Name: Protocole pour la dengue dans les moustiques (Aedes aegypti) et détermination de phénotype dinfection (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T21:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 25 s
Description: Découvrez comment infecter Aedes aegypti avec le virus de la dengue pour étudier les gènes de résistance. Ce protocole détaille la propagation virale, l'alimentation des moustiques et le titrage dans les intestins moyens et glandes salivaires.

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A. propager le virus dans la ligne de C6/36 cellule. <ol><li> Les cellules se développent à 80% de confluence dans flacon de 75 cm2; </li><li> Retirez le support avec 3-4 ml restant dans le ballon; </li><li> Prenez 0,5 ml stock de virus et d&#39;ajouter dans la cellule ci-dessus avec la multiplicité d&#39;infection de 1,5 particules virales par cellule. Secouer le flacon pendant 15 minutes lentement à la température ambiante. </li><li> Incuber pendant 45 minutes à 5% de CO 2 et 37 ° C </li><li> Ajouter 30 ml de milieu, et incuber pendant 5 jours. </li></ol> B. Préparer le mélange de virus et de sang <ol><li> Détachez la cellule avec le racloir et le transfert de la cellule et les médias pour les 50 ml tubes coniques; </li><li> Centrifugat à 800g pendant 10 minutes; recueillir le surnageant, mais laissez 1ml de surnageant avec le culot cellulaire; </li><li> Gel de la cellule au-dessus de granulés de CO 2 sec puis dégel dans l&#39;eau bain à 37 ° C, répéter deux à trois fois; </li><li> Centrifugat à 800g pendant 10 minutes, prenez le surnageant, et de combiner avec le surnageant recueilli de l&#39;étape 3; </li><li> Collecter le sang total humain avec la même procédure (étape 3) pour la préparation de la culture des gamétocytes pour infecter des moustiques Anophèles par Plasmodium falciparum; </li><li> Combinez la même quantité de sang humain total ci-dessus avec le surnageant de virus de l&#39;étape 4, et ajouter le sérum humain (10% de l&#39;ensemble du volume). </li><li> Incuber le mélange ci-dessus du sang humain et le virus de la dengue pendant 30 minutes à 37 ° C bain d&#39;eau </li></ol> Nourrir les moustiques C. Cette procédure est presque identique à ce qui a été décrit dans la section pour les infections à Plasmodium falciparum chez les moustiques. Nous dosage de l&#39;infection intestin moyen au jour 7, et l&#39;infection salivaires à 14 jours après le sang maternel. Tout le matériel ayant été en contact avec le virus sont d&#39;abord traitées avec de l&#39;éthanol 75% puis à l&#39;eau de Javel à 10%. D. Assay le titre du virus dans les tissus des moustiques <ol><li> Deux ou trois jours avant la dissection des tissus de moustiques, de grandir dans une cellule de C6/36 plaque à 24 puits de telle sorte que la cellule atteindre 80% de confluence le jour lorsque le dosage est effectué; </li><li> Les moustiques sont anesthésiés à 4 ° C, sacrifiés et surface stériles en les trempant dans de l&#39;éthanol 75% pendant 1 minute. Puis les moustiques ont été lavés avec de l&#39;eau stérile à deux fois avant la dissection des glandes salivaires ou de l&#39;intestin moyen sous la loupe binoculaire. A partir de cette étape, toute la procédure ci-dessous doit être menée dans un environnement stérile, comme une enceinte de sécurité biologique. Ces tissus sont transférés dans un tube contenant 150 ul des médias et homogénéisé avec un moteur Kontes granulés pilon pendant 90 secondes; </li><li> Faire une dilution de 1:100 en ajoutant 10 pl de l&#39;homogénat dans les médias 990 ul; </li><li> Faire encore 1: 10, 1:100 et 1:1000 dilution avec le milieu dans la plaque de 96 puits; </li><li> Retirez le support de la plaque de 24 puits, et ajouter 100 ul de chacune de ces quatre dilutions dans chaque puits correspondants; </li><li> Agiter la plaque doucement pendant 15 minutes à la température ambiante, puis incuber pendant 45 minutes à 5% de CO 2 et 37 ° C; </li><li> Ajouter 1ml de méthycellulose superposition (1%) dans chaque puits; </li><li> Incuber les plaques à 37 ° C avec 5% de CO 2 pendant 5 jours; </li><li> Les étapes à partir d&#39;ici n&#39;ont pas besoin d&#39;un environnement stérile, mais comme avec tous les soins d&#39;autres agents pathogènes doivent être prises à tout moment. Jeter superposition méthycellulose de chaque plaque et éponger pour enlever l&#39;excès des médias </li><li> Ajouter 1 ml de méthanol / acétone fixatif (1:1) à chaque puits. Conserver à 4 ° C pendant 1 h; </li><li> Verser le fixateur, et se laver une fois avec du PBS 1X; </li><li> Faire dilution de 1:1000 à l&#39;anticorps primaire contre le virus avec 5% blotto; </li><li> Ajouter 200 pi de liquide hyperimmun dilué dans chaque puits et incuber à 37 ° C pendant 1 heure; </li><li> Retirer du liquide hyperimmun et la plaque de lavage avec PBS 1 X </li><li> Préparer une dilution 1:1000 de chèvre anti-souris conjugué (Cat # 074-1806 KPL) dans 5% BLOTTO (lait écrémé en poudre 5g dans 100 ml d&#39;une X PBS), puis ajouter 200 ul à chaque puits et incuber à 37 ° C pendant 1 h; </li><li> Préparer substrat comme suit: ajouter une tablette de 3&#39;-diaminobenzidine terrahydrochloride (Cat Sigma # D5905) dans 20 ml de PBS 1 X, après dissolution, puis ajouter 8 l de peroxydase hydrogène à 30% </li><li> Ajouter 200 ul de substrat ci-dessus pour chaque puits. Laisser reposer à température ambiante pendant 10 minutes </li><li> Retirer substrat et arrêter la réaction en ajoutant 1 ml d&#39;eau distillée dans chaque puits </li><li> Verser l&#39;eau et des assiettes blot pour sécher </li><li> Comptez le nombre de particules virales </li></ol>

