Protocole pour la dengue dans les moustiques (Aedes aegypti) et détermination de phénotype d'infection

Je m’appelle George Dimopoulos et je vais maintenant vous montrer une procédure pour infecter le moustique Aidas GTI avec le virus de la dengue. Et la première chose que nous devrons faire est de propager le virus dans une lignée cellulaire d’Aïdas Aus. Je m’appelle Jose Luis Ramirez et je suis doctorant dans le laboratoire de l’US.

Pour cette procédure, nous aurons besoin d’une installation BSL deux avec une hotte de culture tissulaire, un incubateur de CO2 réglé à 37 degrés Celsius. Nous avons besoin de tubes coniques en plastique de 50 ml. Nous avons besoin de sérum humain, nous avons besoin d’un bain-marie, d’un 37 degrés Celsius, d’une centrifugeuse.

Nous avons besoin de plaques de 96 puits et d’autres normes de biologie moléculaire et de biochimie, de réactifs et de consommables. Il s’agit donc d’une hotte de culture tissulaire régulière dans une installation BSL deux, et la première étape consiste à extraire les cellules qui ont atteint une fluidité de 80 % dans un flacon de 75 centimètres carrés. Il s’agit d’un média MEM avec 10 % de chaleur, de chaleur et de sérum bovin fœtal activé complété par 1 % de L-glutamine et d’acides aminés non essentiels.

D’accord, maintenant nous allons ajouter le virus de la dengue aux cellules. Nous avons sorti le stock de virus du congélateur à moins 80 et nous l’avons fait décongeler sur un incubateur à 37 degrés. Nous ajoutons environ 0,5 millilitre de virus stock aux cellules pour obtenir une concentration d’environ 1,5 particules virales par cellule.

Les cellules sont ensuite placées sur un agitateur pendant environ 15 minutes à un rythme d’agitation lent. Ensuite, les cellules sont placées dans un incubateur de CO2 pendant environ 45 minutes. À 37 degrés Celsius, la concentration de CO2 est de 5 %Après l’incubation de 45 minutes, nous retirerons les cellules et ajouterons 30 ml de milieu, puis nous placerons à nouveau les cellules dans l’incubateur et incuberons pendant cinq jours supplémentaires.

Maintenant, nous allons préparer les particules de virus pour l’infection. Tout d’abord, nous devons détacher les cellules du ballon à l’aide d’un grattoir, puis les transférer avec un média dans un tube conique de 50 ml. Maintenant, nous avons des cellules de centrifugation à 12 000 tr/min pendant 10 minutes pour les granuler.

Au fond de cette bouteille, vous pouvez voir le granulé. Ensuite, nous allons retirer le surnageant et ne laisser qu’un ml avec les cellules afin de libérer le virus des cellules. Nous allons les congeler.

Cela va rompre les cellules, puis nous les décongelons, puis nous les congelons à nouveau et nous répétons cette procédure trois à quatre fois et la congélation se fait sur de la glace sèche. Après la congélation, la pastille cellulaire est placée sur un bain d’eau à 37 degrés pour les décongeler, puis elles sont à nouveau congelées sur les yeux secs entre chaque étape de congélation, WEP suspend les cellules par vortex. Maintenant, nous collectons le surnageant contenant le virus et l’ajoutons au surnageant de la centrifugation précédente, qui contient également des particules virales.

Cette préparation de virus est maintenant prête à être combinée avec une quantité égale de sang humain total et de sérum. Ici, nous avons combiné la préparation du virus avec du sang humain total complété par 15 % de sérum humain. Cette solution de virus sanguin va maintenant être utilisée pour nourrir les moustiques et les infecter.

Nous allons ajouter ce sang dans une mangeoire à membrane et cette mangeoire à membrane sera placée sur une tasse contenant les moustiques et nous laisserons les moustiques se nourrir de ce sang pendant environ 25 minutes. Nous avons placé un clip sur le chargeur à membrane afin de le stabiliser. Il l’alourdit essentiellement sur le net, et nous allons maintenant ajouter le sang dans la mangeoire.

Dans certains cas, cette expérience peut mieux fonctionner lorsqu’elle est faite dans l’obscurité, car naturellement, les moustiques se nourrissent souvent dans l’obscurité. Cela dépend bien sûr de la façon dont la colonie de moustiques a été conditionnée. Les moustiques se sont maintenant nourris pendant environ 25 à 30 minutes, et nous pouvons retirer la mangeoire à membrane et la placer dans un récipient sûr pour la décontamination.

Après l’injection de sang, les moustiques inaptes doivent être retirés des moustiques nourris. Pour ce faire, nous avons renversé les moustiques en mettant les petites tasses contenant les moustiques nourris au sang dans une chambre froide pendant cinq à 10 minutes. Comme nous pouvons le voir, les moustiques sont déjà couchés dans le froid.

Nous ouvrons le couvercle et transférons les moustiques dans un petit bol d’essence, qui est conservé sur un seau à glace afin que les moustiques soient maintenus au froid tout au long et qu’ils ne puissent pas s’échapper. N’oubliez pas qu’il s’agit de moustiques infectés, il faut donc prendre toutes les précautions pour ne pas les laisser se déchaîner. Une fois que les moustiques sont couchés dans la chambre froide, qui transfère les moustiques dans l’intérieur normal, qui est maintenu à la température ambiante, mais nous mettons toujours les moustiques dans la boîte pétro-plat, qui est conservée dans le seau à glace, pour qu’ils soient là pour qu’ils soient toujours en bas.

Vous pouvez voir comment les moustiques de la Fed peuvent être éliminés de ceux de l’UNFI. Les Fed ont du sang en elles. Ils sont complètement engorgés.

