Name: Cultures de cellules primaires à partir Drosophile Embryons Gastrula (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-28T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Apprenez à préparer des cultures de cellules primaires à partir d'embryons de Drosophila pour l'analyse d'imagerie cellulaire et les perturbations RNAi. Cette méthode permet d'étudier la fonction des gènes dans des cellules différenciées.

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JB a été soutenue par la Damon Runyon Cancer Research Fellowship Foundation DRG-1716-1702. JZ a été soutenu par le NIH / NIGMS Bourse F32 GM082174-02. NP est un enquêteur de l&#39;Institut médical Howard Hughes.

1. Préparation des cages volée <ol><li> Cultivez la drosophile (souches sauvages tels que l'Oregon-R ou tout autre génotype) dans des contenants pratiques tels que des tasses d'insectes 32-oz </li><li> Transfert mouches nouvellement eclosed à de grandes cages d'embryon de collecte ou de voler des cages de la population. </li><li> Déplacer les cages dans une pièce avec une température de ~ 25 ° C et une humidité ~ 65% dans une lumière de 12 h et une noire de 12 h du cycle afin de faciliter la collecte d'embryons synchrone. </li><li> Maintenir les mouches dans les cages en les nourrissant tué pâte de levure striés sur des plaques de la mélasse. Changer les plaques de la mélasse (la levure à la pâte de tués) une fois par jour pendant 2-3 d. </li></ol> 2. Collecte des embryons synchrones <ol><li> Le jour de l'élément primaire de préparation, nourrir les mouches wth revêtement des plaques fraîches avec de la levure a tué la pâte pour un 1-2 h de pré-lay période. </li><li> Juste avant le cycle de 12 h d'obscurité, de remplacer les plaques pré couché avec plaques mélasse douce strié avec une quantité minimale de pâte levure. Jeter la collection pré laïcs, qui contient asynchrones embryons âgés. </li><li> Recueillir des embryons pour une période de 1-2 h. </li><li> Retirez les plaques contenant de la population relativement synchrones d'embryons et les conserver à 25 ° C pendant 5-6 h. Les embryons seront au stade avancé gastrula à ce moment. </li></ol> 3. Collecte et lavage des embryons <ol><li> Desserrer les embryons à partir des plaques avec un pinceau humide, et rincez abondamment à l'eau du robinet tiède à travers une série de tamis empilés, de sorte que les embryons de recueillir dans le tamis plus fins treillis au fond. Rincer pendant quelques minutes pour enlever autant que la levure et les débris volent que possible. </li><li> Astuce du tamis afin que les embryons s'accumulent d'un côté, et les laver en douceur du tamis dans un panier dechorionation. </li><li> Déplacer vers la zone de culture de tissu capuche sans laisser les embryons se dessécher. </li></ol> 4. Homogénéisation des embryons et des cellules de plaquage <ol><li> Stériliser et dechorionate les embryons en les immergeant dans 50% (vol / vol) javel pendant 5-10 min. Rincez les embryons sur le mur du panier avec 70% (vol / vol) d'éthanol. Sinon, laver l'eau de Javel hors embryons avec l'eau distillée avant traitement à l'éthanol. De ce point embryons partir doivent être manipulés dans des conditions stériles et dans la hotte de culture de tissus. </li><li> Rincez les embryons à fond pour enlever l'eau de Javel et / ou de l'éthanol avec de l'eau distillée en autoclave. </li><li> Pendant l'étape dechorionation, remplissez un homogénéisateur Dounce avec le volume approprié de milieu M3 température ambiante en fonction du montant des embryons. Le rapport entre le volume des embryons et celle des médias ne devraient pas être trop embryons de 0,5 ml: 40 ml, les médias (ou ~ 100 à 200 embryons / ml). </li><li> Placer les embryons rincés dans un bécher stérilisés avec le montant de M3 assez de journalistes pour submerger les embryons. Laissez tremper pendant les embryons 2-5 min. </li><li> Démonter le panier dechorionation et éponger le filet Nitex sécher avec des serviettes en papier stérilisé. </li><li> Transfert des embryons dans l'homogénéisateur avec un pinceau stérilisé. </li><li> Homogénéiser doucement avec des mouvements courts en utilisant un pilon lâches sans atteindre le fond du tube jusqu'à ce que tous les embryons sont suspendus. Puis doucement, mais fermement, homogénéiser avec huit coups plein. Ne pas tourner le pilon comme il se déplace de haut en bas. </li><li> Transférer le broyat dans un stérile de 50 ml, tube à centrifuger conique soit par versement ou de pipetage, et le bouchon du tube. </li><li> Centrifuger pendant 10 min à 40g, la température ambiante pour obtenir un culot de débris de tissu, des bouquets à grandes cellules et les membranes vitelline. Transférer le surnageant contenant les cellules et le jaune dans un tube propre et répétez l'étape de centrifugation pendant 5 min. </li><li> Soigneusement transférer le surnageant par pipetage versant ou dans un tube propre et de spin pendant 10 min à 360g, la température ambiante à un culot cellulaire. Jeter le surnageant. Resuspendre la cellule dans 10 ml de milieu de culture granulés (milieu