentille peut être modifiée pour mesurer la profondeur d'une couche de cellules de la cornée par rapport à la surface de la cornée en apportant la couche de cellules épithéliales dans le foyer et puis en cliquant sur le bouton Réinitialiser pour définir la valeur de la profondeur à 0. Pour les besoins de notre présente étude, on obtient des images de la cornée centrale à différentes profondeurs. C'est pourquoi nous ne déplacer la caméra à balayage laser autour de la cornée horizontalement ou verticalement, nous venons de passer d'avant en arrière et de capturer des images de toutes les profondeurs de la couche de Bowman au même point de cornée. La distance entre chaque image est d'environ 1 um; donc si la profondeur de Bowman est de 10 um, nous aurons 10 images. Cependant pour l'analyse finale, nous avons sélectionner les images à une distance d'environ 2-3 um entre eux. Après l'examen est terminé éteignez l'appareil photo en cliquant sur le bouton d'alimentation caméra dans la fenêtre d'acquisition. Faire le patient conscient qu'il ou elle ne doit pas se frotter les yeux de son jusqu'à ce que l'anesthésie locale a disparu. Par précaution, vous pouvez effectuer un examen à la lampe à fente de la cornée du patient après l'examen. Retirez le TomoCap de la caméra et jetez puis nettoyer la lentille de microscope avec un coton-tige imbibé d'eau distillée. 5. Analyse d'un examen a. Sélection des cadres Pour examiner et analyser les examens actuels, le dossier du patient approprié (s) doit être sélectionné dans la fenêtre base de données. La fenêtre de visualisation d'images donne un aperçu des examens cornée existants pour le patient sélectionné. Examens effectués à des jours différents sont stockés dans des onglets séparés visite. Les trois types de scan différents sont représentés par trois différentes icônes dans l'onglet HRT III visite cornée de la fenêtre de visualisation des images de l'Heidelberg Eye Explorer. Pour l'enquête de l'image cornée, double-cliquez sur l'icône image appropriée et le "Show" ouvre la fenêtre suivante: <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig10.jpg" alt="Figure 10" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 10"> Figure 10. Affichage de toutes les images capturées après examen. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig11.jpg" alt="Figure 11" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 11"> Figure 11. Affichage de l'image sélectionnée avant l'exportation avec une vue caméra CCD d'oeil pour montrer un alignement correct. Pour exporter les images appropriées pour une analyse ultérieure, cliquez sur "Exporter" sur la barre d'outils, puis sélectionnez le dossier dans lequel vous souhaitez enregistrer les images pour. Nous obtenons et capturer des images de toutes les couches de la cornée pour chaque patient, mais comme l'objectif principal de cette recherche est sur la couche de Bowman et les nerfs de la cornée, seules les images de cette couche sera analysée. Nous sélectionnons 5-6 cadres de la couche de Bowman pour chaque sujet à différentes profondeurs de la cornée. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig12.jpg" alt="Figure 12" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 12"> Figure 12. Affichage de toutes les couches de cornée à partir d'un sujet sain. En moyenne 5-6 cadres de la couche de Bowman dans le centre de la cornée à des profondeurs différentes sont sélectionnées au hasard pour des mesures quantitatives et d'analyse. b. L'analyse des images Pour analyser les images capturées par la couche de Bowman de la cornée centrale avec HRT III, nous utilisons un logiciel spécialisé qui a été développé au sein de notre groupe appelé «CCM Image Analysis Tools v 0.6". Quatre paramètres principaux pour les nerfs cornéens sont mesurées avec ce logiciel: <ul><li> La densité des fibres nerveuses (DNF) qui est défini comme le nombre de nerfs principaux / châssis. </li><li> Branche de la densité nerveuse (NBD) le nombre de branches principales / châssis. </li><li> Longueur des fibres nerveuses (NFL) qui est la longueur totale de tous les nerfs / châssis. </li><li> Tortuosité des fibres nerveuses (NFT) des principaux nerfs / châssis. </li></ul> Pour ouvrir l'image du CCM, allez sur le fichier&gt; ouvrir. <ul><li> Une fois que l'image est chargée, sa taille et son type est affiché dans la boîte d'information d'image sur le dessus main-côté gauche du panneau de configuration. </li><li> L'échelle par défaut est affichée dans la ligne d'édition de l'information image. Si l'échelle est différente, modifiez le nombre dans la ligne d'édition. </li><li> Pour commencer à analyser l'image, sélectionnez le paramètre que vous voulez mesurer à partir de la boîte métriques dans le haut à droite du panneau de contrôle. </li><li> Dans la boîte de résultat au bas de la page le nombre de DNF, NBD est présenté en nombre réel, la NFL en mm et la tortuosité comme un coefficient de tortuosité (TC). </li><li> Cependant, après l'exportation des résultats vers une feuille Excel, les résultats seront présentés en aucun / mm 2 pour DNF et de NBD et mm / mm 2 pour la NFL. </li><li> A cet effet, après avoir terminé les mesures de cliquer sur des mesures sur Ajouter, puis allez dans Fichier&gt; Enregistrer sous, puis ouvrez les résultats enregistrés avec Excel. </li></ul><img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig13.jpg" alt="Figure 13" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 13"> Figure 13. Affichage de l'image de nerfs de la cornée avec le traçage dans l'outil d'analyse en utilisant «l'outil d'analyse d'images CCM». 6. Les résultats représentatifs: Nous avons démontré une augmentation progressive de la dégénérescence des nerfs de la cornée avec une gravité croissante de la neuropathie diabétique 1 et les lésions nerveuses en début de diabète, qui précède la perte des fibres nerveuses intra-épidermique dans les biopsies cutanées 2 avec une stratification de la gravité neuropathique et de réparation suivants du pancréas greffe 3 chez les patients diabétiques. Nous avons également démontré des lésions nerveuses dans la neuropathie idiopathique petites fibres 4 et la maladie de Fabry 5. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig14.jpg" alt="Figure 14" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 14"> Figure 14. Cornée images de microscopie confocale au THS III de la couche cornée de la Bowman (a) sous réserve de contrôle par rapport à (b) des patients atteints de neuropathie et de lésions nerveuses graves.