Certains d’entre eux se sont nourris partiellement de sang, de sorte qu’ils ne sont pas complètement engorgés. Ils ont un peu de sang dans l’abdomen, mais d’autres ont beaucoup de sang dans l’abdomen. Les UNFI n’ont pas de sang dans leur abdomen, et vous pouvez donc facilement, facilement distinguer les Fed des inaptes.

Nous allons donc transférer ces moustiques de la parabole d’essence aux gobelets en carton de cire. L’étape suivante consiste à doser l’infection par le virus de la dengue chez le moustique. Si nous voulons tester l’infection virale dans l’intestin moyen du moustique, nous devons disséquer les moustiques vers le septième jour après qu’ils aient pris le repas de sang.

Et si vous voulez tester l’infection virale dans la glande sale, nous devons disséquer les moustiques environ 14 jours après l’alimentation sanguine, Jose va maintenant vous montrer comment disséquer l’intestin du moustique. Les moustiques ont maintenant été anesthésiés sur de la glace, et nous allons les tuer par incubation dans de l’éthanol à 70 % pendant environ une minute. Ensuite, nous transférons les moustiques dans deux bains d’eau successifs.

Une minute chacun. Il s’agit d’éliminer l’éthanol des moustiques. Nous allons maintenant disséquer les moustiques dans PBS sur des lames de microscope.

La meilleure façon de disséquer l’intestin moyen d’un moustique est de placer le moustique à l’envers sur ses ailes et de saisir la partie abdominale avec une pince et le thorax avec une autre pince, puis de tirer le moustique. Maintenant, Jose sépare le moustique et l’intestin apparaîtra entre l’abdomen et la partie thoracique du moustique. Maintenant, l’intestin est le tissu semi-transparent qui est apparu sur la partie supérieure du moustique.

Nous allons maintenant transférer l’intestin disséqué dans un milieu de lignée cellulaire et l’amener dans le capot de culture tissulaire pour isoler les particules virales de l’intestin. Nous apportons les intestins moyens disséqués dans la salle de culture tissulaire et nous homogénéisons avec un pilon afin de libérer les particules virales. Après l’homogénéisation de l’intestin moyen, nous ajoutons du milieu à l’homogénat pour obtenir une dilution de un à 100 des particules virales.

Ensuite, nous continuons à diluer cela à un à 10, de un à 101 à 1000. Dans la plaque de 96 puits, nous avons préparé la lignée cellulaire Alba picto à 80 % de fluidité dans une plaque de 24 puits. Ensuite, nous retirons le supnatant des cellules de hiatus alba picto et nous ajoutons à ces cellules les particules virales diluées afin de déterminer la concentration des particules virales dans chaque dilution.

Cela nous permettra de déterminer le niveau d’infection du virus. Dans l’intestin moyen du moustique, les cellules sont ensuite secouées lentement pendant 15 minutes à température ambiante. Ensuite, nous plaçons les cellules pendant 45 minutes dans l’incubateur à 37 degrés de CO2.

Ensuite, nous ajoutons un ml de rechargement de méthylcellulose à 1 % dans chaque puits, puis la plaque est à nouveau incubée à 37 degrés de CO2 pendant cinq jours. Après l’incubation de cinq jours, nous ajoutons un ml d’un fixateur d’acétone méthanol dans chaque puits. Ensuite, nous incubons l’assiette à quatre degrés Celsius dans un réfrigérateur pendant une heure.

Ensuite, nous retirons le fixateur et lavons chaque puits une fois avec du PBS. Ensuite, nous effectuons une dilution de un à 1000 de l’anticorps primaire anti-dengue dans une solution sanguine à 5 %. Ensuite, nous ajoutons 200 microlitres de cette solution d’anticorps.

À chacun, bien bougez la tête. Merci. Ensuite, nous incubons la plaque pendant une heure à 37 degrés Celsius. Ensuite, nous retirons le liquide hyperimmun et nous lavons bien chacun avec un XPBS.

Ensuite, nous répétons la procédure exactement de la même manière avec un anticorps secondaire. On nous prépare 20 ml de substrat selon le protocole, et on l’ajoute dans un récipient. Ensuite, nous ajoutons 200 microlitres de substrat dans chaque puits.

Ensuite, nous arrêtons la réaction en retirant le substrat et nous ajoutons un ml d’eau distillée dans chaque puits. Ensuite, nous jetons l’eau de l’assiette et nous laissons sécher l’assiette. Chaque point de couleur représente une plaque de virus, et en comptant ces plaques, nous pouvons estimer le nombre de particules virales qui se trouvaient dans l’intestin moyen d’origine du moustique que nous avons homogénéisé.

Nous venons de vous montrer la procédure à suivre pour effectuer une infection par le virus de la dengue chez le moustique aegypti. Ce protocole implique la production d’un virus dans la lignée cellulaire du moustique. Les particules virales sont ensuite purifiées de la lignée cellulaire et isolées, puis mélangées à du sang total humain et données aux moustiques.

Le virus infectera les moustiques et une fois l’infection établie, nous vous avons montré comment isoler le tissu de l’intestin moyen du moustique et comment déterminer le niveau d’infection de cet intestin moyen. En gros, nous homogénéisons l’intestin moyen et utilisons la procédure pour libérer les particules virales de cet intestin moyen. Ensuite, nous utilisons ces particules virales pour infecter à nouveau la lignée cellulaire du moustique afin de déterminer le niveau d’infection de l’intestin moyen, le nombre de particules virales qui ont infecté le moustique dans l’intestin.