sans sérum pour des expériences de RNAi). </li><li> Nombre de cellules viables en utilisant un hémocytomètre pour estimer la densité cellulaire. Pendant ce temps, répétez l'étape 4.10 pour culotter les cellules. </li><li> Resuspendre les cellules à une concentration souhaitée. Pour commencer, essayez une fourchette de 1 ~ 5 x10 6 cellules / ml et une plaque à moins 1.7 au 2.5 x10 5 cellules / cm 2. </li></ol> 5. Primaire à cellules ARNi pour les cellules cultivées sur une plaque de 384 puits <ol><li> Distribuer 5 pl de dsRNA dans chaque puits à une concentration finale de ~ 250 ng par puits dans une plaque de 384 puits. </li><li> Utiliser une pipette multi-canaux, distribuer 10 ml (1 ~ 4x106 cellules / ml) de cellules primaires par puits dans un milieu sans sérum M3 dans une plaque de 384 puits contenant un ARNdb différents dans chaque puits. Alternativement, les cellules peuvent être cultivées sur 8-même diapositives chambre de verre pour l'imagerie confocale. </li><li> Centrifuger les plaques pendant 1 min à 300g, la température ambiante. Culture des cellules dans un milieu sans sérum à 25 ° C pendant 22 h ou à 18 ° C pendant 1-2 d. </li><li> Ajouter 30 ml de milieu de culture contenant du sérum à chaque puits. </li> Centrifuger les plaques pendant 1 min à 300g, la température ambiante. <li> Placer les plaques dans une chambre humide et la culture des cellules primaires pour un supplément de 5 ~ 7 jours à 25 ° C. </li><li> Image des cellules soit en direct ou après coloration par immunofluorescence. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs: Dans des conditions optimales, les cellules dans la culture sera une apparence saine avec une morphologie ronde. La culture aura peu de débris cellulaires, et de 50 ~ 80% confluentes après étalement initial. Ces cellules vont subir des changements morphologiques, après avoir été cultivés pendant une période de temps prolongée. Cela prend habituellement environ 5-8 jours pour les cellules de la culture pour être pleinement différenciées à 25 ° C. Bonne qualité des cultures primaires sont généralement jugés par la façon dont les cellules d'intérêt sont différenciées en culture. Par exemple, les cellules musculaires primaires ont souvent une morphologie semblable à la branche et de devenir des myotubes multinucléés avec une bande-like myofibrilles composé d'une série de sarcomères. Myotubes différenciés seront entièrement habituellement spontanément passer dans la culture. En revanche, les neurones primaires différenciées forment des grappes avec leur corps cellulaire, et se connecter avec d'autres clusters avec leurs câbles axone. <img src="/files/ftp_upload/2215/2215fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Les cellules primaires subissent des changements morphologiques, après avoir été plaqué dans la culture (A) Une image en champ clair de cellules primaires à droite après avoir été plaqué dans un puits d'une plaque de 384 puits. La majorité des cellules sont rondes et intacte et bien séparés. (B) Une image en champ clair de la culture de cellules primaires 20 heures après placage. Les cellules primaires déjà former des amas (grosse flèche) et les muscles avec une morphologie semblable à la branche (flèche longue) peuvent être reconnus à ce stade. (C) Une image en contraste de phase de la culture primaire 5 jours après l'étalement. La culture ressemble beaucoup plus avancé, avec des extensions neuronales (petites flèches), des grappes de neurones (pointes de flèches grand) et les muscles (moyennes flèche). <img src="/files/ftp_upload/2215/2215fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Des exemples de cellules primaires traités avec dsRNA culture dans une plaque de 384 puits Les cellules primaires ont été isolés à partir des embryons porteurs Dmef2-Gal4, D42-Gal4, UAS-GFP mito-transgènes, dans lequel Dmef2-Gal4 et D42-Gal4 l'expression de lecteur de mito-GFP dans les muscles et les neurones moteurs, respectivement. Les cellules ont été traitées avec dsRNA ciblant soit lacZ (AC) ou gonflés (si) (DF). Les deux principaux muscles et les neurones peut être vu par la GFP (A, C, D, F). Les flèches blanches point à l'prolongements neuronaux. Phalloïdine coloration de l'actine (flèches) révèle une structure musculaire branche comme dans la culture traitée avec lacZ dsRNA (B et C), mais la morphologie musculaire round-up dans la culture traitée avec si dsRNA (E et F). Dans les images fusionnées (C, F), les muscles sont colorés en jaune, mais rouge négative neurones montre et leurs extensions (flèches blanches). <img src="/files/ftp_upload/2215/2215fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Micrographies confocale des principaux muscles humains cultivés sur vitronectine lames recouvertes couvercle en verre Muscles primaires ont été colorés avec immunofluorescently anti-drosophile Titin (KZ) (rouge dans la fusion) et avec la phalloïdine pour l'actine (vert à la fusion). Les panneaux supérieurs sont les muscles de contrôle de type sauvage et ceux du bas sont la Sals (CG31374) musculaire ARNi avec des sarcomères raccourcie.