<ol><li>Abbott, C. A., Kallinikos, P., Marshall, A., Finnigan, J., Morgan, P., Efron, N., Boulton, A. J. M., Malik, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+Confocal+Microscopy%3A+A+Novel+Non-invasive+Test+to+Diagnose+and+Assess+Progression+of+Human+Diabetic+Neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Corneal Confocal Microscopy: A Novel Non-invasive Test to Diagnose and Assess Progression of Human Diabetic Neuropathy.</a> Diabetes Care. 33, 1792-1797 (2010).</li>
<li>Quattrini, C., Tavakoli, M., Jeziorska, M., Kallinikos, P., Tesfaye, S., Marshall, A., Finnigan, J., Boulton, A. J. M., Efron, N., Malik, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surrogate+Markers+of+Small+Fiber+Damage+in+Human+Diabetic+Neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Surrogate Markers of Small Fiber Damage in Human Diabetic Neuropathy.</a> Diabetes. 56, 2148-2154 (2007).</li>
<li>Mehra, S., Tavakoli, M., Efron, N., Boulton, A. J. M., Augustine, T., Malik, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+Confocal+Microscopy+Detects+Early+Nerve+Regeneration+After+Pancreas+Transplantation+in+Patients+with+Type+1+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Corneal Confocal Microscopy Detects Early Nerve Regeneration After Pancreas Transplantation in Patients with Type 1 Diabetes.</a> Diabetes Care. 30, 2608-2612 (2007).</li>
<li>Tavakoli, M., Marshall, A., Pitceathly, R., Fadavi, H., Gow, D., Roberts, M. E., Efron, N., Boulton, A. J. M., Malik, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+confocal+microscopy%3A+A+novel+means+to+detect+nerve+fibre+damage+in+patients+with+impaired+glucose+tolerance+and+idiopathic+small+fibre+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Corneal confocal microscopy: A novel means to detect nerve fibre damage in patients with impaired glucose tolerance and idiopathic small fibre neuropathy.</a> Experimental Neurology. 223, 245-250 (2010).</li>
<li>Tavakoli, M., Marshall, A., Thompson, L., Kenny, M., Waldek, S., Efron, N., Malik, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+confocal+microscopy%3A+A+novel+technique+to+detect+small-fibre+neuropathy+in+patients+with+Fabry+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+%26+Nerve%22%5BJournal%5D)">Corneal confocal microscopy: A novel technique to detect small-fibre neuropathy in patients with Fabry disease.</a> Muscle & Nerve. 40, 976-984 (2009).</li>
</ol>

