Name: Protocole pour les infections à Plasmodium falciparum dans la détermination Phénotype moustiques et les infections (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 10 s
Description: Découvrez le protocole d'infection de moustiques Anopheles gambiae par Plasmodium falciparum et l'évaluation du phénotype infectieux dans l'intestin moyen. Cette méthode permet d'étudier la transmission du paludisme.

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A. Préparation de la culture gamétocytes: <ol><li> Apportez fraîcheur sang humain et de sérum à 37 o C dans un bain d&#39;eau. </li><li> Dans une hotte, dans des conditions stériles, une pipette 1 ml de sang chaud dans un tube Eppendorf. Spin le sang dans une centrifugeuse pendant 5 minutes à 2200 rpm. Les érythrocytes doivent être granulées; enlever et jeter le sérum clair. Lavez érythrocytes avec un volume égal de sérum de nouveaux 3 fois pour obtenir le sang total pour les gamétocytes. </li><li> Récupérer la culture gamétocytes de l&#39;incubateur CO 2 ou photophore. Cette culture doit être maintenue sur le milieu RPMI et nourris aux moustiques le jour 16 de la culture. Afin de déterminer le% gametocytemia (sur 16 jours de la culture) faire un frottis mince sur une lame de verre avec une goutte de sang et d&#39;effectuer une Geimsa tache. Déterminer le nombre de gamètes dans un champ de la culture du parasite. Il est généralement de l&#39;ordre de 2 - 4%. Calculez le volume de sang total que vous aurez besoin pour atteindre les gametocytemia% final souhaité (0,3 -1%). </li><li> Enlever la plupart des médias de votre culture gamétocytes aide d&#39;une pipette, en prenant soin de ne pas déranger ou aspirer les parasites (parasites apparaissent en noir tandis que les médias sera léger rose / rouge). Déposer le reste des médias et des parasites dans un tube Falcon de 15 ml. Spin dans une centrifugeuse pendant 5 minutes à 2200 rpm. Les parasites et les érythrocytes se granulés, retirez et jetez les médias surnageant sans parasites inquiétants. </li><li> Combinez les parasites avec le volume de sang total préparés (à partir de l&#39;étape A2) pour vous donner la gametocytemia finale désirée, selon les calculs précédents. Pipet pour bien mélanger. (~ 1 minute) </li></ol> C&#39;est maintenant l&#39;échantillon, vous nourrir vos moustiques. Gardez à 37 o C dans un bain-marie. Nourrir les moustiques B.: <ol><li> Mettez votre moustiques Anopheles (~ 30-50) dans des tasses en carton paraffiné recouvert de maille filet garanti par une bande de caoutchouc ou d&#39;un couvercle en carton fourni avec la tasse. Nous utilisons un aspirateur à piles pour cette étape. </li><li> Préparer la circulation au bain-marie en insérant des buses de chaque côté de mangeoires de verre pour tubes en caoutchouc. Connectez que les mangeoires que vous avez besoin d&#39;une série; une extrémité de la série devrait être raccordé à un tube au circulateur du bain d&#39;eau (la partie qui pousse l&#39;eau à travers les mangeoires), l&#39;autre extrémité de la série devrait être composé de tubes en caoutchouc immergé dans le bain pour permettre à l&#39;eau distribuée à vide dans le bain. Allumez le bain jusqu&#39;à ce que l&#39;eau est d&#39;environ 37 o C et l&#39;eau circule à travers les mangeoires et de retour à la baignoire. Cela est essentiel pour conserver la chaleur du sang et de garder les parasites vivants. </li><li> Préparer la membrane (nous utilisons des petits carrés de parafilm étiré) en étirant dans le chargeur de la membrane de verre, en utilisant la pression pour sceller hermétiquement à l&#39;ouverture d&#39;alimentation. Cette membrane va imiter la peau. </li><li> Placez une mangeoire à membrane vers le bas sur chaque tasse de moustiques et de mangeoires sécuriser l&#39;aide de colliers ou de ruban adhésif. La membrane doit s&#39;asseoir au ras du filet afin moustiques peuvent y accéder de l&#39;intérieur de la tasse. </li><li> Soigneusement pipette parasites sanguins repas (A5 étape) dans le col de l&#39;alimentation, en s&#39;assurant que le sang va tout le chemin à travers le cou dans le réservoir, contact avec la membrane de sorte que les moustiques peuvent accéder au sang. Nous utilisons environ 200 ul de sang par départ, mais cela peut varier. </li><li> Autoriser les moustiques de se nourrir. Nous leur permettons de se nourrir pendant ≈ 30 minutes (variable selon theexperiment; pour la plupart des expériences, parfois