<table><tbody><tr><td>Incubateur</td><td></td><td></td><td></td><td>avec 5 % CO2, 37 °C</td></tr><tr><td>Tubes coniques de 50 ml</td><td></td><td></td><td></td><td>en plastique</td></tr><tr><td>Embouts de pipette</td><td></td><td></td><td></td><td>pour culture tissulaire</td></tr><tr><td>Pipettman</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettes de Pasteur</td><td></td><td></td><td></td><td>en verre, stériles</td></tr><tr><td>Bain-marie</td><td></td><td></td><td></td><td>37 °C</td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bain-marie à circulation d'eau</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alimenteurs à membrane de verre</td><td></td><td></td><td></td><td>avec tubulure en caoutchouc pour adapter les alimenteurs</td></tr><tr><td>Coupelles pour moustiques</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Éthanol à 75 %</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eau de Javel à 10 %</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture tissulaire</td><td></td><td></td><td></td><td>plaques de 6, 24 et 96 puits</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri</td><td></td><td></td><td></td><td>en verre</td></tr><tr><td>Lames</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinces à pointe fine</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td><td>1X, stérile</td></tr><tr><td>Microscope stéréoscopique</td><td>Microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C6/36 cells</td><td>cells</td><td></td><td></td><td>Pour la propagation du virus</td></tr><tr><td>Milieu C6/36</td><td></td><td></td><td></td><td>MEM avec 10 % de FBS inactivé par la chaleur, 1 % de L-glutamine et d'acides aminés non essentiels, et 1 % (v/v) de pénicilline-streptomycine.</td></tr><tr><td>3&amp;rsquo;-Diaminobenzidine tétrahydrochlorure</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5905</td><td>1 comprimé dans 20 ml de PBS 1X, dissoudre puis ajouter 8 &amp;#x03BC;l de peroxyde d'hydrogène à 30 %</td></tr><tr><td>Peroxyde d'hydrogène à 30 %</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A. aegypti</td><td>Animal</td><td></td><td></td><td>moustique</td></tr></tbody></table>

protocole pour la dengue dans les moustiques (aedes aegypti) et détermination de phénotype d&#39;infection