Les figures 4 - 6: Gracieuseté de Heidelberg Ingénierie

Microscopie confocale cornéenne (CCM) est une technique non invasive cliniques qui peuvent être utilisées pour détecter les lésions nerveuses au début et à quantifier petite fibre de pathologie dans les neuropathies périphériques incluant le diabète, la maladie de Fabry et idiopathique neuropathies petites fibres (ISFN). L&#39;impact immédiat clinique de cette technique représente un énorme bond en avant en termes de notre capacité à diagnostiquer, à suivre la progression et évaluer la réponse thérapeutique chez les pat...

<table><tbody><tr><td>Machine HRT III CCM - Module de cornée de Rostock</td><td></td><td></td><td>Heidelberg Engineering</td></tr><tr><td>Logiciel d'analyse d'images CCM v0.6</td><td></td><td></td><td>Université de Manchester</td></tr></tbody></table>

microscopie confocale cornéenne: a novel technique non invasive pour quantifier fibre petites pathologie dans les neuropathies périphériques

Corneal Confocal Microscopy: A Novel Non-invasive Technique to Quantify Small Fibre Pathology in Peripheral Neuropathies

La quantification précise de la neuropathie périphérique est important de définir les patients à risque, d&#39;anticiper la dégradation, et d&#39;évaluer de nouvelles thérapies. Les méthodes conventionnelles d&#39;évaluer les déficits neurologiques et l&#39;électrophysiologie et de tests sensoriels quantitatifs quantifie altérations fonctionnelles pour détecter la neuropathie. Cependant, les premiers dégâts semble être de petites fibres et pourtant ces tests avant d&#39;évaluer le dysfonctionnement des fibres grandes et ont une capacité limitée pour démontrer la régénération et la réparation. Les seules techniques qui permettent un examen direct des lésions nerveuses amyéliniques de fibres et de réparation sont une biopsie du nerf sural avec la microscopie électronique et de la peau-biopsie. Toutefois, les deux sont des procédures invasives et nécessitent de longues procédures de laboratoire et l&#39;expertise considérable. Cornée microscopie confocale est une technique non invasive qui permet cliniques en imagerie in vivo des fibres nerveuses cornéennes. Nous avons démontré au début des lésions nerveuses, qui précède la perte des fibres nerveuses intra-épidermique dans les biopsies cutanées avec une stratification de la gravité neuropathique et greffe de pancréas après réparation chez les patients diabétiques. Nous avons également démontré des lésions nerveuses dans la neuropathie idiopathique fibre petites et la maladie de Fabry.

Cornée microscopie confocale est une technique non invasive cliniques qui peuvent être utilisés pour quantifier les dommages des fibres C de diagnostiquer et de stratifier les patients avec une gravité croissante neuropathique.

Microscopie confocale cornéenne: A Novel technique non invasive pour quantifier Fibre petites pathologie dans les neuropathies périphériques

La quantification précise de la neuropathie périphérique est importante pour identifier les patients à risque, anticiper la détérioration et évaluer de nouvelles thérapies. ...