surveillance combien ont déjà pris un repas en regardant le contenu de sang dans l&#39;abdomen.) </li><li> Après l&#39;alimentation, retirer mangeoires de la tasse de moustique. Eteignez le bain d&#39;eau et débranchez mangeoires à partir de tubes. </li><li> Retirer la membrane et laisser tremper dans l&#39;eau de Javel mangeoires de 10% pour décontaminer et rincer à l&#39;eau. Placez les matières contaminées (membranes, des serviettes en papier, gants, etc) dans un petit sac de Biohazard et déposer dans un grand récipient Biohazard. </li><li> Anesthetize moustiques en plaçant coupes au réfrigérateur ou chambre froide. Une fois que les moustiques sont complètement anesthésiés, les transférer sur une boîte de Pétri incorporé dans un seau à glace. Trier les moustiques, en regardant attentivement les abdomens de tout signe d&#39;un repas de sang, et de jeter ceux qui ne se nourrissent pas. Certains moustiques seront entièrement gorgée tandis que d&#39;autres montrent une bande étroite de sang ingéré, tous sont acceptables comme «nourris». Mettez les moustiques nourris dans les gobelets en carton. </li><li> Offrir un repas de sucre (un morceau de coton imbibé de 10% de saccharose) pour les moustiques, et incuber dans des conditions normales insectarium pendant 7 jours. Chaque jour, les moustiques doivent être surveillés pour le taux de mortalité. En outre, le coton doit être fait mouiller avec le saccharose, de sorte qu&#39;ils ne soient pas privés de nourriture. Il vaut mieux, encore, d&#39;ajouter une serviette de papier imbibée d&#39;eau distillée, pour éloigner les moustiques humide. Ces moustiques sont P. falcipraum infectés, de sorte que tous les soins doivent être prises afin que les moustiques peuvent pas CESAPe de la coupe. Il est préférable de mettre les tasses en une protection cagefor double petit. </li></ol> C. Dissection estomacs des moustiques et l&#39;estimation des charges oocystes: <ol style="margin-top: 0in"><li style="tab-stops: list .5in"> Aspirer les moustiques (de l&#39;étape B) de gobelets carton à l&#39;aide d&#39;un aspirateur à piles. Anesthetize moustiques, qui sont à l&#39;intérieur du réservoir d&#39;aspiration amovible, en se déplaçant à une chambre froide ou d&#39;enterrer le réservoir dans la glace pendant au moins 5 minutes ou jusqu&#39;à ce que les moustiques arrêter de bouger. </li><li style="tab-stops: list .5in"> Transfert moustiques anesthésiés à partir du réservoir d&#39;un plat en verre de Pétri intégrés dans la glace. Fais les moustiques à une seule couche et couvrir avec un couvercle de Petri en plastique. Les moustiques qui ne peuvent pas être logés sur le plat reste dans le réservoir, qui est retourné à chambre froide ou de glace. </li><li style="tab-stops: list .5in"> En utilisant une pince à pointe fine, transférer un seul moustique de l&#39;antenne à 100 ul de PBS contenues sur une lame de verre montée sous un microscope à dissection. Laissez les autres couverts dans le plat refroidi Pétri. </li><li style="tab-stops: list .5in"> En utilisant une pince à pointe fine, tenir les moustiques au niveau du thorax et l&#39;abdomen postérieur. Tirez sur le corps de l&#39;autre jusqu&#39;à l&#39;intestin moyen est exposé. Utilisez une pince pour enlever l&#39;excès de tissu de l&#39;intestin gut.The ressemble à un blanc, en forme de sac corps. Retirer l&#39;excès de tissu de la gut.Mount l&#39;intestin dans un puits d&#39;une lame de verre de 12 puits et de plonger dans ul 5-10 de 0,2% du mercurochrome. Squash de la carcasse et les jeter sur le papier humide towel.Continue pour les moustiques d&#39;autres jusqu&#39;à ce que la glissière de 12 puits est plein. Couvrir les tripes monté avec une lamelle de verre. </li><li style="tab-stops: list .5in"> Examinez tripes d&#39;un microscope optique, à la recherche d&#39;oocystes ronds cette tache rose vif contre le tissu clair / faibles intestinale rose. Comptez oocystes, enregistrer et continuer à l&#39;échantillon suivant. Continuer pour tous les moustiques de tous les traitements expérimentaux. </li><li style="tab-stops: list .5in"> Lorsque vous avez terminé, essuyez lame propre avec une serviette en papier. Placer la serviette de papier avec des tripes, et serviette en papier avec les carcasses, dans le sac et jetez Biohazard petite à la poubelle. Les gants sont portés pendant toute la procédure. Il est pris soin de ne pas laisser échapper aucun des moustiques infectés. </li></ol>

