Plates-formes pour la culture cellulaire microfabriqués mécanique dynamique

L'objectif général de l'expérience suivante est de microfabriquer des dispositifs utilisés pour stimuler mécaniquement des cellules dans des environnements de culture bidimensionnels et tridimensionnels. Cela est réalisé en utilisant une technique de moulage et d'empilement multicouche en sandwich pour produire un réseau de micro-piliers activés verticalement. Dans une deuxième étape, le réseau de micro-piliers activés verticalement est modifié afin d'étirer un film de culture, ce qui applique des déformations bien contrôlées aux cellules cultivées sur ce film.

Alternativement, le dispositif peut être modifié afin de comprimer des constructions de biomatériaux microstructurés afin d'appliquer une stimulation mécanique aux cellules. Des résultats obtenus à partir de cultures réalisées dans un réseau de gels hydrogels tridimensionnels montrent l'application simultanée d'une gamme de contraintes biaxiales équibiaxiales bidimensionnelles et de contraintes de compression tridimensionnelles à travers le dispositif, basée sur l'analyse d'image de marqueurs fluorescents de repère. Bonjour, je suis Chris Mariahs des laboratoires de Craig Simmons et U Sun du Département de génie mécanique et industriel ainsi que de l'Institut des biomatériaux et du génie biomédical de l'Université de Toronto.

Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure permettant de fabriquer des microdispositifs utilisés pour stimuler mécaniquement des cellules. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la manière dont les cellules réagissent à diverses forces mécaniques en culture in vitro. Commençons donc.

Le processus de fabrication d'un moule en sandwich consiste à placer une feuille de rétroprojection sur du polydiméthylsiloxane (PDMS) non polymérisé déposé sur un maître en SU-8. L'ensemble en sandwich est placé dans un empilement de verre, de mousse et de métal, puis polymérisé dans une étuve sous compression. Enfin, l'empilement est démonté et la feuille de rétroprojection est décollée, laissant une couche de PDMS conservant le motif.

Pour commencer ce processus, mélangez soigneusement le PDMS, le monomère et l'agent de réticulation. Dans le rapport standard de 10 à 1, déposez trois millilitres du mélange de PDMS non durci sur un moule SU-8 préalablement fabriqué et polymérisez les DGA dans une chambre à vide. Ensuite, placez le tampon en mousse et le moule SU-8 sur une plaque de base en plexiglas.

Abaissez soigneusement le côté lisse d'une transparence jet d'encre sur le PDMS non durci, en veillant à ne pas emprisonner de bulles d'air. Placez ensuite une lame de verre silanisée au-dessus de la transparence, sous le deuxième tampon en mousse et une plaque supérieure en plexiglas. Serrez l'ensemble à l'aide d'une pince en C.

Polymériser le sandwich en PDMS dans un four à 80 degrés Celsius pendant au moins quatre heures. Après polymérisation, retirer le sandwich du four et le laisser refroidir. Une fois refroidi, retirer le serre-joint et démonter le sandwich.

Détachez soigneusement la transparence du maître SU-8 en conservant le film de PDMS du brevet. Taillez les bords du film de motif pour éliminer l'excès de PDMS et stockez les couches de motif dans un environnement exempt de poussière jusqu'à ce qu'elles soient prêtes à être utilisées. La partie suivante de ce protocole concerne la construction d'un réseau microfabriqué de plots actionnés verticalement.

Un procédé de fabrication multicouche est nécessaire pour réaliser le réseau de micro-piliers. La couche inférieure de PDMS structurée est préparée par une fabrication de moule en sandwich. Pour ces expériences, des motifs circulaires de diamètre compris entre 600 et 1 200 microns ont été utilisés.

Pour transférer la couche de PDMS sur une lame de verre propre, utilisez une unité de décharge Corona afin de traiter les surfaces de PDMS et de verre avec du plasma d'oxygène. Ensuite, mettez les deux surfaces en contact l'une avec l'autre. Placez l'empilement sur une plaque chauffante à 80 degrés Celsius pendant 10 minutes pour finaliser le processus d'assemblage.

Détachez délicatement la transparence et jetez-la. Ce processus garantit que le film de PDMS structuré n'est jamais libéré d'un substrat rigide, ce qui empêche le rétrécissement des couches individuelles. La deuxième couche moulée en sandwich est formée comme un moule réplique négative de la structure souhaitée de diaphragme et de piliers.