<ol><li>Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22Laboratory+culture+of+Drosophila%22">Laboratory culture of Drosophila</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 588-599 (1999).</li>
<li>Bai, J., Hartwig, J. H., Perrimon, N. S. A. L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+WH2-domain-containing+protein%2C+promotes+sarcomeric+actin+filament+elongation+from+pointed+ends+during+Drosophila+muscle+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">a WH2-domain-containing protein, promotes sarcomeric actin filament elongation from pointed ends during Drosophila muscle growth.</a> Dev. Cell. 13, 828-842 (2007).</li>
<li>Bai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+screening+in+Drosophila+primary+cells+for+genes+involved+in+muscle+assembly+and+maintenance+%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">RNA interference screening in Drosophila primary cells for genes involved in muscle assembly and maintenance .</a> Development. 135, 1439-1449 (2008).</li>
<li>Sepp, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+neural+outgrowth+genes+using+genome-wide+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22PloS.+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of neural outgrowth genes using genome-wide RNAi.</a> PloS. Genet. 4, e1000111-e1000111 (2008).</li>
<li>Donady, J. J., Fyrberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+culturing+of+Drosophila+embryonic+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22TCA+Manual%22%5BJournal%5D)">Mass culturing of Drosophila embryonic cells in vitro.</a> TCA Manual. 3, 685-687 (1977).</li>
<li>Seecof, R. L., Alleaume, N., Teplitz, R. L., Gerson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+neurons+and+myocytes+in+cell+cultures+made+from+Drosophila+gastrulae%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Differentiation of neurons and myocytes in cell cultures made from Drosophila gastrulae.</a> Exp. Cell Res. 69, 161-173 (1971).</li>
<li>Bai, J., Sepp, K. J., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+Drosophila+primary+cells+dissociated+from+gastrula+embryos+and+their+use+in+RNAi+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Culture of Drosophila primary cells dissociated from gastrula embryos and their use in RNAi screening.</a> Nature Protocols. 4, 1502-1512 (2009).</li>
</ol>

Le schéma de développement des cultures primaires de cellules de drosophile peut varier considérablement, probablement due à des variables de plusieurs cours du processus de préparation de cellules primaires. Tout d&#39;abord, les mouches utilisées pour la ponte doivent être jeunes (dans une semaine) et saine (exempte d&#39;infection virale ou bactérienne). Embryons non fécondés ou infectés doivent être évités, car ils sont inutiles et des cellules dérivées de ces embryons ne peuvent pas se différencier et ne s...