Ce vidéo montre une procédure d'imagerie des fibres C cornéennes à l'aide de la technique non invasive de microscopie confocale cornéenne, ou CCM, permettant la quantification des lésions des fibres nerveuses. Tout d'abord, le plan focal de l'objectif sur la CCM est ajusté et un gel visqueux pour les yeux est appliqué sur l'objectif avant de fixer le capuchon jetable. Ensuite, des gouttes anesthésiques et du gel visqueux pour les yeux sont appliqués sur l'œil.Ensuite, on règle la caméra afin d’établir un contact entre le gel situé à l’avant de l’objectif et la cornée du patient. Enfin, on ajuste la profondeur du plan de mise au point et on capture des images des nerfs cornéens provenant de la partie centrale de la couche de Bowman. Des modifications morphologiques des fibres nerveuses cornéennes peuvent être observées afin de quantifier la neuropathie.Il s'agit d'une technique très novatrice qui a en réalité déjà été utilisée dans le domaine de l'optométrie et de l'ophtalmologie, mais au cours des huit dernières années environ, nous l'avons employée de manière très efficace pour étudier et évaluer la neuropathie diabétique ainsi que d'autres neuropathies périphériques. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet de quantifier les lésions des fibres nerveuses fines à un stade très précoce, puis de stratifier la gravité de la neuropathie chez les patients de façon entièrement non invasive. Nous pouvons réaliser cela très rapidement grâce à un balayage de deux minutes, qui peut ensuite être quantifié en fonction de la sévérité de la neuropathie. Nous espérons ainsi remplacer certaines autres méthodes beaucoup plus invasives, telles que la biopsie cutanée ou la biopsie nerveuse. Bien qu'elle paraisse globalement simple, cette technique requiert en réalité des étapes bien définies pour capturer l'image de manière optimale, puis pour quantifier l'image.Et nous souhaitons vraiment rendre tout ce processus clair et évident pour toute autre personne souhaitant utiliser cette technique. La première étape de l'examen à l'aide du microscope confocal cornéen HRT consiste à préparer l'extrémité de l'objectif au niveau du tube de l'objectif de la caméra à balayage laser. Régler la réfraction à +12 dioptries, puis ajuster la caméra à la position la plus basse et bloquer l'objectif en le tournant dans le sens antihoraire.Appliquez une goutte de taille P, homogène et sans bulle, de visco tears sur l'extrémité de la lentille. Retirez un capuchon tomo de son récipient stérile et fixez-le au-dessus de l'extrémité de la lentille aussi loin que possible sur le support, de sorte que le gel forme un ménisque entre la lentille objective et le capuchon. Veillez à ne pas toucher la surface avant du capuchon tomo lors du montage.Maintenant, déplacez la caméra de balayage laser aussi loin que possible vers l'arrière sur le support de caméra, de manière à visualiser la surface intérieure et extérieure du bouchon tomographique. Ces deux surfaces apparaissent sous forme de reflets laser brillants sur l'écran du moniteur. Réglez la molette d'ajustement du plan focal jusqu'à l'observation d'un reflet brillant, indiquant que l'objectif est focalisé à l'avant du bouchon.La valeur de profondeur indiquée sur l'affichage de la position de mise au point doit maintenant se situer entre moins 150 micromètres et plus 150 micromètres. Réinitialisez le réglage de profondeur à zéro. Voyons maintenant comment préparer le patient.Après avoir anesthésié les yeux du sujet avec une goutte de chlorhydrate d'oxybuprocaine à 0,4 %, lubrifiez la partie antérieure de l'œil avec des larmes artificielles. Placez le sujet confortablement, le menton sur l'appui-menton, en veillant à ce que son front soit fermement appuyé contre la barre frontale. L'examen est facilité en demandant au patient de fixer la lumière de fixation externe.Avec l'œil non examiné, la taille compacte de la tête du microscope garantit que l'œil controlatéral du sujet n'est pas obstrué, permettant ainsi l'utilisation de cibles éloignées. Positionner la caméra CCD de sorte que son accès optique soit perpendiculaire à l'accès optique de la caméra de balayage laser.La caméra doit être du côté droit du patient lors de l'imagerie de l'œil droit, et vice versa. Dans cette position, la surface antérieure du tomo