Name: Colonie de cellules de formage (CFC) Dosage pour les cellules hématopoïétiques humaines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-18T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Découvrez le dosage CFC pour évaluer la prolifération et la différenciation des cellules souches hématopoïétiques humaines CD34+ dans un milieu semi-solide. Cette méthode permet d'étudier les effets des oncogènes sur l'hématopoïèse.

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Nous remercions le juge Alvin Siteman Cancer Center à Washington University School of Medicine et Barnes-Jewish Hospital à St Louis, MO, pour l&#39;utilisation de la base Trieuse vitesse élevée de cellules, qui a fourni l&#39;équipement et des services de cytométrie en flux de tri. Ce travail a été soutenu par les instituts nationaux de subventions et de santé R01 HL082549 K02 HL084179 (NRY). Le Siteman Cancer Center est soutenu en partie par un soutien du NCI Cancer Center Grant P30 CA91842.

<ol><li>Takeda, A., Goolsby, C., Yaseen, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NUP98-HOXA9+induces+long-term+proliferation+and+blocks+differentiation+of+primary+human+CD34%2B+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">NUP98-HOXA9 induces long-term proliferation and blocks differentiation of primary human CD34+ hematopoietic cells.</a> Cancer Res. , 66-6628 (2006).</li>
<li>Yassin, E. R., Abdul-Nabi, A. M., Takeda, A., Yaseen, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+NUP98-DDX10+oncogene+on+primary+human+CD34%2B+cells%3A+role+of+a+conserved+helicase+motif%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Effects of the NUP98-DDX10 oncogene on primary human CD34+ cells: role of a conserved helicase motif.</a> Leukemia. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Yassin, E. R., Sarma, N. J., Abdul-Nabi, A. M., Dombrowski, J., Han, Y., Takeda, A., Yaseen, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+the+transformation+of+primary+human+hematopoietic+cells+by+the+oncogene+NUP98-HOXA9%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dissection of the transformation of primary human hematopoietic cells by the oncogene NUP98-HOXA9.</a> PLoS One. 4, e6719-e6719 (2009).</li>
<li>Nissen-Druey, C., Tichelli, A., Meyer-Monard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hematopoietic+colonies+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Haematol%22%5BJournal%5D)">Human hematopoietic colonies in health and disease.</a> Acta Haematol. 113, 5-96 (2005).</li>
<li>Pereira, C., Clarke, E., Damen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+colony-forming+cell+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic colony-forming cell assays.</a> Methods Mol Biol. 407, 177-208 (2007).</li>
<li>Coulombel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cells%3A+strength+and+drawbacks+of+functional+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Identification of hematopoietic stem/progenitor cells: strength and drawbacks of functional assays.</a> Oncogene. 23, 7210-7222 (2004).</li>
<li>Hogge, D. E., Lansdorp, P. M., Reid, D., Gerhard, B., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+detection%2C+maintenance%2C+and+differentiation+of+primitive+human+hematopoietic+cells+in+cultures+containing+murine+fibroblasts+engineered+to+produce+human+steel+factor%2C+interleukin-3%2C+and+granulocyte+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Enhanced detection, maintenance, and differentiation of primitive human hematopoietic cells in cultures containing murine fibroblasts engineered to produce human steel factor, interleukin-3, and granulocyte colony-stimulating factor.</a> Blood. 88, 3765-3773 (1996).</li>
</ol>

Le dosage de CFC a été largement utilisée pour déterminer la prolifération et la différenciation des modèles de progéniteurs hématopoïétiques et d&#39;étudier les effets des oncogènes (4, 5). Il a l&#39;avantage sur les cultures de liquide d&#39;être un test clonal, telles que les colonies constituent la descendance d&#39;un ancêtre unique et peut être retiré individuellement pour une analyse ultérieure. La limitation du dosage de CFC est qu&#39;elle n&#39;est pas adéquate pour la détection de progéniteurs plus immature...