<table><tbody><tr><td>Milieu Shields et Sang M3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3652</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>JRH Biosciences</td><td>12103-500M</td><td></td></tr><tr><td>Insuline provenant du pancréas de bovin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-6634</td><td></td></tr><tr><td>Cages de grande taille pour la collecte d'embryons</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-101</td><td></td></tr><tr><td>Crible de test standard US n°25</td><td>VWR international</td><td>57334-454</td><td></td></tr><tr><td>Crible de test standard US n°45</td><td>VWR international</td><td>57334-462</td><td></td></tr><tr><td>Crible de test standard US n°120</td><td>VWR international</td><td>57334-474</td><td></td></tr><tr><td>Moulinette tissulaire Dounce, Wheaton 7 mL</td><td>VWR international</td><td>62400-620</td><td></td></tr><tr><td>Moulinette tissulaire Dounce, Kontes 40 mL</td><td>VWR international</td><td>KT885300-0040</td><td></td></tr><tr><td>Moulinette tissulaire Dounce, Kontes 40 mL</td><td>VWR international</td><td>KT885300-0100</td><td></td></tr><tr><td>Plaque Costar, 384 puits</td><td>VWR international</td><td>29444-078</td><td></td></tr><tr><td>Lame à chambre Lab-Tek II</td><td>Fisher Scientific</td><td>171080</td><td></td></tr></tbody></table>

cultures de cellules primaires à partir drosophile embryons gastrula

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Nous décrivons ici une méthode de préparation et de la culture de cellules primaires dissociées à partir d&#39;embryons de drosophile gastrula. En bref, une grande quantité d&#39;embryons mis en scène des mouches jeunes et sains sont collectées, stérilisée, puis physiquement dissocié en une suspension cellulaire unique à l&#39;aide d&#39;un homogénéiseur de verre. Après avoir été plaqué sur des plaques de culture ou des diapositives de chambre à une densité appropriée dans le milieu de culture, ces cellules peuvent se différencier en d&#39;autres de plusieurs types de cellules morphologiquement distinctes et qui peuvent être identifiés par leurs marqueurs cellulaires spécifiques. Par ailleurs, nous présentons les conditions pour le traitement de ces cellules avec double brin (ds) ARN pour susciter inactivation génique. Efficace ARNi dans les cellules de drosophile primaire est accomplie par la simple baignant les cellules dans un milieu de culture contenant ARNdb. La capacité de mener efficacement une perturbation ARNi, avec d&#39;autres moléculaire, analyses biochimiques, d&#39;imagerie cellulaire, permettra une variété de questions à répondre dans les cellules de drosophile primaire, en particulier ceux liés à la musculaires différenciées et des cellules neuronales.

Nous fournissons un protocole détaillé pour la préparation de cellules primaires dissociées de<em&gt; Drosophil</em&gt; Un embryon. La capacité à mener à bien la perturbation effective ARNi, avec d&#39;autres méthodes d&#39;imagerie moléculaire, biochimique et cellulaire permettra une variété de questions qui seront abordées dans les<em&gt; Drosophile</em&gt; Cellules primaires.

Cultures de cellules primaires à partir Drosophile Embryons Gastrula

Nous décrivons ici une méthode de préparation et de culture de cellules primaires dissociées d'embryons de drosophile au stade de la gastrulation. En résumé, une quantité importante d'embryons sélectionnés selon leur stade...

