Colonie de cellules de formage (CFC) Dosage pour les cellules hématopoïétiques humaines

Les cellules formant colonie (CFC) de dosage est un dosage in vitro dans les progéniteurs hématopoïétiques, qui forment des colonies dans un milieu semi-solide. Une combinaison de la morphologie des colonies, la morphologie cellulaire et la cytométrie de flux sont utilisés pour évaluer la capacité des progéniteurs à proliférer et se différencier ainsi les différentes lignées hématopoïétiques.

Cette procédure permet d’évaluer, dans un milieu semi-solide, la capacité des progéniteurs hématopoïétiques à proliférer et à se différencier le long de différentes lignées hématopoïétiques pour commencer la culture. Cellules positives au CD 34 fraîchement décongelées en présence de cytokines pour favoriser l’activation après deux jours. Effectuez la transduction rétrovirale d’une construction de test exprimant la GFP en ajoutant les cellules CD 34 positives activées à une plaque préchargée avec le virus.

48 heures plus tard, isolez les cellules positives à la GFP par télécopieur, puis plaquez ces cellules dans un milieu de méthylcellulose semi-solide complété par des facteurs de croissance et incubez pendant environ deux semaines jusqu’à ce que des colonies apparaissent à la surface. Enfin, récoltez les colonies, immobilisez les cellules sur des lames à l’aide de cytosine et colorez avec le gizeh droit pour la détermination microscopique de la lignée hématopoïétique et du stade de maturation. Cette méthode peut fournir un aperçu mécaniste dans les études de la leucémogenèse, à savoir les effets des oncogènes sur la différenciation hématopoïétique.

Afin de voir une culture décongeler rapidement un flacon de cellules positives au CD 34 congelées à 37 degrés Celsius en secouant doucement jusqu’à ce qu’il reste un dernier petit cristal de glace et transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 millilitres. Rincez délicatement les cellules restantes du flacon avec un millilitre de milieu à température ambiante, 2 % F-B-S-I-M-D-M et ajoutez-le goutte à goutte dans le tube de 50 millilitres tout en remuant doucement. Attendez maintenant trois minutes.

Continuez en ajoutant lentement deux millilitres de média tout en mélangeant doucement et équilibrez à nouveau pendant trois minutes. Répétez cette procédure d’ajout de milieux de volume égal à la suspension cellulaire diluée à intervalles de trois minutes, en tourbillonnant doucement entre les ajouts jusqu’à ce que le volume final atteigne 32 millilitres pour recueillir les cellules, centrifugez à 250 G pendant 10 minutes à température ambiante et retirez le supernat, laissant derrière vous environ 0,5 millilitre de milieu au-dessus de la pastille. Procédez une fois au lavage des cellules en suspendant la pastille dans 20 millilitres de milieu et en centrifugeant à 200 G pendant huit minutes À température ambiante, retirez le sane et suspendez les cellules dans un milieu IMDM complet à environ un demi-million de cellules par millilitre.

Enfin, pour déterminer la concentration cellulaire, prélevez 10 microlitres de suspension dans un microtube mélangé avec le même volume de solution de bleu trian à 0,4 % et comptez. À l’aide d’un hémocytomètre, diluez les cellules à 10 à la cinquième cellules par millilitre en ajoutant un milieu IMDM complet complété par le mélange de cytokines activatrices de culture, les cellules dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant deux jours le jour de la transduction comptent les cellules avant de commencer la précharge du virus pour déterminer le nombre de puits à préparer afin de préparer une plaque de culture tissulaire non traitée à 24 puits. Ajoutez 400 microlitres de 25 microgrammes par millilitre, solution de rétro-actine dans chaque puits et incubez pendant deux heures à température ambiante dans la hotte de biosécurité à flux laminaire.

Retirez la solution de rétroactine et codez chaque puits avec 2 % BSA en l’incubant pendant 30 minutes à température ambiante. Pendant ce temps, décongelez les solutions bouillonnantes de virus et conservez-les sur de la glace. Ensuite, aspirez le virus de charge de solution BSA en ajoutant 0,5 millilitre de préparation virale dans chaque puits et centrifugez-le à 2 200 g à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes.

Retirez la solution virale des puits et répétez le chargement du virus trois fois de plus. Enfin, rincez bien chacun avec un milieu IMDM froid. Maintenant, collectez les cellules positives CD 34 pré-activées par centrifugation et remettez les cellules en suspension dans un milieu IMDM complet frais complété par des cytokines aliquote 0,15 million de cellules positives CD 34 dans chacun des puits codés par le virus, puits et incubez dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant deux jours afin de récolter les cellules transduites doucement mais soigneusement.

Suspendez les cellules à partir des plaques flottantes du virus et filtrez la suspension à travers un filtre cellulaire de 50 microns dans un tube conique. Prenez 10 microlitres de suspension cellulaire dans un micro-tube. Mélanger avec un volume égal de solution de bleu trian et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.