<ol><li>Avila, S. L., Ferreira, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+diagnosis%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Braz+J+Med+Biol+Res%22%5BJournal%5D)">Malaria diagnosis: a review.</a> Braz J Med Biol Res. 29 (4), 431-443 (1996).</li>
<li>Bell, A. S., Ranford-Cartwright, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+real-time+PCR+assay+for+quantifying+Plasmodium+falciparum+infections+in+the+mosquito+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">A real-time PCR assay for quantifying Plasmodium falciparum infections in the mosquito vector.</a> Int J Parasitol. 34 (7), 795-802 (2004).</li>
<li>Collins, K. M., Hochberg, L. P., Ryan, P. R., Collins, W. E., Wirtz, R. A., Ryan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Plasmodium+malariae+infection+in+mosquito+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Trop+Med+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Quantification of Plasmodium malariae infection in mosquito vectors.</a> Ann Trop Med Parasitol. 98 (5), 469-472 (2004).</li>
<li>Czeher, C., Labbo, R., Djibrilla, A., Here, L., Arzika, I., Duchemin, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISA+study+of+oocyst-sporozoite+transition+in+malaria+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Parasite%22%5BJournal%5D)">ELISA study of oocyst-sporozoite transition in malaria vectors.</a> Parasite. 13 (3), 257-261 (2006).</li>
<li>Haghdoost, A. A., Mazhari, S., Bahadini, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+the+results+of+light+microscopy+with+the+results+of+PCR+method+in+the+diagnosis+of+Plasmodium+vivax%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vector+Borne+Dis%22%5BJournal%5D)">Comparing the results of light microscopy with the results of PCR method in the diagnosis of Plasmodium vivax.</a> J Vector Borne Dis. 43 (2), 53-57 (2006).</li>
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<li>Osta, M. A., Christophides, G. K., Kafatos, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+mosquito+genes+on+Plasmodium+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Effects of mosquito genes on Plasmodium development.</a> Science. 303 (5666), 2030-2032 (2004).</li>
<li>Srinivasan, P., Abraham, E. G., Ghosh, A. K., Valenzuela, J., Ribeiro, J. M., Dimopoulos, G., Kafatos, F. C., Adams, J. H., Fujioka, H., Jacobs-Lorena, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+Plasmodium+and+Anopheles+transcriptomes+during+oocyst+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Analysis of the Plasmodium and Anopheles transcriptomes during oocyst differentiation.</a> J Biol Chem. 279 (7), 5581-5587 (2004).</li>
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Il peut y avoir quelques variations dans l&#39;infection à Plasmodium et de la détermination phénotype infection et différents laboratoires peuvent suivre différentes techniques.

protocole pour les infections à plasmodium falciparum dans la détermination phénotype moustiques et les infections

Protocol for Plasmodium falciparum Infections in Mosquitoes and Infection Phenotype Determination

Une fois qu&#39;un gène est identifié comme étant potentiellement réfractaires au paludisme, il doit être évalué pour son rôle dans la prévention des infections à Plasmodium dans le moustique. Ce protocole illustre la façon dont l&#39;étendue des infections à Plasmodium de moustiques peuvent être dosés. Les techniques de préparation de la culture de gamétocytes, se nourrissant de sang humain membrane moustiques, et en dosant les titres viraux dans l&#39;intestin moyen des moustiques sont démontrés.

Protocole pour les infections à Plasmodium falciparum dans la détermination Phénotype moustiques et les infections

Une fois qu'un gène a été identifié comme potentiellement réfractaire au paludisme, son rôle dans la prévention des infections par Plasmodium au sein du... doit être évalué.