L'objectif général de cette procédure est de montrer comment préparer des cellules primaires dissociées d'embryons de drosophile pour des analyses d'interférence ARN et d'imagerie cellulaire. Cela est réalisé en préparant d'abord des cages à mouches. Des embryons synchrones sont ensuite collectés, lavés et homogénéisés pour dissocier les cellules.Les cellules primaires sont ensuite mises en culture et transfectées avec des constructions ARNi. En fin de compte, les résultats peuvent être obtenus par microscopie en immunofluorescence, ce qui montre les effets de l'ARNi sur les cellules primaires différenciées. Je m'appelle Namo.Je suis professeur au Département de génétique de la faculté de médecine de Harvard et chercheur à l'Institut médical sur l'usage excessif. Aujourd'hui, moi, Jonathan, chercheur postdoctoral dans le laboratoire ainsi qu'ancien chercheur postdoctoral du laboratoire, allons vous présenter la technique de génération de cellules primaires à partir d'oph gas ou d'embryons. Cette technique revêt une grande importance pour de nombreuses applications en biologie cellulaire et en biologie du développement, et en particulier, comme Janu l'a montré il y a quelques années, la méthodologie peut être utilisée pour des criblages génomiques à grande échelle par IA dans des cellules musculaires primaires.L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l'analyse de lignées cellulaires immortelles établies, est que la culture cellulaire primaire reflète plus précisément la biologie de l'organisme. En général, les personnes qui s'engagent dans cette méthode éprouvent des difficultés, car plusieurs étapes ne peuvent pas être simplement apprises en lisant le protocole. Pour préparer la pâte de levure tuée, broyer d'abord les granulés de levure vivante en une poudre fine à l'aide d'un moulin à café, puis placer celle-ci dans un bécher et stériliser au autoclave en utilisant un cycle sec de 20 minutes. Immédiatement après la stérilisation au autoclave.Ajoutez suffisamment d'eau chaude stérile à la levure pour obtenir une pâte de consistance semblable à celle du dentifrice. Pour préparer des cellules primaires dissociées d'embryons de drosophile, faites croître une souche sauvage de drosophile, telle que orgon R, dans des bouteilles à mouches fraîches, puis transférez les mouches nouvellement écloses dans de grandes cages de collecte d'embryons ou des cages à population de mouches. Ensuite, afin de faciliter la collecte d'embryons synchronisés, placez les cages dans une pièce à environ 25 degrés Celsius et 65 % d'humidité, avec un cycle lumineux de 12 heures d'éclairage et 12 heures d'obscurité, et nourrissez les mouches avec de la nourriture tuée.Pâte de levure étalée sur des plaques de mélasse. Remplacer les plaques de nourriture une fois par jour pendant deux à trois jours. Le jour de la préparation des cellules primaires, nourrir les mouches avec des plaques fraîches pendant une période préalable de ponte d'une à deux heures.Juste avant le cycle d'obscurité de 12 heures, remplacez les plaques de pré-oviposition par des plaques fraîches contenant du mélasse. Déposez une quantité minimale de pâte de levure en stries. Jetez la collecte de pré-oviposition qui contient des embryons plus âgés et asynchrones.Collectez les embryons pendant une période d'une à deux heures. Retirez les boîtes contenant la population relativement synchrone d'embryons et conservez-les à 25 degrés Celsius pendant cinq à six heures. À ce stade, les embryons seront au stade de gastrulation avancée pour la collecte des embryons.Après une incubation de cinq à six heures, utilisez un pinceau humide pour les détacher des plaques. Ensuite, placez-les dans un ensemble de tamis empilés et rincez-les soigneusement pour éliminer autant que possible les résidus de levure et de drosophile. Laissez les embryons s'accumuler dans le tamis inférieur.Inclinez le tamis afin que les embryons s’accumulent sur un côté, puis rincez-les délicatement du tamis dans un panier de décor. Ensuite, stérilisez et recouvrez les embryons en les immergeant dans une solution d’eau de Javel à 50 % volume par volume pendant cinq à dix minutes, pendant que les embryons s’incubent.Compléter avec du milieu M3 à température ambiante jusqu'au homogénéisateur, de manière à obtenir un volume n'excédant pas 0,5 millilitre d'embryons par 40 millilitres de milieu. Rincer ensuite les embryons des parois du panier avec de l'éthanol à 70 % volume/volume.À l’aide d’eau distillée stérilisée au autoclave, rincez soigneusement les embryons pour éliminer l’eau de Javel ou l’éthanol. Ensuite, immergez les embryons rincés dans le milieu M three. Dans un bécher stérilisé, laissez les embryons tremper de deux à cinq minutes pendant leur incubation, puis démontez le panier de décoration et séchez délicatement la maille NYX avec des serviettes en papier stérilisées.Après avoir fait tremper les embryons dans le milieu M trois, transférez-les dans l'homogénéisateur à l’aide d’un pinceau stérile, homogénéisez délicatement avec de courtes allées-retours en utilisant un piston lâche, et évitez d’appuyer jusqu’au fond du tube ; une fois que tous les embryons sont en suspension, homogénéisez-les doucement mais fermement avec huit allées-retours complètes. N’effectuez pas de mouvement de torsion avec le piston lors des déplacements vers le haut et vers le bas. Transférez l’homogénat dans un tube conique stérile de 50 millilitres pour centrifugeuse, soit en versant, soit à l’aide