<table><tbody><tr><td>IMDM</td><td>Life Technologies</td><td>12440</td><td></td></tr><tr><td>Sérum bovin foetal (FBS)</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>06150</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine (PS)</td><td>Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Ligand FLT-3</td><td>PeproTech Inc</td><td>300-19</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>PeproTech Inc</td><td>300-03</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>PeproTech Inc</td><td>300-07</td><td></td></tr><tr><td>TPO</td><td>PeproTech Inc</td><td>300-18</td><td></td></tr><tr><td>IL3</td><td>PeproTech Inc</td><td>200-03</td><td></td></tr><tr><td>IL6</td><td>PeproTech Inc</td><td>200-06</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP118</td><td></td></tr><tr><td>Rétronectine</td><td>Takara Bio Inc</td><td>T100A</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14175</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14200</td><td></td></tr><tr><td>Solution de bleu de trypan (0,4 %)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Methocult GF+ H4435</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>04445</td><td></td></tr><tr><td>Milieu enrichi en méthylcellulose humain</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>HSC005</td><td></td></tr><tr><td>Coloration de Wright/Giemsa</td><td>Harleco</td><td>64571</td><td></td></tr><tr><td>Solution tampon phosphate, pH 6,4 - formule Giordano</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>1450</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>8310</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de souris normal</td><td>Rockland Immunochemicals</td><td>D208</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD11b humain conjugué à la phyc&amp;#8211;réthrine</td><td>BD Biosciences</td><td>555388</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD33 humain conjugué à l'allophtocyanine</td><td>BD Biosciences</td><td>551378</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45 humain conjugué à la phyc&amp;#8211;réthrine-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>557748</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD71 humain conjugué à la phyc&amp;#8211;réthrine</td><td>BD Biosciences</td><td>555537</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD235a humain conjugué à l'allophtocyanine</td><td>BD Biosciences</td><td>551336</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45 humain conjugué à la phyc&amp;#8211;réthrine-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>557748</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture tissulaire de 24 puits, non traitées</td><td>BD Biosciences</td><td>35-1147</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de 30 mm, non traitée</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>27150</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de culture tissulaire de 100 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de comptage quadrillées</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>27500</td><td></td></tr><tr><td>Tubes coniques de 15 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>35-2097</td><td></td></tr><tr><td>Tubes coniques de 50 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>35-2070</td><td></td></tr><tr><td>Seringues de 3 ml</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>28240</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille émoussée de 16 gauge, 1&amp;frac12; pouce</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>28110</td><td></td></tr><tr><td>Filtre cellulaire CellTrics de 50 &amp;mu;m</td><td>Partec</td><td>04-004-2327</td><td></td></tr><tr><td>Hémocytomètre</td><td>Fisher Scientific</td><td>0267110</td><td></td></tr><tr><td>Chambres d'échantillonnage TPX</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>A78710018</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope Fisherbrand Superfrost/Plus, prénettoyées</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Cartes filtres Shandon</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>5991022</td><td></td></tr><tr><td>Support de lame Shandon pour cytospin</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>59920063</td><td></td></tr><tr><td>Ensemble complet de coloration Shandon 100</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>100</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Papier filtre de 1 &amp;mu;m</td><td>VWR international</td><td>28307-134</td><td></td></tr><tr><td>Microscope inversé</td><td>Nikon Instruments</td><td>Diaphot</td><td></td></tr><tr><td>Caméra de microscope</td><td>Nikon Instruments</td><td>DS-F11</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus Corporation</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>Caméra de microscope</td><td>Olympus Corporation</td><td>DP71</td><td></td></tr><tr><td>Scanner</td><td>Microtek</td><td>Scanmaker 4</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur vortex</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur de culture tissulaire</td><td>Sanyo</td><td>MCO-18AIC</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin</td><td>Shandon, Inc.</td><td>Cytospin 2</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse de table</td><td>Eppendorf</td><td>5810-R</td><td></td></tr><tr><td>Système de purification d'eau</td><td>Barnstead</td><td>Nanopure-Diamond</td><td></td></tr></tbody></table>

colonie de cellules de formage (cfc) dosage pour les cellules hématopoïétiques humaines