cap apparaît au centre de la caméra CCD. Image en direct.Déplacez la caméra de balayage laser vers le patient jusqu'à ce que la cornée du patient se trouve à une distance d'environ cinq à dix millimètres du tomo cap. Ensuite, utilisez les boutons de réglage vertical et horizontal sur le support de la caméra pour déplacer la caméra de balayage laser vers le haut et le bas, et vers la gauche et la droite, jusqu'à ce que le tomo cap soit positionné au centre de la cornée du patient. Demandez maintenant au patient d'ouvrir les yeux aussi grand que possible.Déplacez lentement la caméra de balayage laser vers le patient jusqu'à ce que le capuchon tomographique entre en contact avec la cornée du patient. À ce stade, vérifiez que la lumière laser rouge est centrée sur la cornée et que le reflet du faisceau laser provenant de la cornée se produit exactement au pôle antérieur de la cornée. Le contact entre la lentille et la cornée est minimal lorsque le réglage est optimal.Un fin pont de gel entre le capuchon tomographique et la cornée est visible sur l'image en direct de la caméra CCD. S'il y a une pression excessive entre le capuchon tomographique et la cornée, la cornée présente un aspect aplati sur l'image de la caméra CCD. L'image en direct et le strayer apparaissent sur l'image de la CCM.Après avoir positionné le patient, activez la caméra laser HR trois, puis la fenêtre d'acquisition d'image apparaîtra à l'écran. Utilisez l'image CCD pour positionner le capot tomo et le faisceau laser sur la cornée du patient. Le CCM offre trois options pour la capture d'images.L'analyse de séquence permet d'acquérir jusqu'à 100 images avec une fréquence d'images réglable. Une fréquence d'images comprise entre 30 et 1 image par seconde est sélectionnée. Et en fonction de cela, une vidéo peut être acquise avec une durée comprise entre trois et 100 secondes.Dans le mode de balayage volumique, la caméra acquiert automatiquement une série de 40 images provenant de plans focaux consécutifs. Une profondeur totale de 85 micromètres peut être balayée, et la distance focale entre deux images consécutives est d'environ 2,1 micromètre. La dernière option est le mode section, qui sera utilisé pour cette expérience.Ce mode permet une imagerie optimale avec des images uniques nettes acquises et stockées à chaque pression sur la pédale. Ce mode est utilisé pour capturer des images de l'ensemble de la couche cornéenne, y compris la couche de Bowman au centre de la cornée. Après avoir capturé un nombre suffisant d'images, d'autres modes peuvent être utilisés, notamment le mode séquence et le mode volume.Après quelques balayages, le plan focal de l'objectif peut être modifié afin de mesurer la profondeur d'une couche cellulaire cornéenne par rapport à la surface cornéenne, en mettant la couche cellulaire épithéliale au point, puis en cliquant sur le bouton de réinitialisation pour régler la valeur de profondeur à zéro. Une fois l'examen terminé, éteignez la caméra en cliquant sur le bouton d'alimentation de la caméra dans la fenêtre d'acquisition. Informez le patient qu'il ne doit pas se frotter les yeux jusqu'à ce que l'anesthésie locale se soit dissipée.Retirez le capuchon du capteur de la caméra, jetez-le, puis nettoyez l’objectif du microscope avec un coton-tige humidifié à l’eau distillée. Voyons maintenant comment analyser une image et quantifier les paramètres des fibres nerveuses afin de revoir et d’analyser des examens existants. Tout d’abord, sélectionnez le dossier du patient approprié dans la fenêtre de la base de données.La fenêtre de visualisation des images fournit un aperçu des examens de la cornée déjà réalisés pour le patient sélectionné. Les examens effectués à des dates différentes sont stockés dans des onglets de visite distincts. Les trois types de balayage différents sont représentés par trois icônes différentes. Dans l'onglet de visite cornéenne HRT trois du module de visualisation des images de l'Heidelberg Eye Explorer.Pour examiner l'image de la cornée, double-cliquez sur l'icône d'image appropriée, puis appuyez sur afficher maintenant pour exporter les images appropriées en vue d'une analyse ultérieure. Cliquez sur exporter dans la barre d'outils, puis sélectionnez le dossier dans lequel enregistrer les images. Étant donné que