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

Le but de cette procédure est d&#39;infecter le moustique Aedes avec virus de la dengue dans un état de laboratoire et d&#39;examiner le niveau d&#39;infection et dynamique du virus dans les tissus des moustiques. Ce protocole est couramment utilisé pour étudier les interactions moustiques-virus, en particulier pour l&#39;identification des facteurs de l&#39;hôte roman qui sont en mesure de déterminer la compétence vectorielle. L&#39;expérience entière doit être menée dans un laboratoire BSL2. Similaire à Plasmodium falciparum, une tenue correcte, y compris des gants et une blouse de laboratoire doit être porté en tout temps. Après l&#39;expérience, tous les matériaux qui sont entrés en contact avec le virus doivent être traités avec de l&#39;éthanol 75% et blanchi avant de procéder à un lavage normal. Tous les autres matériaux doivent être autoclavés avant de les jeter.

Une fois qu&#39;un gène est identifié comme étant potentiellement réfractaires pour le virus de la dengue, il doit être évalué pour son rôle dans la prévention des infections virales dans le moustique. Ce protocole illustre la façon dont l&#39;étendue des cas de dengue de moustiques peuvent être dosés. Les techniques pour cultiver le virus en culture, l&#39;alimentation à membrane moustiques sang humain, et en dosant les titres viraux dans l&#39;intestin moyen des moustiques sont démontrés.

Protocole pour la dengue dans les moustiques (Aedes aegypti) et détermination de phénotype d&#39;infection

L'objectif de cette procédure est d'infecter le moustique Aedes avec le virus de la dengue dans des conditions de laboratoire et d'examiner le niveau et la dynamique de l'infection de...