Je suis George Dimopoulos, de l'Institut de recherche sur le paludisme à la faculté de santé publique Johns Hopkins. Nous allons maintenant vous présenter une procédure permettant d'infecter des moustiques Anopheles gambiae avec des parasites Plasmodium falciparum, et de déterminer le phénotype d'infection dans l'intestin moyen du moustique. Pour cette procédure, les équipements de base nécessaires sont un incubateur à CO2 pour la culture des parasites. Alternativement, si vous ne disposez pas d'incubateur à CO2, vous pouvez utiliser un bocal à bougie.Nous avons également besoin, bien sûr, d'un insectarium, ainsi que des équipements standards de biologie moléculaire et de biologie cellulaire tels que des microscopes de dissection et des microscopes optiques. Nous avons besoin de bains-marie, d'un système d'alimentation membranaire pour moustiques et de centrifugeuses.Bonjour, je m'appelle ISH et je travaille dans le laboratoire du Dr George Depos. Je suis post-doctorante. Je m'appelle Lindsay Garver et je suis étudiante au doctorat.La première étape de l'infection par plasmide consiste à préparer la culture de plasmide. Si vous ne disposez pas d'un incubateur à dioxyde de carbone, vous pouvez utiliser un bocal à bougie dans lequel vous placerez la plaque à six puits contenant la culture en milieu GATO, puis vous allumerez la bougie avant de sceller le bocal. La première étape consiste également à disposer de sang humain frais et de sérum humain que vous placerez d'abord à 37 °C dans un bain-marie afin de les décongeler et de les réchauffer, car il est essentiel d'utiliser du sang et du sérum chauds.Pour préparer le sang, vous devez prélever un échantillon d'un animal contenant du sang humain frais dans un tube Eppendorf. Oui, le sang frais doit être centrifugé à 2000 tr/min pendant cinq minutes afin de séparer les érythrocytes. Une fois la centrifugation terminée, le surnageant clair doit être éliminé et les culots rouges, qui correspondent aux globules rouges (GR), doivent être lavés trois fois dans du sérum humain.Nous ajoutons un volume égal de sérum humain au culot, mélangeons le tout, puis centrifugeons à nouveau à 2000 tr/min pendant cinq minutes. Cette étape est répétée trois fois. Enfin, on obtient des culots de globules rouges prêts à être ajoutés à la culture ganote.Très bien, la culture de plasmodium, qui se trouve dans l'incubateur CO2, doit être maintenue dans un milieu RPMA pendant 16 jours, et au jour 16, elle est prête pour l'infection. Étant donné que nous travaillons avec le plasmodium, la culture doit faire l'objet de précautions à chaque étape. La première étape consiste à faire croître les parasites dans un laboratoire de niveau BC2, et cette opération doit être effectuée sous hotte. Toutes les pointes de pipette et tous les embouts, tout doit être jeté dans une boîte de déchets biologiques, et toutes les autres solutions, comme notre pipette, doivent être lavées à l’eau de javel à 10 %, et vous devez porter des gants. Pour la culture du jour 16, les blouses de laboratoire doivent prélever une petite goutte de sang sur une lame de verre, réaliser une frottis et effectuer une coloration, puis observer au microscope optique.Nous pouvons déterminer le pourcentage de GAMMAT à partir d'une culture de gamétocytes âgée de 16 jours. Retirez la majeure partie du milieu en prenant soin de ne pas déranger ni aspirer les parasites, qui se trouvent facilement au fond du puits. Transférez le reste du milieu et des parasites dans un tube. Mélangez les parasites dans les globules rouges à l’aide d’une pipette, puis transférez le mélange dans un tube centrifugeable pour une centrifugation à 2000 tr/min pendant cinq minutes.Après la centrifugation, les parasites sédimenteront avec les globules rouges. Le surnageant est le milieu RPMI, et au fond, le culot contient les parasites. Avec les GR, retirez le liquide, c'est-à-dire le RPMI.Il convient de manipuler le milieu avec précaution afin de ne pas perturber le parasite ni les globules rouges. Le pourcentage de GATOT, déterminé par les GIMs 10, se situe généralement entre 2 et 4 %. Une fois les globules rouges et les parasites prêts après la centrifugation, ils sont mélangés ensemble, et le volume de sang à ajouter est déterminé par le pourcentage final de GATOT. Ce dernier doit être précis et se situe habituellement entre 0,3 et 1 % ; c'est cette valeur qui sera utilisée pour l'alimentation des moustiques femelles.Pour l'infection par Presidium S, il s'agit d'un distributeur en verre que nous utilisons pour l'alimentation par membrane des moustiques. Nous introduisons le sang par le petit orifice que vous voyez, et il est contenu à l'intérieur. En bas sur le côté, se trouvent deux embouts qui sont reliés à notre bain d'eau, dont la température est de 37 degrés.Pour préparer le distributeur pour l'alimentation, nous prenons un petit morceau d'affil. Nous l'étirons à partir des deux extrémités sur chacun des quatre côtés, puis nous le plaçons sur le côté ouvert du distributeur en verre afin de former une fine membrane, simulant ainsi la peau. C'est ce qu'on appelle l'alimentation par membrane.Ceci est un bain-marie à circulation d'eau, qui maintient l'eau à 37 °C et fait circuler celle-ci à travers l'alimentateur en verre afin que le sang reste chaud à 37 °C. Nous raccordons donc l'alimentateur en verre aux petits capillaires, puis nous le connectons au bain-marie à circulation et nous mettons le bain en marche pour que l'eau circule. L'eau et le sang ne se mélangent jamais, car ils se trouvent dans deux chambres distinctes. Ceci est un petit récipient contenant des moustiques *Gambusia phis*.Pour commencer, l'alimenteur en verre est placé sur la cage et un poids est mis sur l'alimenteur