Dans cette démonstration, des plots circulaires de 500 microns de diamètre ont été utilisés pour former cette couche. Tout d'abord, fixez temporairement le moule réplique négatif sur une lame de verre à l’aide d’un ruban adhésif double face et silanisez-le dans un dessiccateur sous vide. Déposez du PDMS non durci sur le sandwich, sur la couche du moule, dégazez et appliquez un revêtement par centrifugation pendant 45 secondes à 1000 tours par minute, obtenant ainsi une membrane d’actionnement de 60 microns d’épaisseur. Partiellement durcissez la couche de PDMS par centrifugation à 80 degrés Celsius pendant environ 20 minutes, ou jusqu’à ce que le PDMS soit collant mais ne se déforme pas de façon permanente. Une fois cette étape atteinte, retirez la lame de verre et le ruban adhésif double face de la couche de PDMS partiellement durcie, puis fixez le film transparent sur une paire de lames de verre de manipulation et soumettez-le au plasma.

Traitez le PDMS partiellement polymérisé, puis retournez le PDMS et placez-le dans un aligneur sur mesure. L'aligneur est constitué d'un plateau sous vide fixé sur un micromanipulateur. Ensuite, soumettez la première couche de PDMS à un traitement plasma, puis placez-la sur une platine tournante située sous le plateau sous vide.

Observer l'alignement entre les deux couches à l'aide d'un système de vision industrielle avec un grossissement de 12 fois. À l'aide du manipulateur, aligner les couches et les rapprocher délicatement au contact. Appliquer une légère pression avec un doigt pour coller les couches ensemble.

Ensuite, retirez le sandwich de l'aligneur. Retirez les lames de manipulation en verre et assurez-vous que les couches sont en contact complet l'une avec l'autre. Faites durcir au four à 80 degrés Celsius pendant 30 minutes supplémentaires.

Après 30 minutes, le moule en PDMS transparent et en réplique silonisée peut être décollé du dispositif et mis au rebut. Le dispositif est ensuite complètement polymérisé à 80 degrés Celsius pendant au moins quatre heures afin de réaliser des expériences sur des cellules cultivées sur un substrat déformable en deux dimensions. Le réseau de micro-actionneurs est modifié par collage d'une troisième couche de PDMS au dispositif.

La troisième couche de PDMS est constituée d'une structure en deux couches. Le cercle inférieur correspond à la taille de la cavité d'activation située sous les micro-piliers activés. Le diamètre du cercle supérieur est supérieur de 100 microns à celui des piliers de chargement.

Un microcanal de 200 micromètres de large relie ces éléments à une zone de connexion et sera utilisé pour lubrifier les poteaux de chargement et le film de culture. Pour modifier le dispositif en vue d'une culture en 2D, fabriquez et liez d'abord les connecteurs selon les instructions du protocole écrit. Ensuite, appliquez par rotation une couche de 10 à 15 micromètres de PDMS sur le côté lisse d'une transparence et faites-la polymériser.

Le film mince de PDMS à 80 degrés Celsius pendant au moins quatre heures. L'étape suivante consiste à appliquer un vide sur les actionneurs et à lier la couche de PDMS au dispositif. Pour y parvenir.

Tout d'abord, appliquez un vide de faible intensité sur les actionneurs afin d'abaisser le réseau de piliers, de traiter au plasma et d'assurer le collage. Comme décrit dans le protocole écrit, recouvrez par centrifugation le film de PDMS sur le dispositif micro-actionné ; les piliers et le film de culture resteront hydrophiles pendant une courte durée. Ensuite, reliez la seringue de lubrifiant au dispositif et remplissez les canaux de lubrification avec une solution contenant 90 % de glycérine dans de l'eau déionisée.

En plus de la lubrification, cette formulation maintient indéfiniment l'hydrophilicité du PDMS, réduisant ainsi les coefficients de friction. Placez le dispositif sur un bloc chauffant à 40 degrés Celsius et continuez à injecter du lubrifiant dans le canal, ce qui provoque une légère augmentation de pression. Après quelques minutes, les bulles d'air se diffusent à travers le PDMS et toutes les surfaces sont lubrifiées.

Pour la dernière étape, retirez la pression négative en libérant les piliers à l’aide d’un scalpel. Découpez autour du fin film de PDMS. Détachez soigneusement le support transparent du lien plasma du dispositif.

Un joint en PDMS découpé à la main autour de la zone de culture du dispositif. Stériliser le dispositif en le faisant tremper dans de l'éthanol à 70 % pendant cinq minutes, puis en le traitant sous une lumière UV germicide dans une hotte de sécurité biologique pendant 45 minutes. Traiter la surface au plasma et l'incuber avec du collagène à 100 microgrammes par millilitre toute la nuit à quatre degrés Celsius.

Après une incubation nocturne, laver le dispositif avec une solution saline tamponnée au phosphate stérile ou PBS et ensemencer les cellules à raison de 10 à 15 000 cellules par centimètre carré. Selon les protocoles standards de culture cellulaire, le réseau de micro-actionneurs peut être modifié pour réaliser des expériences sur des cellules cultivées dans des hydrogels tridimensionnels structurés par photomarquage. Premièrement, une plateforme multicouche à base de PDMS est fabriquée.