Je suis George Dimopoulos, et nous allons maintenant vous montrer une procédure permettant d'infecter le moustique Aidas GTI avec le virus de la dengue. La première étape consiste à propager le virus dans une lignée cellulaire Aidas Aus. Je m'appelle Jose Luis Ramirez, et je suis étudiant au doctorat dans le laboratoire ous.Pour cette procédure, nous aurons besoin d'une installation de niveau de sécurité biologique 2 équipée d'une hotte de culture cellulaire, d'un incubateur à CO2 réglé à 37 degrés Celsius. Nous avons besoin de tubes coniques en plastique de 50 ml. Nous avons besoin de sérum humain, d'un bain-marie à 37 degrés Celsius et d'une centrifugeuse.Nous avons besoin de plaques de 96 puits et d'autres réactifs et consommables standards en biologie moléculaire et en biochimie. Il s'agit ici d'une hotte de culture tissulaire classique située dans une installation de niveau de sécurité biologique 2, et la première étape consiste à prélever les cellules ayant atteint une confluence de 80 % dans un flacon de 75 centimètres carrés. Il s'agit d'un milieu MEM contenant 10 % de sérum fetal de veau chauffé et activé, supplémenté avec 1 % de L-glutamine et des acides aminés non essentiels.Ok, nous allons maintenant ajouter le virus de la dengue aux cellules. Nous avons sorti la souche virale du congélateur à moins 80 degrés et nous l'avons décongelée dans un incubateur à 37 degrés. Nous ajoutons environ 0,5 millilitre de la souche virale aux cellules afin d'obtenir une concentration d'environ 1,5 particule virale par cellule.Les cellules sont ensuite placées sur un agitateur pendant environ 15 minutes à une vitesse d'agitation lente. Ensuite, les cellules sont mises dans un incubateur à CO2 pendant environ 45 minutes. À 37 degrés Celsius, la concentration de CO2 est de 5 %. Après l'incubation de 45 minutes, nous sortirons les cellules et ajouterons 30 ml de milieu, puis nous replacerons les cellules dans l'incubateur et les maintiendrons en incubation pendant cinq jours supplémentaires.Nous allons maintenant préparer les particules virales pour l'infection. Tout d'abord, nous devons détacher les cellules du flacon à l’aide d’un grattoir, puis les transférer, avec le milieu, dans un tube conique de 50 ml. Ensuite, nous devons centrifuger les cellules à 12 000 tr/min pendant 10 minutes afin de former un culot.Au fond de cette bouteille, vous pouvez voir le culot. Ensuite, nous éliminerons le surnageant et ne laisserons qu'un ml avec les cellules afin de libérer le virus des cellules. Nous les congèlerons.Cela provoquera la rupture des cellules, puis nous les décongèlerons et les recongèlerons à nouveau, en répétant ce protocole trois à quatre fois ; la congélation s'effectue sur de la glace sèche. Après congélation, le culot cellulaire est placé dans un bain-marie à 37 degrés pour être décongelé, puis recongelé sur la glace sèche. Entre chaque étape de congélation, les cellules sont resuspendues par vortexage. Nous collectons maintenant le surnageant contenant le virus et l'ajoutons au surnageant provenant de la centrifugation précédente, qui contient également des particules virales.Cette préparation virale est désormais prête à être combinée à une quantité équivalente de sang humain total et de sérum. Ici, nous avons combiné la préparation virale avec du sang humain total enrichi de 15 % de sérum humain. Cette solution de sang et de virus va maintenant être utilisée pour nourrir les moustiques et les infecter.Nous allons ajouter ce sang dans un alimenteur à membrane, et cet alimenteur sera placé sur un gobelet contenant les moustiques. Nous laisserons les moustiques se nourrir de ce sang pendant environ 25 minutes. Nous avons fixé une pince sur l'alimenteur à membrane afin de le stabiliser. Elle le maintient essentiellement en place sur le filet, et nous allons maintenant ajouter le sang dans l'alimenteur.Dans certains cas, cette expérience peut fonctionner mieux lorsqu'elle est réalisée à l'obscurité, car naturellement les moustiques se nourrissent fréquemment dans l'obscurité. Cela dépend bien sûr de la manière dont la colonie de moustiques a été conditionnée. Les moustiques se sont nourris pendant environ 25 à 30 minutes, et nous pouvons retirer le nourrisseur à membrane et le placer dans un récipient sécurisé pour décontamination.Après l'alimentation sanguine, les moustiques non alimentés doivent être séparés des moustiques repus. Pour ce faire, nous avons assommé les moustiques en plaçant les petits gobelets contenant les moustiques ayant ingéré du sang dans une chambre froide pendant cinq à dix minutes. Comme on peut le voir, les moustiques sont déjà immobilisés par le froid.Nous ouvrons le couvercle et transférons les moustiques dans une petite boîte en Pétri, placée sur un seau à glace afin que les moustiques restent au froid en permanence et ne puissent pas s'échapper. N'oubliez pas que ces moustiques sont infectés, il faut donc prendre toutes les précautions nécessaires pour éviter qu'ils ne s'échappent. Une fois que les moustiques sont descendus dans la chambre froide, nous les transférons vers l'insectarium ordinaire, maintenu à température ambiante, mais nous plaçons toujours les moustiques dans la boîte en Pétri, elle-même conservée dans le seau à glace, afin qu'ils restent constamment ralentis.On peut voir comment les moustiques nourris peuvent être séparés des non nourris. Les moustiques nourris contiennent du sang. Ils sont complètement gorgés.Certains d'entre eux se sont nourris partiellement