en verre afin que la membrane, appelée phim, soit bien à fleur du filet métallique. Environ 200 microlitres de sang, contenant les parasites, avec le pourcentage requis de gambotto sont ajoutés à l'alimenteur, en veillant à ce que le sang descende complètement et que les moustiques puissent y accéder.L'ajustement dure environ 30 minutes. Une fois l'ajustement terminé, l'alimentateur en verre est soigneusement lavé à l'eau, puis à l'eau de javel à 10 %, et tous les membranes et rubans restants sont retirés et jetés dans une boîte de déchets biologiques. Après l'ajustement sanguin, les moustiques non gorgés doivent être séparés des moustiques gorgés.Pour ce faire, nous avons anesthésié les moustiques en plaçant les petits gobelets contenant les moustiques nourris au sang dans une chambre froide pendant cinq à dix minutes. Comme on peut le voir, les moustiques sont déjà immobilisés par le froid. Nous ouvrons le couvercle et transférons les moustiques dans une petite boîte de Pétri, placée sur un seau à glace afin qu’ils restent au froid tout au long de l’opération et ne puissent pas s’échapper.N'oubliez pas qu'il s'agit de moustiques infectés par le plasmodium, il faut donc prendre toutes les précautions nécessaires pour éviter qu'ils ne s'échappent. Une fois que les moustiques sont anesthésiés dans la chambre froide, nous les transférons vers l'insectarium habituel, qui est maintenu à température ambiante, mais nous plaçons toujours les moustiques dans une boîte en verre de Pétri, laquelle est conservée dans un seau à glace, afin qu'ils restent constamment anesthésiés. Vous pouvez voir comment les moustiques nourris peuvent être séparés de ceux qui ne le sont pas.Ceux qui se sont nourris ont du sang en eux. Ils sont complètement gorgés de sang. Certains se sont nourris partiellement de sang, ils ne sont donc pas complètement gorgés.Elles ont peu de sang dans l'abdomen, alors que d'autres en ont beaucoup. Celles de l'UNFI n'ont aucun sang dans l'abdomen, ce qui permet de distinguer facilement les individus nourris des non nourris. Illustrés ici, voici des moustiques femelles adultes ayant été nourris au sang ; nous allons donc transférer ces moustiques de la boîte de Pétri vers des gobelets en carton cerclés de cire.Après avoir placé les moustiques ayant ingéré du sang dans les gobelets, nous y avons mis un petit morceau de coton imbibé de sucrose à 10 % afin qu'ils puissent s'alimenter en sucrose à 10 % pendant les sept prochains jours d'incubation, ainsi qu'une petite serviette en papier pliée, afin de maintenir l'humidité à l'intérieur du gobelet, que nous avons recouvert d'une boîte de Pétri. Les moustiques infectés par le plasmodium sont placés dans une autre petite cage, qui doit présenter une double protection, puis la cage est placée dans un laboratoire de niveau de sécurité 3, maintenu à 27 degrés Celsius et à une humidité de 80 %, sept jours après l'ingestion de sang. Les moustiques, qui avaient été conservés dans l'insectarium, dans une boîte à double cage, sont sortis de l'insectarium et transférés dans une chambre froide pour assommer les moustiques.Une fois que les moustiques sont immobilisés, ils sont transférés dans une boîte de Pétri placée sur un seau à glace. Nous nous apprêtons maintenant à disséquer les moustiques. Nous disséquerons l'intestin moyen et rechercherons le kyste.La première étape consiste à ajouter cent microlitres de PBS sur une lame en verre placée sur un microscope stéréo. L'étape suivante consiste à utiliser une pince fine. Nous transférons un seul moustique depuis la boîte de Pétri vers le PBS, qui se trouve sur la lame en verre placée sur le microscope stéréo.Les autres restent encore sur la boîte de Pétri refroidie. Pour disséquer les moustiques, maintenez le thorax d'un moustique avec une des paires de pinces et l'abdomen postérieur avec une autre paire de pinces. Ensuite, tirez lentement sur la partie du corps jusqu'à ce que l'intestin moyen soit exposé.Il ressemble à une poche blanche ; à l’aide de pinces, retirez les tissus excédentaires et les autres parties du corps. Oui, c’est le tube digestif moyen, qui a l’aspect d’un corps sacculaire blanc, contenant l’os. Nous allons maintenant transférer ce tube digestif moyen dans une lame de verre à 12 puits et l’immerger dans 5 à 10 microlitres de micropro à 0,2 %, ce qui permettra de récupérer le tube digestif sur la lame.Avec la lame couvre-objet, nous effectuons cette étape pour tous les moustiques infectés. L'intestin présente une couleur rose vif, et nous transférons cette préparation au microscope optique afin de compter la charge de sporozoïtes. Nous observons maintenant l'intestin moyen disséqué à partir des moustiques infectés.L'intestin moyen a l'aspect d'un corps allongé, et avec la coloration rom, il présente une teinte légèrement rosée, tandis que les O SST doivent apparaître en rose vif par rapport au tissu intestinal pâle. Ces intestins moyens proviennent toutefois de moustiques infectés, mais ne montrent aucune SST, ils pourraient donc ne pas être infectés. Toutefois, si un intestin moyen avait été infecté, la S se présenterait comme un petit cercle rose vif, et il peut y avoir un grand nombre de ces éléments, allant parfois de 22 à 500, parfois même dans un seul et même intestin moyen.Cette procédure consistait à infecter du sang humain avec des parasites Plasmodium falciparum, à nourrir des moustiques Anopheles gambiens avec ce sang infecté, à disséquer l'intestin moyen de ces moustiques et à déterminer les concentrations d'OSIS dans ces intestins moyens infectés. Cette technique est importante car elle constitue la meilleure approximation possible de la transmission du paludisme humain que nous puissions reproduire en laboratoire.