Après avoir recouvert la plateforme de base d'un méthacrylate, une solution précurseur d'hydrogel sur une lame de verre apparentée est injectée. Ensuite, un biomatériau photo-polymerisable est microstructuré en réseau, puis la solution précurseur résiduelle est éliminée par rinçage. Le réseau de piliers de chargement actionnés verticalement peut alors être utilisé pour appliquer des forces mécaniques de compression à des cellules cultivées dans des biomatériaux tridimensionnels, en utilisant des morceaux de ruban adhésif Scotch pour masquer les zones entourant les piliers, puis en recouvrant le dispositif de paraline C dans un système PDS 2010 Lab COTER deux.

Cela améliorera la cinétique de polymérisation pour le système de biomatériau. Une fois revêtu, retirez le dispositif du système de revêtement et décollez le ruban adhésif, en laissant une couche conforme de paraline C recouvrant les piliers. Ensuite, silanisez la lame de verre au méthacrylate par immersion dans une solution à 2 % en volume de triméthoxypropylméthacrylate dans 95 % d'éthanol pendant deux minutes.

Rincez la lame. Immergez dans de l'éthanol à 100 %, puis faites cuire à 100 degrés Celsius, laissant des groupes méthacrylates à la surface. Déposez un espaceur en PDMS d'une épaisseur de 200 microns.

Film dans une boîte de Pétri et découpé en petits morceaux. Liaison au plasma de quatre de ces petits morceaux autour du bord de la lame couvre-objet liée au meac. Puis liaison au plasma des espaces aux zones PDMS du dispositif recouvrant le Lene C revêtu.

Stérilisez enfin le dispositif en le rinçant à l'éthanol 70 % et en l'exposant à un agent germicide ou à une lumière UV dans une hotte de sécurité biologique pendant 45 minutes. Pour façonner par photolithographie les hydrogels de PEG chargés de cellules à l'intérieur des dispositifs, préparez les solutions de précurseur et d'amorceur photo comme décrit dans le protocole écrit, puis mélangez-les soigneusement afin d'obtenir une solution contenant 0,4 % poids par volume d'amorceur photo.

Filtrez le mélange à l’aide d’un filtre à seringue de 0,45 micron pour stériliser et éliminer les particules, les cellules traitées à la trypsine, puis préparez une suspension cellulaire dans le milieu de culture à une concentration deux fois supérieure à la concentration cellulaire finale souhaitée. Mélangez ensuite la suspension cellulaire et la solution filtrée de précurseur d’hydrogel avec son initiateur photochimique en rapport égal (1:1). Injectez la solution dans le microdispositif à l’aide d’une aiguille longue de calibre 25.

Veillez soigneusement à ne pas emprisonner de bulles dans le dispositif. Alignez un masque de transparence imprimé sur les repères d'alignement situés à la surface du dispositif. Configurez un système d'illumination UV afin de fournir une dose UV de 365 nanomètres d'une intensité de 17,5 milliwatt par centimètre carré à la surface du dispositif.

Illuminez l'hydrogel à travers le masque pendant 195 secondes après l'illumination. Rincez la solution précursrice d'hydrogel non polymérisée avec du PBS et remplacez le PBS par du milieu de culture. Actionnez les piliers de chargement pour comprimer les dispositifs d'hydrogel. Ici, un dispositif-échantillon complet pour une culture mécanostimulatoire en 2D est présenté.

Le colorant rouge est utilisé pour marquer les canaux de distribution de la pression d'actionnement et le bleu D est utilisé pour marquer les canaux de lubrification lors de la caractérisation de la déformation. Des expériences peuvent être menées pour déterminer les champs de déformation appliqués en suivant le déplacement de billes fluorescentes sur les substrats. Les points rouges représentent la position initiale des billes, tandis que les points verts indiquent les positions déformées.

Un dispositif type pour des expériences de compression tridimensionnelles est montré ici, où un colorant vert est utilisé pour marquer les canaux de pression d'activation. La vue de dessus du réseau de micro-piliers révèle le motif du construct en hydrogel placé au-dessus des images reconstruites en coupe des billes fluorescentes présentes dans le construct en hydrogel. Les états au repos et sous une pression d'activation de 55 kilopascals illustrent le processus de caractérisation de la déformation dans un système de culture tridimensionnel.

Nous venons donc de vous montrer comment fabriquer des dispositifs utilisés pour stimuler mécaniquement des cellules dans des systèmes de culture bidimensionnels ou tridimensionnels. Lors de cette procédure, il est important de garder vos dispositifs aussi propres et exempts de poussière que possible, et de faire preuve de patience, notamment pendant les étapes d'alignement. Voilà, c'est terminé.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.