d’une pipette, puis fermez le tube et centrifugez pendant 10 minutes à 40 fromages à température ambiante afin de faire précipiter les débris tissulaires, les agrégats cellulaires importants et les membranes grasses.Transférez le culot contenant les cellules et le vitellus dans un tube propre et répétez l'étape de centrifugation pendant cinq minutes. Ensuite, transférez soigneusement le surnageant en le versant ou en l'aspirant dans un tube propre et centrifugez pendant 10 minutes à 360 g à température ambiante afin de récupérer les cellules en culot, puis jetez le surnageant. Remettez en suspension le culot cellulaire dans 10 millilitres de milieu de culture sans sérum pour les expériences d'ARNi.Pour estimer la densité cellulaire, comptez les cellules viables à l’aide d’un hémocytomètre. Ensuite, centrifugez à nouveau les cellules à 360 ×g. Resuspendez les cellules dans un milieu M3 sans sérum à une concentration de 1 à 5 × 10⁶ cellules par millilitre et ensemencez-les à raison de 1,7 à 2,5 × 10⁵ cellules par centimètre carré dans chaque puits d’une plaque 384.Distribuez dans chaque puits d'une plaque multi-puits 5 microlitres d'ARN double brin à une concentration finale d'environ 250 nanogrammes par puits. À l'aide d'une pipette multicanal, ajoutez 10 microlitres d'une suspension de cellules primaires à une concentration de un à quatre fois 10⁶ cellules par millilitre dans un milieu M3 sans sérum dans chaque puits d'une plaque 384 puits. Alternativement, les cellules peuvent être cultivées sur des lamelles-chambre en verre à huit puits pour une imagerie en microscopie confocale.Centrifuger les plaques pendant une minute à 300 Gs à température ambiante. Placer les plaques à 25 degrés Celsius pendant 22 heures ou à 18 degrés Celsius pendant un à deux jours. Ajouter 30 microlitres supplémentaires de sérum contenant le milieu de culture M trois à chacune.Centrifuger soigneusement les plaques pendant une minute à 300 Gs à température ambiante. Incuber les cellules primaires pendant cinq à sept jours supplémentaires à 25 degrés Celsius dans une chambre humide. Enfin, imager les cellules vivantes ou après coloration par immunofluorescence.Dans des conditions optimales, les cellules et la culture auront un aspect sain. Avec une morphologie ronde, la culture présentera peu de débris cellulaires et sera confluente à 50 à 80 %. Après le semis initial, les cellules subiront des changements morphologiques et seront complètement différenciées après environ cinq à huit jours en culture à 25 degrés Celsius ; cette image en champ clair montre un exemple de cellules primaires juste après le semis.La majorité des cellules sont rondes, intactes et bien séparées 20 heures après l'ensemencement. Les cellules primaires forment déjà des agrégats et des muscles dont la morphologie ramifiée peut être reconnue à ce stade. À cette phase, les images en contraste montrent que les cellules primaires cultivées pendant cinq jours présentent un aspect beaucoup plus avancé, avec des prolongements neuronaux, des agrégats neuronaux et des muscles.Dans ces exemples, des cellules primaires ont été isolées à partir d'embryons portant les transgènes DMF two GAL four D 42 G four et UAS mito GFP, dans lesquels DMF two G four et D 42 G four dirigent respectivement l'expression de MIT GFP dans les muscles et les neurones moteurs. Les cellules ont été traitées par des ARN double brin ciblant soit LA C soit inflated. Cette image de fluorescence montre à la fois des muscles et des neurones primaires différenciés exprimant GFP dans la culture transfectée avec des ARN double brin contrôles ciblant LA C ; la flèche blanche indique les prolongements neuronaux, tandis que la pointe de flèche désigne une structure musculaire en forme de branchement. Lorsque le muscle différencié est marqué au Phin, plus de la moitié des muscles présentent une structure en forme de branchement, tandis que le reste affiche une morphologie arrondie.Dans l'image fusionnée, les muscles sont colorés en jaune et les structures neuronales en vert. Cette image de fluorescence montre à la fois des muscles primaires différenciés et des neurones exprimant la GFP dans la culture contenant des ARN bicaténaires ciblant inflated ou si la flèche blanche indique des prolongements neuronaux tandis que la pointe de flèche indique le muscle lorsqu'on l'observe avec une coloration phin. Contrairement aux témoins de type sauvage qui présentent des muscles présentant une certaine ramification, tous les muscles apparaissent ici arrondis dans cette image fusionnée, les muscles étant colorés en jaune tandis que les structures neuronales sont en vert.Remarquez que seule une morphologie musculaire arrondie peut être observée dans cette culture traitée avec des ARN double brin. Alors que les prolongements neuronaux ressemblent à ceux des témoins de type sauvage, ces images montrent des cellules musculaires primaires marquées de façon fluorescente avec un anticorps anti-titan de drosophile en rouge et Phin qui marque l'actine en vert. Ces panneaux montrent un muscle témoin de type sauvage et représentent des cellules musculaires traitées par ARNi, qui se sont développées en muscles présentant un sarcomère raccourci.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de suivre le protocole de manière rigoureuse afin d'obtenir des résultats comparables entre vos expériences. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux à quatre heures si elle est effectuée correctement.