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Une fois qu'un gène est identifié comme étant potentiellement réfractaires pour le virus de la dengue, il doit être évalué pour son rôle dans la prévention des infections virales dans le moustique. Ce protocole illustre la façon dont l'étendue des cas de dengue de moustiques peuvent être dosés. Les techniques pour cultiver le virus en culture, l'alimentation à membrane moustiques sang humain, et en dosant les titres viraux dans l'intestin moyen des moustiques sont démontrés.

Protocole pour la dengue dans les moustiques (Aedes aegypti) et détermination de phénotype d&#39;infection

Croisements génétiques des parasites du paludisme chez les rongeurs sont effectuées en alimentant deux des parasites génétiquement distinctes pour les moustiques. Recombinant progéniture clonée à partir de sang de souris après avoir laissé les moustiques de mordre des souris infectées. Cette vidéo montre comment produire des croisements...

Protocole pour la production d&#39;un croisement génétique des parasites du paludisme des rongeurs

Les moustiques transmettant le paludisme présentent un certain nombre de caractéristiques épidémiologiquement importantes qui ne peuvent être détectées qu’à l’aide de techniques moléculaires. À l’aide d’une plateforme de génotypage SNP basée sur MALDI-TOF, nous avons mis au point un test permettant de détecter simultanément plusieurs traits clés (espèce, résistance aux insecticides, infection parasitaire et choix de l’hôte) des vecteurs du paludisme.