Rincez chaque puits avec 0,8 millilitre de HBSS froid avec 0,02 % d’EDTA et ajoutez-le dans le même tube de prélèvement à travers un filtre à cellules CEL Trix de 50 microns. Granulez les cellules par centrifugation et lavez-les une fois avec du HBSS froid. Remettre en suspension la pastille de cellule finale dans HBSS avec 1 % d’AB et garder les cellules sur la glace dans l’obscurité pour le tri ultérieur des cellules, qui est généralement effectué dans une installation centrale de tri de cellules à grande vitesse basée sur la conception expérimentale.

Décongelez vigoureusement le nombre requis d’aliquotes de milieu de dosage CFC pour mélanger et laissez reposer le tube pendant au moins cinq minutes pour laisser les bulles remonter à la surface avant d’ajouter les cellules. Prenez maintenant 3000 cellules triées transmises par le virus dans un microtube stérile contenant un milieu froid à 2 % F-B-S-I-M-D-M et ajustez le volume de suspension final à 0,3 millilitre. Suspendez les cellules et transférez la suspension cellulaire entière dans une aliquote de trois millilitres de milieu de croissance du culte méthylique.

Créez une suspension cellulaire homogène en tourbillonnant vigoureusement. Laissez le tube immobile pendant trois minutes. Afin de plaquer les cellules, fixez une aiguille à extrémité émoussée de calibre 16 à une seringue de trois millilitres et tirez de 2,2 millilitres.

En prenant soin d’éviter l’absorption de grosses bulles, poussez 1,1 millilitre chacun dans deux boîtes de culture tissulaire non traitées de 30 millimètres et étalez le mélange uniformément en tournant placez les plaques en double dans une plaque de 100 millimètres avec un bol d’eau. Poursuite de trois litres de culture à l’eau stérile pendant deux semaines. Caractérisez et notez les colonies en fonction de leur morphologie à l’aide d’un microscope inversé à un grossissement de 40 x dans une boîte de culture marquée d’une grille de notation.

Afin de documenter les résultats de la culture, scanner l’ensemble de la plaque de test CFC à l’aide d’un scanner régulier à 600 DPI et prendre des photomicrographies de faible puissance de colonies représentatives à l’aide d’un microscope inversé équipé d’une caméra couleur pour une analyse plus approfondie de la différenciation et de la prolifération Les cellules de l’ensemble de la plaque de test CFC sont récupérées en suspension dans plusieurs volumes de 2 % F-B-S-I-M-D-M lavées et comptées pour les analyses morphologiques. Transférez 30 000 cellules récupérées à partir de plaques de dosage de CFC sur une lame. À l’aide d’une centrifugeuse à essorage STO, faites sécher les lames à l’air libre pendant la nuit pour les colorer efficacement.

Mettez en place une ligne d’assemblage de neuf récipients de coloration contenant des solutions dans l’ordre suivant. Méthanol absolu droit, gemsa solution mère, tampon gemsa droit, 50 % de méthanol et d’eau, deux récipients d’eau, tampon phosphate, pH six, et enfin deux récipients d’eau. Placez les lames dans un porte-lames et trempez-les dans du méthanol absolu pendant deux minutes et saignez l’excès de méthanol.

Trempez immédiatement le support de diapositives et écrivez la solution mère gemsa pendant cinq minutes. Transférez le support dans le tampon gemsa droit pH 6,4 et incubez pendant 10 minutes. Trempez le support deux fois dans du méthanol à 50 %, 10 fois dans l’eau et 10 fois dans le récipient d’eau suivant, puis cinq fois dans un tampon phosphate.

pH 6,0. Transférez le support dans l’eau et incubez pendant deux minutes. Répétez le lavage dans le dernier récipient d’eau.

Laissez maintenant les lames sécher complètement à l’air libre dans le support. Retirez chaque lame et essuyez l’arrière de la lame avec des lingettes Kim imbibées de méthanol pour enlever les taches. Placez une goutte de cyto seal 60 et un verre de couverture pour sceller.

Effectuez un comptage différentiel de 500 cellules pour chaque lame soutenue GM à l’aide d’un microscope. Pour les besoins de cette expérience, les cellules sont divisées en cinq catégories, les cellules primitives, les cellules myéloïdes intermédiaires, les cellules myéloïdes matures, les cellules érythroïdes intermédiaires et les cellules érythroïdes matures. Par exemple, par rapport à l’expression témoin des 98 nouveaux faucons, un oncogène neuf a augmenté la formation de colonies érythroïdes rouges.

Cet impact de l’oncogène sur le marché est clairement évident lorsque les colonies sont observées sous un faible grossissement. Un examen morphologique plus approfondi par maintien GEM fournit des informations sur la lignée et le degré de maturation de la population cellulaire. Dans cet exemple, l’introduction de nouveaux 98 Hawks, un neuf a provoqué une augmentation globale du nombre de cellules atteintes d’hyperplasie érythroïde et inhibe l’inhibition de la maturation érythroïde et myéloïde.

Cet SA donne un aperçu de la différenciation cellulaire hématopoïétique en mesurant la capacité d’une préparation cellulaire d’entrée à proliférer, à se différencier et à former des colonies dans un milieu semi-solide.