Plates-formes pour la culture cellulaire microfabriqués mécanique dynamique

L’objectif global de l’expérience suivante est de micro-fabriquer des dispositifs utilisés pour stimuler mécaniquement des cellules dans des environnements de culture bidimensionnels et tridimensionnels. Ceci est réalisé en utilisant une technique de moulage et d’empilage en sandwich multicouche pour produire un ensemble de micro-poteaux actionnés verticalement. Dans un deuxième temps, le micro-réseau de tenons actionnés verticalement est modifié pour étirer un film de culture, qui applique des souches bien contrôlées aux cellules cultivées sur le film.

Alternativement, le réseau peut être modifié pour comprimer des constructions de biomatériaux à micro-motifs afin d’appliquer une stimulation mécanique aux cellules. Cultivés dans un réseau d’hydrogels tridimensionnels, des résultats sont obtenus qui montrent l’application simultanée d’une gamme de déformations d’écho biaxiales et de compression tridimensionnelles à travers le réseau sur la base de l’analyse d’images de marqueurs fiduciaires fluorescents. Bonjour, je m’appelle Chris Mariahs et je travaille dans les laboratoires de Craig Simmons et U Sun du Département de génie mécanique et industriel et de l’Institut des biomatériaux et du génie biomédical de l’Université de Toronto.

Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure de fabrication de micro-dispositifs utilisés pour stimuler mécaniquement les cellules. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier comment les cellules réagissent à diverses forces mécaniques en culture in vitro. Alors commençons.

Le processus de fabrication de moules sandwich comprend l’installation d’un transparent aérien sur du poly diméthyl Sloane ou PDMS non durci sur un master SU huit. Le sandwich est placé dans une pile de verre mousse et de métal et durci dans un four sous compression. Enfin, la pile est démontée et la transparence est décollée en conservant la couche PDMS à motifs.

Pour bien commencer ce processus, mélangez le PDMS, le monomère et le réticulant. Dans le rapport standard de 10 pour un, déposez trois millilitres de mélange PDMS non durci sur un maître SU huit préalablement fabriqué et le polymère DGAs dans une chambre à vide. Placez ensuite le tampon en mousse et le SU eight master sur une plaque de base en plexiglas.

Abaissez soigneusement le côté lisse d’un transparent à jet d’encre sur le PDMS non polymérisé, en veillant à ne pas piéger de bulles d’air. Positionnez ensuite une lame en verre siloisé sur le transparent sous le deuxième tampon en mousse et une plaque supérieure en plexiglas. Fixez le sandwich à l’aide d’une pince en C.

Faites durcir le sandwich PDMS dans un four à 80 degrés Celsius pendant au moins quatre heures. Après l’affinage, sortez le sandwich du four et laissez-le refroidir. Une fois refroidi, retirez la pince et démontez le sandwich.

Décollez soigneusement la transparence du SU eight master en conservant le film PDMS breveté. Coupez les bords du film de motif pour éliminer l’excès de PDMS, stockez les couches de motif dans un environnement sans poussière jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à l’emploi. La prochaine partie de ce protocole implique la construction d’un réseau micro-fabriqué de poteaux actionnés verticalement.

Un processus de fabrication multicouche est nécessaire pour fabriquer la gamme de micro-poteaux. La couche PDMS la plus basse est préparée par la fabrication d’un moule sandwich. Pour ces expériences, des motifs circulaires allant de 600 à 1 200 microns de diamètre ont été utilisés.

Afin de transférer la couche PDMS sur une lame de verre propre, utilisez une unité de décharge Corona pour traiter le PDMS et les surfaces en verre avec du plasma d’oxygène. Placez ensuite les deux surfaces en contact l’une avec l’autre. Placez la pile sur une plaque chauffante à 80 degrés Celsius pendant 10 minutes pour terminer le processus de collage.

Décollez la transparence et jetez-la. Ce processus garantit que le film PDMS à motifs n’est jamais libéré d’un substrat rigide, ce qui empêche le rétrécissement des couches individuelles. La deuxième couche moulée en sandwich est formée comme une réplique négative du diaphragme et de la structure de poteau souhaités.