Colony Forming Cell (CFC) Assay for Human Hematopoietic Cells

Humaines hématopoïétiques cellules souches / progénitrices sont généralement obtenus à partir de la moelle osseuse, sang du cordon ou du sang périphérique et sont utilisées pour étudier l&#39;hématopoïèse et la leucémogenèse. Ils ont la capacité de se différencier en lignées lymphoïdes et myéloïdes. Les cellules formant colonie (CFC) de dosage est utilisé pour étudier la prolifération et la différenciation des progéniteurs tendance hématopoïétique par leur capacité à former des colonies dans un milieu semi-solide. Le nombre et la morphologie des colonies formées par un nombre fixe de cellules d&#39;entrée fournir des informations préliminaires sur la capacité des progéniteurs de différencier et de proliférer. Les cellules peuvent être récoltées à partir des colonies individuelles ou de la plaque entière pour mieux évaluer leur nombre et les états de différenciation par cytométrie en flux et l&#39;évaluation morphologique de Giemsa lames colorées. Ce test est utile pour évaluer la différenciation myéloïde mais pas lymphoïdes. Le myéloïde terme dans ce contexte est utilisé dans son sens large pour englober lignées granulocytaire, monocytaire, érythroïdes et mégacaryocytaires. Nous avons utilisé ce test pour évaluer les effets des oncogènes sur la différenciation des primaires humaines dérivées de cellules CD34 + du sang périphérique. Pour cette fin sont les cellules transduites avec le contrôle de construire soit rétroviraux ou une construction exprimant l&#39;oncogène d&#39;intérêt, dans ce cas-NUP98 HOXA9. Nous employons un vecteur rétroviral couramment utilisés, MSCV-IRES-GFP, qui exprime un ARNm bicistronique qui produit le gène d&#39;intérêt et un marqueur de la GFP. Les cellules sont pré-activés par de plus en plus la présence de cytokines pendant deux jours avant transduction rétrovirale. Après deux jours, les cellules GFP + sont isolés par tri cellulaire par fluorescence (FACS) et mélangé avec un milieu semi-solide contenant méthylcellulose complétées par des cytokines et incubés jusqu&#39;au colonies apparaissent à la surface, généralement 14 jours. Le nombre et la morphologie des colonies sont documentés. Les cellules sont ensuite retirés des plaques, lavés, comptés, et soumis à la cytométrie en flux et l&#39;examen morphologique. La cytométrie en flux avec des anticorps spécifiques à la surface cellulaire des marqueurs exprimés au cours de l&#39;hématopoïèse fournit des informations sur la lignée et le stade de maturation. Des études morphologiques des cellules individuelles au microscope après coloration de Wright-Giemsa fournir des informations supplémentaires à l&#39;égard de la lignée et la maturation. Comparaison des cellules transduites avec le vecteur contrôle vide à ceux transduites avec un oncogène révèle les effets de l&#39;oncogène sur la différenciation hématopoïétique.

Les cellules formant colonie (CFC) de dosage est un dosage in vitro dans les progéniteurs hématopoïétiques, qui forment des colonies dans un milieu semi-solide. Une combinaison de la morphologie des colonies, la morphologie cellulaire et la cytométrie de flux sont utilisés pour évaluer la capacité des progéniteurs à proliférer et se différencier ainsi les différentes lignées hématopoïétiques.

Colonie de cellules de formage (CFC) Dosage pour les cellules hématopoïétiques humaines

Les cellules souches et progénitrices hématopoïétiques humaines sont généralement obtenues à partir de la moelle osseuse, du sang de cordon ou du sang périphérique et sont utilisées pour étudier l'hématopoïèse et...

Cette procédure évalue, dans un milieu semi-solide, la capacité des progéniteurs hématopoïétiques à proliférer et à se différencier selon différentes lignées hématopoïétiques pour initier la culture. Dégèle fraîchement les cellules positives pour le CD 34 en présence de cytokines afin de favoriser l'activation après deux jours. Réalisez la transduction rétrovirale d'un vecteur témoin exprimant la GFP en ajoutant les cellules positives pour le CD 34 activées à une plaque préchargée avec le virus.48 heures plus tard, isoler les cellules positives pour la GFP par tri cellulaire (FACS), puis ensemencer ces cellules dans un milieu semi-solide à base de méthylcellulose enrichi en facteurs de croissance et incuber pendant environ deux semaines jusqu'à l'apparition de colonies en surface. Enfin, récolter les colonies, immobiliser les cellules sur des lames à l'aide de cytocentrifugation et les colorer par la coloration de May-Grünwald-Giemsa afin de déterminer au microscope la lignée hématopoïétique et le stade de maturation. Cette méthode peut fournir des éclairages mécanistiques dans les études sur la leucémogenèse, notamment les effets des oncogènes sur la différenciation hématopoïétiqu

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cellules endothéliales progénitrices formant colonie (CPEF) sont un outil prometteur pour étudier l'homéostasie vasculaire et de réparation.

L&#39;isolement et expansion à grande échelle des cellules adultes humaines Colony Forming progénitrices endothéliales

Cellules endothéliales formant colonie (CPEF) sont les cellules endothéliales circulantes avec robuste potentiel prolifératif clonal qui affichent...