Un dosage multi-détection pour moustiques vecteurs du paludisme

Nous décrivons un modèle murin de paludisme cérébral expérimental et montrons comment la pathologie inflammatoire et microvasculaire peut être suivie in vivo à l’aide de l’imagerie par résonance magnétique.

Le suivi in vivo du développement de l&#39;œdème et de la pathologie microvasculaire dans un modèle de paludisme cérébral expérimental utilisant l&#39;imagerie par résonance magnétique

En raison des similitudes frappantes entre le cycle de vie et la biologie des parasites du paludisme des rongeurs et les parasites du paludisme chez l'homme, les modèles de paludisme des rongeurs sont devenus indispensables à la recherche sur le paludisme. Ici, nous avons normalisé certaines des techniques les plus importantes utilisées dans l'analyse phénotypique des espèces de paludisme de rongeurs de type sauvage et transgénique.

Analyse phénotypique des stades du sang asexué et sexuel du parasite du paludisme des rongeurs et des stades des moustiques

Des études détaillées sur les stades des moustiques des parasites du paludisme sont essentielles pour concevoir des stratégies efficaces de blocage de la transmission. Ce protocole montre comment mettre en culture efficacement des gamétocytes infectieux, puis nourrir ces gamétocytes avec des moustiques pour générer des stades de moustiques de P. falciparum.

Plasmodium falciparum Culture de gamétocytes et infection par les moustiques par l’alimentation par membrane artificielle

Ce protocole décrit un test immuno-enzymatique sandwich pour détecter les sporozoïtes des glandes salivaires chez les moustiques. En utilisant des anticorps monoclonaux facilement disponibles, la méthode permet une détection rentable et à haut débit des moustiques porteurs de Plasmodium falciparum ou de Plasmodium vivax. La méthode convient à la recherche sur la transmission du paludisme, y compris les enquêtes vectorielles.

Détection de sporozoïtes de Plasmodium chez les anophèles à l’aide d’un test immuno-enzymatique

Le test standard d’alimentation membranaire (SMFA) est considéré comme l’étalon-or pour l’évaluation et l’identification de composés antipaludiques potentiels. Ce système d’alimentation artificiel est utilisé pour infecter les moustiques afin d’évaluer davantage les effets de ces composés sur l’intensité et la prévalence du parasite Plasmodium falciparum .

Dosage standard d’alimentation par membrane pour la détection de l’infection à Plasmodium falciparum chez les moustiques vecteurs anophèles

Le paludisme est transmis par l’inoculation du stade sporozoïte de Plasmodium par des moustiques infectés. Le plasmodium transgénique nous a permis de mieux comprendre la biologie du paludisme et a contribué directement aux efforts de développement d’un vaccin contre le paludisme. Nous décrivons ici une méthodologie simplifiée pour générer des sporozoïtes transgéniques de Plasmodium berghei .

Génération de sporozoïtes génétiquement modifiés à Plasmodium berghei

La génétique chimique implique la substitution d’un résidu gardien par un acide aminé contenant une chaîne latérale différente au locus cible. Ici, nous avons généré un parasite mutant contenant un allèle hypomorphe de cdpk1 et identifié des voies compensatoires adoptées par le parasite dans le fond mutant.

Comprendre le développement de voies compensatoires chez un parasite mutant du paludisme hébergeant un allèle hypomorphe de kinases ressemblant à des plantes

Le développement sexuel de Plasmodium se produit dans l’intestin moyen du moustique. Cibler les stades sexuels du parasite est une stratégie prometteuse pour bloquer la transmission. Nous avons développé Ookluc, un P. berghei transgénique exprimant la nanoluciférase après la formation de zygotes, permettant un criblage à haut débit de composés bloquant la transmission. Cet article détaille les méthodes de dépistage à l’aide d’Ookluc.

Ookluc : une ligne de Plasmodium berghei pour l’identification des composés bloquant la transmission

Découvrez le protocole d'infection de moustiques Anopheles gambiae par Plasmodium falciparum et l'évaluation du phénotype infectieux dans l'intestin moyen. Cette méthode permet d'étudier la transmission du paludisme.

Protocole pour les infections à Plasmodium falciparum dans la détermination Phénotype moustiques et les infections

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