Dans cette démonstration, des poteaux circulaires de 500 microns de diamètre ont été utilisés pour former cette couche. Tout d’abord, fixez temporairement le moule de réplique négative sur une lame de verre à l’aide de ruban adhésif double face et siloisez-le dans un dépôt de dessiccation sous vide sur le sandwich, la couche de moule, le dégazage et la couche d’essorage pendant 45 secondes À 1000 rotations par minute donnant un diaphragme d’actionnement de 60 microns d’épaisseur, durcissez partiellement la couche PDMS enduite de centrifugation à 80 degrés Celsius pendant environ 20 minutes ou jusqu’à ce que le PDMS soit collant mais ne se déforme pas de façon permanente. Au toucher, retirez la lame de verre et le ruban adhésif double face de la couche PDMS partiellement durcie et le film transparent fixez-le sur une paire de lames de manipulation de verre et de plasma.

Traitez le PDMS partiellement polymérisé, puis inversez le PDMS et placez-le dans une gouttière sur mesure. L’aligneur se compose d’un mandrin à vide monté sur un micromanipulateur. Ensuite, traitez au plasma la première couche de PDMS, puis placez-la sur une platine rotative sous le mandrin à vide.

Observez l’alignement entre les deux couches avec un système de vision industrielle à zoom 12 fois d’avatar. À l’aide du manipulateur, alignez les couches et mettez-les soigneusement en contact. Appliquez une légère pression avec un doigt pour coller les couches ensemble.

Retirez ensuite le sandwich de la gouttière. Retirez les lames de manipulation en verre et assurez-vous que les couches sont en contact les unes avec les autres. Durcissement d’un four à 80 degrés Celsius pendant 30 minutes supplémentaires.

Après 30 minutes, la réplique transparente et siloisée du moule PDMS peut être décollée de l’appareil et jetée. Le dispositif est ensuite complètement durci à 80 degrés Celsius pendant au moins quatre heures pour mener des expériences sur des cellules cultivées sur un substrat bidimensionnel déformant. Le réseau de micro-actionneurs est modifié en liant une troisième couche PDMS à l’appareil.

La troisième couche PDMS se compose d’une structure à deux couches. Le cercle inférieur correspond à la taille de la cavité d’actionnement sous les micro-poteaux actionnés. Le diamètre du cercle supérieur est supérieur de 100 microns au diamètre des poteaux de chargement.

Un micro-canal de 200 microns de large relie ces éléments à une zone de connexion et sera utilisé pour lubrifier les poteaux de chargement et le film de culture. Pour modifier le dispositif pour la culture 2D, fabriquez d’abord et collez les connecteurs comme décrit dans le protocole écrit. Ensuite, appliquez une couche de 10 à 15 microns de PDMS sur le côté lisse d’un durcissement en transparence.

Le film mince PDMS à 80 degrés Celsius pendant au moins quatre heures. L’étape suivante consiste à appliquer un vide aux actionneurs et à lier la couche PDMS à l’appareil. Pour ce faire.

Tout d’abord, appliquez un vide de bas niveau aux actionneurs en abaissant le réseau de poteaux de traitement et de liaison au plasma. Le film PDMS enduit par centrifugation sur le micro-dispositif actionné comme décrit dans le protocole écrit, les tenons et le film de culture resteront hydrophiles pendant une courte période. Connectez ensuite la seringue de lubrifiant à l’appareil et remplissez les canaux de lubrification avec une solution d’eau déminéralisée à 90 % de glycérol.

En plus de la lubrification, cette formulation maintient l’hydrophilie du PDMS en réduisant indéfiniment les coefficients de frottement. Placez l’appareil sur une plaque chauffante à 40 degrés Celsius et continuez à injecter du lubrifiant dans le canal, provoquant une légère augmentation de pression. Après quelques minutes, les bulles d’air se sont diffusées à travers le PDMS et toutes les surfaces seront lubrifiées.

Pour la dernière étape, retirez la pression négative en libérant les tenons à l’aide d’un scalpel. Coupez autour de la fine pellicule PDMS. Retirez délicatement le support transparent de la liaison plasma de l’appareil.

Un joint PDMS découpé à la main autour de la zone de culture du dispositif. Stérilisez l’appareil en le trempant dans de l’éthanol à 70 % pendant cinq minutes, suivi d’un traitement sous une lumière UV germicide dans une enceinte de sécurité biologique pendant 45 minutes. Plasma, traitez la surface et incubez avec 100 microgrammes par millilitre de collagène pendant la nuit à quatre degrés Celsius.

Après une nuit d’incubation, laver l’appareil avec une solution saline tamponnée au phosphate stérile ou PBS et des cellules de semence à 10 à 15 000 cellules par centimètre carré. Suivant les protocoles standard de culture cellulaire, le réseau de micro-actionneurs peut être modifié pour mener des expériences sur des cellules cultivées dans des constructions d’hydrogel tridimensionnelles à motifs photographiques. Tout d’abord, une plate-forme multicouche basée sur PDMS est fabriquée.