de sang, ils ne sont donc pas complètement gonflés. Ils ont une petite quantité de sang dans l'abdomen, tandis que d'autres en ont une grande quantité. Les non nourris n'ont aucun sang dans l'abdomen, ce qui permet de distinguer facilement les individus nourris de ceux qui ne le sont pas.Nous allons donc transférer ces moustiques depuis la boîte de Pétri vers les gobelets en carton recouverts de cire. L'étape suivante consiste à analyser l'infection par le virus de la dengue chez le moustique. Si nous souhaitons analyser l'infection virale dans l'intestin moyen du moustique, nous devons disséquer les moustiques vers le septième jour suivant leur repas sanguin.Et si vous souhaitez analyser l'infection virale dans la glande salivaire, nous devrions disséquer les moustiques environ 14 jours après le repas sanguin. Jose va maintenant vous montrer comment disséquer l'intestin du moustique. Les moustiques ont maintenant été anesthésiés sur de la glace, et nous les tuons par une incubation dans de l'éthanol à 70 % pendant environ une minute. Ensuite, nous transférons les moustiques dans deux bains d'eau successifs.Une minute chacun. Cela permet d'éliminer l'éthanol des moustiques. Nous allons maintenant disséquer les moustiques dans du PBS sur des lames de microscope.La meilleure méthode pour disséquer le tube digestif moyen d'un moustique gyp time consiste à placer le moustique à l'envers sur ses ailes, à saisir la partie abdominale avec une pince et le thorax avec une autre pince, puis à tirer sur le moustique. À présent, Jose sépare le moustique en deux, et le tube digestif apparaît entre l'abdomen et la partie thoracique du moustique. Le tube digestif est le tissu semi-transparent qui apparaît à la partie supérieure du moustique.Nous allons maintenant transférer l'intestin disséqué dans un milieu de lignée cellulaire et l'apporter sous la hotte de culture tissulaire afin d'isoler les particules virales de l'intestin. Nous introduisons les intestins moyens disséqués dans la salle de culture tissulaire et nous les homogénéisons à l'aide d'un pilon afin de libérer les particules virales. Après l'homogénéisation de l'intestin moyen, nous ajoutons du milieu à l'homogénat pour obtenir une dilution au 1/100 des particules virales.Ensuite, nous poursuivons la dilution jusqu'à un à 10, un à 101 à 1000. Dans la plaque 96 puits, nous avons préparé la lignée cellulaire Alba picto à une confluence de 80 % dans une plaque 24 puits. Puis, nous éliminons le surnageant des cellules Alba picto et ajoutons à ces cellules les particules virales diluées afin de déterminer la concentration de particules virales dans chaque dilution.Cela nous permettra de déterminer le niveau d'infection du virus. Dans l'intestin moyen du moustique, les cellules sont ensuite agitées pendant 15 minutes à température ambiante lentement. Ensuite, nous plaçons les cellules pendant 45 minutes dans l'incubateur à CO2 à 37 degrés.Ensuite, nous ajoutons un ml de couche supérieure de méthylcellulose à 1 % dans chaque puits, puis la plaque est de nouveau incubée pendant cinq jours dans un incubateur à CO2 à 37 degrés. Après cette incubation de cinq jours, nous ajoutons un ml de fixateur acétone-méthanol dans chaque puits. Puis, nous incubons la plaque à quatre degrés Celsius dans un réfrigérateur pendant une heure.Ensuite, nous éliminons le fixateur et lavons chaque puits une fois avec du PBS. Ensuite, nous préparons une dilution au 1/1000 de l'anticorps primaire anti-dengue dans une solution contenant 5 % de sang. Puis, nous ajoutons 200 microlitres de cette solution d'anticorps.À chaque puits, déplacez votre tête. Merci. Ensuite, nous incubons la plaque pendant une heure à 37 degrés Celsius. Ensuite, nous éliminons le liquide hyperimmun et lavons chaque puits avec un XPBS.Ensuite, nous répétons la procédure exactement de la même manière avec un anticorps secondaire. Nous avons préparé 20 ml du substrat selon le protocole, et nous l'ajoutons à un récipient. Puis nous ajoutons 200 microlitres de substrat dans chaque puits.Ensuite, nous arrêtons la réaction en retirant le substrat et en ajoutant un millilitre d’eau distillée dans chaque puits. Puis nous éliminons l’eau de la plaque et laissons la plaque sécher. Chaque point de couleur représente une plage de virus, et en comptant ces plages, nous pouvons estimer le nombre de particules virales présentes dans l’intestin moyen d’origine du moustique que nous avons homogénéisé.Nous venons de vous montrer la procédure permettant d'effectuer une infection par le virus de la dengue chez le moustique aegypti. Ce protocole implique la production du virus dans une lignée cellulaire de moustique. Les particules virales sont ensuite purifiées et isolées à partir de la lignée cellulaire, puis mélangées à du sang total humain et administrées aux moustiques.Le virus infecte les moustiques et, une fois l'infection établie, nous vous avons montré comment isoler le tissu du tube digestif moyen du moustique et comment déterminer le niveau d'infection de ce tube digestif moyen. Nous homogénéisons essentiellement le tube digestif moyen et utilisons une procédure pour libérer les particules virales à partir de ce tissu. Ensuite, nous utilisons ces particules virales pour réinfecter une lignée cellulaire de moustique afin de déterminer le niveau d'infection du tube digestif moyen, ainsi que le nombre de particules virales ayant infecté le tube digestif du moustique.

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