Caractérisation phénotypique et fonctionnelle des cellules endothéliales formant colonie dérivés du sang de cordon ombilical humain

Cette vidéo décrit le protocole de l’unité de formation de colonies à base de méthylcellulose ou test UFC, qui permet d’identifier et de compter le nombre de colonies formées par les cellules leucémiques en réponse au traitement avec des composés anticancéreux.

Dosage de l’UFC à base de méthylcellulose : une méthode pour déterminer l’effet des composés anticancéreux sur la formation de colonies dans les cellules leucémiques

Ce protocole décrit l’induction efficace de l’endothélium hémogène et des progéniteurs hématopoïétiques multipotentiels à partir de cellules souches pluripotentes humaines via l’expression forcée de facteurs de transcription.

Induction directe de Hemogenic endothélium et le sang par la surexpression de facteurs de transcription dans pluripotentes humaines Cellules souches

Nous présentons ici pluripotentes humaines protocoles de culture de cellules souches (hPSC), utilisés pour différencier les hPSCs en CD34+ progéniteurs hématopoïétiques. Cette méthode utilise la manipulation spécifique au stade de canonique WNT de signalisation indiquer les cellules exclusivement pour le programme hématopoïétique de définitif ou primitif.

Réalisé la différenciation des progéniteurs hématopoïétiques primitives et définitif des cellules souches pluripotentes humaines

Nous présentons ici la méthodologie pour l’analyse clonale de cellules souches hématopoïétiques précurseurs au cours du développement embryonnaire murin. Nous combinons indice tri des cellules individuelles de la région d’aorte-gonades-mésonéphros embryonnaire avec co-culture de cellules endothéliales et la transplantation pour caractériser les propriétés phénotypiques et le potentiel de prise de greffe des précurseurs hématopoïétiques unique.

Analyse clonale des précurseurs embryonnaires de cellules souches hématopoïétiques à l’aide de cellule unique Index tri combinée avec Niche de cellules endothéliales co-culture

Nous décrivons ici les protocoles de validation chimique et génétique de c-Fos et Dusp1 comme cible de drogue dans la leucémie à l’aide de modèles de souris in vitro et in vivo de génétique et humanisé. Cette méthode peut être appliquée à n’importe quelle cible pour la validation génétique et développement thérapeutique.

Méthodes permettant d’évaluer le rôle de c-Fos et Dusp1 dans la dépendance de l’oncogène

Ici, nous présentons un protocole pour former précisément l'endothélium hémogène à partir de cellules souches pluripotentes humaines dans une condition sans mangeoire et sans xéno. Cette méthode aura de larges applications dans la modélisation des maladies et le dépistage des composés thérapeutiques.

Différenciation hémogénique de l'endothélium par des cellules souches pluripotentes humaines dans une condition définie sans mangeoire et sans xéno

Ici nous décrivons une méthode fiable pour mesurer la masse mitochondriale et le potentiel de membrane dans les cellules souches hématopoïétiques et les cellules T cultivées ex vivo.

Mesure de la masse mitochondriale et du potentiel membranaire dans les cellules souches hématopoïétiques et les lymphocytes T par cytométrie de flux

Présenté ici est une technique basée sur la cytométrie de flux qui permet de mesurer simultanément le nombre de divisions cellulaires, le phénotype des cellules de surface et la parenté cellulaire. Ces propriétés peuvent être testées statistiquement à l’aide d’un framework basé sur la permutation.

Évaluation simultanée de la parenté, du numéro de division et du phénotype par cytométrie en flux pour les cellules souches hématopoïétiques et progénitrices

Ce protocole décrit une procédure permettant d’induire la différenciation des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques humaines dérivées de la moelle osseuse du patient et des cellules mononucléaires du sang périphérique. Le test utilise un milieu de culture semi-solide soutenant l’engagement des lignées érythroïdes et myéloïdes et intègre des métriques standardisées pour la classification des colonies reproductibles pour la caractérisation préclinique des médicaments.

Test unitaire formant une colonie adapté pour les cellules mononucléaires de moelle osseuse et du sang périphérique dérivées du patient

Découvrez le dosage CFC pour évaluer la prolifération et la différenciation des cellules souches hématopoïétiques humaines CD34+ dans un milieu semi-solide. Cette méthode permet d'étudier les effets des oncogènes sur l'hématopoïèse.

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