Après avoir recouvert la plate-forme de base d’un méthamphétamine, une solution de précurseur d’hydrogel est injectée. Ensuite, un biomatériau réservable en photopolymère est micro-structuré dans le réseau et la solution précurseur restante est évacuée. L’ensemble de poteaux de chargement actionnés verticalement peut ensuite être utilisé pour appliquer des forces mécaniques de compression à des cellules cultivées dans des biomatériaux tridimensionnels avec des morceaux de scotch masquant les zones autour des poteaux et recouvrir le dispositif de paraligne C dans un système PDS 2010 lab COTER two.

Cela améliorera la cinétique de polymérisation du système de biomatériaux. Une fois enduit, retirez l’appareil du système de revêtement et décollez le scotch, en laissant une couche conforme de paraligne C sur les poteaux. Ensuite, la couche de verre ACRL de méthamphétamine est immergée dans une solution à 2 % volume par volume de méthacrylate à profil oxy trithèze dans de l’éthanol à 95 % pendant deux minutes.

Rincez la housse. Glissez-y 100 % d’éthanol, puis faites cuire à 100 degrés Celsius, en laissant des groupes méthacrylate à la surface. Coulez une entretoise PDMS de 200 microns d’épaisseur.

Filmez dans une boîte de Pétri et coupez-le en petits tronçons. Liaison plasma quatre de ces petites sections autour du bord de la lamelle liée au meac. Ensuite, le plasma lie les espaces aux zones PDMS de l’appareil recouvrant le revêtement Lene C.

Enfin, stérilisez l’appareil en le lavant à 70 % d’éthanol et exposez-le à un germicide ou à une lumière UV dans une enceinte de sécurité biologique pendant 45 minutes. Pour photographier lithographiquement les hydrogels PEG chargés de cellules dans les appareils. Préparez les solutions de précurseur et de photo-initiateur comme décrit dans le protocole écrit et mélangez-les soigneusement pour obtenir une solution avec une concentration de 0,4 % en poids par volume de photo-initiateur.

Filtrez le mélange à travers un filtre à seringue de 0,45 micron pour stériliser et éliminer les particules, trypsine glace cultures cellulaires et préparer une suspension cellulaire dans un milieu de culture à deux fois la concentration cellulaire souhaitée. Mélangez ensuite la suspension cellulaire et la solution de photo-initiateur de précurseur d’hydrogel filtré dans un rapport de un à un. Injectez la solution dans le microdispositif à l’aide d’une longue aiguille de calibre 25.

Évitez soigneusement de coincer des bulles dans l’appareil. Alignez un masque transparent imprimé sur les marques d’alignement sur la surface de l’appareil. Configurez un système d’éclairage UV pour fournir une dose d’UV de longueur d’onde de 365 nanomètres de 17,5 milliwatts par centimètre carré à la surface de l’appareil.

Illuminez l’hydrogel à travers le masque pendant 195 secondes après l’allumage. Laver la solution de précurseur d’hydrogel non polymérisée avec du PBS et remplacer le PBS par un milieu de culture, actionner les poteaux de chargement pour comprimer les constructions d’hydrogel. Ici, un dispositif d’échantillonnage complet pour la culture mécano-stimulatrice 2D est présenté.

Le colorant rouge est utilisé pour marquer les canaux de distribution de la pression d’actionnement et le D bleu est utilisé pour marquer la caractérisation de la déformation des canaux de lubrification. Les expériences peuvent être utilisées pour déterminer les champs de déformation appliqués en suivant le mouvement des billes fluorescentes sur les substrats. Les taches rouges représentent l’emplacement non formé des perles tandis que les taches vertes représentent les emplacements déformés.

On peut voir ici un exemple de dispositif pour des expériences de compression tridimensionnelles où un colorant vert est utilisé pour marquer les canaux de pression d’actionnement. La vue de haut en bas du réseau de micro-poteaux révèle la construction en hydrogel modelée sur le dessus du côté du poteau, des images reconstruites de billes fluorescentes dans la construction en hydrogel. Au repos et à des pressions d’actionnement de 55 kilopascals démontrent le processus de caractérisation des souches dans un système de culture tridimensionnel.

Nous venons donc de vous montrer comment fabriquer des dispositifs utilisés pour stimuler mécaniquement les cellules dans des systèmes de culture bidimensionnels ou tridimensionnels. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de garder vos appareils aussi propres et exempts de poussière que possible et d’être patient, en particulier pendant les étapes d’alignement. Donc c’est tout.

Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.