l'objectif principal de cette recherche porte sur la couche de Bowman et les nerfs cornéens, seules les images de cette couche seront analysées. Cinq à six images de la couche de Bowman sont sélectionnées pour chaque sujet à différentes profondeurs de la cornée.L'analyse d'image est réalisée à l'aide d'un logiciel spécialisé développé par notre équipe, appelé CCM Image Analysis Tools, version 0.64. Les principaux paramètres des nerfs cornéens sont mesurés avec le logiciel : la densité des fibres nerveuses, définie comme le nombre de nerfs principaux par image. La densité des branches nerveuses correspond au nombre total de branches principales par image.La longueur des fibres nerveuses correspond à la longueur totale des nerfs principaux et de leurs branches principales par image de fibre nerveuse. La tortuosité est la tortuosité des nerfs principaux par image. Pour ouvrir une image CCM, allez dans le fichier puis ouvrez.Une fois l'image chargée, sa taille et son type s'affichent dans la zone d'information sur l'image située en haut à gauche du panneau de contrôle, et l'échelle par défaut s'affiche dans la ligne d'édition de l'information sur l'image. Si l'échelle est différente, modifiez le nombre dans la ligne d'édition. Pour commencer à analyser l'image, sélectionnez le paramètre que vous souhaitez mesurer dans la zone de métriques située en haut à droite du panneau de contrôle.Dans la zone de résultats située en bas de la page, les valeurs NFD et MBD sont présentées sous forme de nombres réels. La NFL est exprimée en millimètres et la tortuosité sous la forme d'un coefficient de tortuosité. Les résultats peuvent être exportés vers une feuille Excel.Lorsque vous ouvrez la page Excel, les résultats seront présentés en nombre par millimètre carré pour la DFN et en millimètres par millimètre carré pour la LFN, ainsi qu'en coefficient de tortuosité pour la TDF. Pour effectuer ces mesures, commencez par marquer chaque nerf principal, puis marquez chaque branche du nerf principal. Enfin, tracez chaque nerf dans le cadre.Un stylet numérique peut être utilisé pour une meilleure précision. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une minute si elle est effectuée correctement lors de la tentative de cette procédure. Il est important de suivre attentivement les instructions détaillées.Après avoir visionné cette vidéo, nous espérons que vous avez acquis une bonne compréhension de la manière de travailler et de capturer des images de la couche des fibres nerveuses en mouvement de la cornée à l’aide de la microscopie confocale cornéenne, ainsi que de quantifier et d’analyser les images provenant de cette couche chez les patients atteints de neuropathie périphérique, en particulier de neuropathie diabétique. Et n’oubliez pas que le travail avec la MCC nécessite une expertise, et il a été recommandé que les professionnels formés à l’examen ophtalmologique effectuent cette procédure.

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Afin d'étudier les changements de fibres nerveuses nociceptives (intraépidermiques IENFs) dans les neuropathies douloureuses (PN), nous avons développé des protocoles qui pourraient examiner directement les modifications morphologiques tridimensionnels observés dans IENFs nociceptifs. Analyse tridimensionnelle de IENFs a le potentiel d'évaluer les changements morphologiques des IENF en PN.

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Le protocole pour l'imagerie dynamique longitudinale et lésion laser sélectif de terminaisons nerveuses chez des souris transgéniques reporter est présente.

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La jonction neuromusculaire (JNM) est altérée dans diverses affections qui peuvent parfois aboutir à une insuffisance synaptique. Ce rapport décrit des méthodes basées sur le microscope à fluorescence pour quantifier de tels changements structurels.

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Microscopie confocale cornéenne: A Novel technique non invasive pour quantifier Fibre petites pathologie dans les neuropathies périphériques (Vidéo) | JoVE Journal

Microscopie confocale cornéenne: A Novel technique non invasive pour quantifier Fibre petites pathologie dans les neuropathies périphériques

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