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Nous décrivons ici une procédure permettant de capturer des images en direct de la gastrulation de la drosophile. Cela nous a permis de mieux comprendre la constriction apicale impliquée dans le développement précoce et d’analyser davantage les mécanismes régissant les mouvements cellulaires lors de la modification de la structure tissulaire.

Imaging of Cell Forme Altération et Mouvement cellulaire dans Drosophila Gastrulation Utilisation DE-cadhérine Reporter mouches transgéniques

Cet ouvrage décrit un protocole pour la génération de haute résolution en situ CIH bibliothèques d’étroitement mis en scène la gastrulation Drosophila melanogaster embryons.

Génération de chromatine Genome-wide Conformation Capture bibliothèques d’embryons de drosophile début étroitement mise en scène

Lignées de cellules de drosophile sont importants réactifs pour la recherche fondamentale et recherche biomédicale. Cet article fournit des protocoles pour la décongélation, repiquage et la cryoconservation des lignées de cellules Drosophila couramment utilisées pour aider les chercheurs à intégrer l’emploi de ces réactifs dans leurs recherches.

Dégel, cultivant et cryoconservation des lignées de cellules de drosophile

Présenté ici est un protocole de microinject et simultanément l’image de plusieurs embryons de Drosophila au cours du développement embryonnaire à l’aide d’une plaque à base, imageur à haute teneur.

Préparation et microinjection d’embryons de drosophile pour la microscopie cellulaire vivante effectuée à l’aide d’un analyseur automatisé à contenu élevé

Ici, nous fournissons un protocole de dissection nécessaire pour représenter en direct la gonade mâle embryonnaire tardive de la drosophile . Ce protocole permettra d’observer des processus cellulaires dynamiques dans des conditions normales ou après manipulation transgénique ou pharmacologique.

Dissection et imagerie en direct de la drosophile embryonnaire tardive Gonad

Il est hautement souhaitable de mettre au point une méthode de conservation à long terme des souches de drosophile comme solution de rechange au transfert fréquent de mouches adultes dans des flacons d’aliments frais. Ce protocole décrit la cryoconservation des cellules germinales primordiales de la drosophile et la renaissance de la souche via leur transplantation sur des embryons hôtes agamétiques.

Cryoconservation des cellules germinales primordiales et renaissance des souches de drosophile

Apprenez à préparer des cultures de cellules primaires à partir d'embryons de Drosophila pour l'analyse d'imagerie cellulaire et les perturbations RNAi. Cette méthode permet d'étudier la fonction des gènes dans des cellules différenciées.

Cultures de cellules primaires à partir Drosophile Embryons Gastrula

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