Name: 免费接驳适应，文化和传代使用完整的基因敲除血清替代馈线中的人类iPS细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: 学习使用完全KnockOut血清替代无饲养层培养基将人类诱导多能干细胞适应并维持于无饲养层培养条件的方法。该技术可提高细胞培养的一致性和效率，适用于干细胞生物学研究。

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注意：为保持无菌培养条件，本方案中的所有操作均需采用无菌实验室技术，并在超净工作台内进行。
开始之前，确保所有培养基已平衡至 37°C 并适当充气。
制备Geltrex包被的培养皿
注意：有关 CELLstart 包被培养皿的使用，请参见附录
<ol>
 <li>在 2-8°C 条件下缓慢解冻一管 Geltrex（1 mL），并用 99 mL Knockout D-MEM/F-12 以 1:100 的比例稀释。轻轻混匀溶液。 
 
 注意：某些 iPS 细胞系可能需要不同的 Geltrex 稀释比例以获得最佳生长效果。替代稀释比例请参见附录。</li>
 <li>用 Geltrex 溶液覆盖每块培养皿的整个表面（35 mm 培养皿使用 1 mL，60 mm 培养皿使用 1.5 mL）。</li>
 <li>用封口膜密封每块培养皿以防止干燥，并在 37°C 下孵育 1 小时。 
 
 注意：此时可将包被了 Geltrex 的培养皿密封后于 4°C 保存，最长可达 1 个月。请用封口膜密封每块培养皿，以防止 Geltrex 干燥。</li>
 <li>使用前，将 Geltrex 包被的培养皿转移至超净工作台，并使其平衡至室温（约 1 小时）。</li>
</ol>
配制完全 KnockOut SR 无饲养层培养基
<ol>
 <li>为配制 1 mL 浓度为 10 μg/mL 的碱性成纤维细胞生长因子（Basic FGF）溶液，无菌操作混合以下所列组分。分装溶液后于 -20°C 保存，可稳定长达 6 个月。 
 
 <table border="0">
 <tbody>
 <tr>
 <td>碱性成纤维细胞生长因子（Basic FGF）</td>
 <td>10 μg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>D-PBS</td>
 <td>990 μL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10% BSA</td>
 <td>10 μL</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 
 
 注：BSA 可以相同浓度的 HSA 或 Knockout SR 替代。</li>
 <li>为配制 50 mL 浓度为 2 mg/mL 的 Dispase 溶液，无菌操作混合以下所列组分。过滤除菌后于 4°C 保存，可稳定长达 2 周。 
 
 <table border="0">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Dispase</td>
 <td>100 mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>D-PBS</td>
 <td>50 mL</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 </li>
 <li>为无菌配制 100 mL 完全型 KnockOut SR 无饲养层（KSR-FF）培养基，请将下表所列组分无菌混合。 
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>组分</td>
 <td>储存浓度</td>
 <td>终浓度</td>
 <td>体积 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Knockout DMEM/F12（货号：12660-012）</td>
 <td>-</td>
 <td>1X</td>
 <td>76.8 mL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GlutaMAX-I（货号：35050-061）</td>
 <td>200 mM</td>
 <td>2 mM</td>
 <td>1 mL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KnockOut SR（货号：10828-028）</td>
 <td>-</td>
 <td>20%</td>
 <td>20 mL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KnockOut SR-GFC（货号：A10580-01）</td>
 <td>50X</td>
 <td>1X</td>
 <td>2 mL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>bFGF（货号：PHG0024）</td>
 <td>10 μg/mL</td>
 <td>20 ng/mL</td>
 <td>200 μL</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
KSR-FF 培养基可在 2–8°C 保存，最长可稳定 1 周。</li>
<li>在将完全培养基预平衡至所需温度和气体条件前，无菌加入适量 2-巯基乙醇（储存液浓度为 55 mM），使其终浓度为 0.1 mM。例如，配制 100 mL KSR-FF 培养基时，加入 182 μL 的 55 mM 2-巯基乙醇（1:550 稀释）。或者，也可在配制完成的 1X 培养基中加入 2-巯基乙醇，并于 2–8°C 保存，最长可稳定 1 周。</li>
</ol>
将iPSCs适应于KSR-FF培养基
<ol>
 <li>开始前，将已包被Geltrex的培养皿置于生物安全柜中，平衡至室温。</li>
 <li>在MEF饲养层细胞上培养iPSCs，直至细胞融合度达到70-80%。有关基于MEF的培养方案，请参阅GIBCO小鼠胚胎成纤维细胞手册。</li>
 <li>将所需体积的Dispase置于37 °C水浴中预热。所需体积详见下表1。</li>
 <li>将所需体积的KSR-FF在37°C水浴中预平衡15分钟。所需体积详见下表1。</li>
 <li>吸除培养皿中的培养基，加入适量Dispase溶液。将培养皿在37°C孵育3-5分钟。</li>
 <li>吸除各培养容器中的Dispase溶液，并用D-PBS轻轻冲洗去除MEF饲养层细胞（2至3次）。</li>
 <li>向每个培养容器中加入适量完全KnockOut SR培养基。使用细胞刮或5 mL移液器轻轻刮下细胞。 
 
 注：难适应的iPS细胞系的替代适应方案见附录。</li>
 <li>将每个培养皿中的细胞悬液收集至独立的15 mL锥形管中。用适量完全KnockOut SR培养基冲洗每个培养容器，并将D-PBS冲洗液加入含有细胞悬液的15 mL锥形管中。注意避免将细胞团块分散为单细胞。</li>
 <li>以200 x g离心5分钟，使iPSCs沉淀。</li>
 <li>吸除iPSC沉淀的上清液。根据传代比例（见表1），用适量KSR-FF培养基重悬细胞沉淀。不要将细胞团块进一步打碎至更小尺寸，因为较小的团块难以有效贴附于培养表面。 
 
 注：我们建议iPSCs从iPSC MEF培养基直接传代至KSR-FF培养基后的前3代采用1:2的传代比例。通常1:3至1:5的传代比例是合适的，但以1:2传代可确保无饲养层培养适应过程中所需的较高细胞密度。</li>
 <li>在将iPSCs接种至Geltrex包被的培养皿前，吸除预包被培养皿中残留的Geltrex溶液，并缓慢向每个培养皿中加入适量细胞悬液。注：接种前切勿冲洗培养皿。</li>
 <li>将培养皿前后左右轻轻晃动数次，使细胞均匀分布于培养皿表面。轻柔地将培养皿放入37°C、含4至6% CO2的湿化培养箱中。每天更换为新鲜KSR-FF培养基。</li>
</ol>
使用无饲养层KSR培养基传代人iPS细胞
<ol start="13">
 <li>在显微镜下观察在完全KSR-FF培养基中生长的人iPSCs，确认细胞融合度达到70-80%，已准备好进行传代培养。参见图1。 
 
 注意：如果克隆过于密集或过大，将导致分化程度增加。</li>
 <li>在传代培养前，切除并移除任何已分化的iPSC克隆。</li>
 <li>将所需体积的Dispase置于37 °C水浴中预热。所需体积的详细信息请参见下表1。</li>
 <li>将所需体积的KSR-FF置于37 °C水浴中预平衡15分钟。所需体积的详细信息请参见下表1。</li>
 <li>使用移液器吸除培养容器中的废弃培养基，并用D-PBS冲洗细胞两次。</li>
 <li>向培养容器中轻柔加入预热的Dispase溶液（例如，每60 mm培养皿加入1 mL Dispase溶液）。轻轻摇晃培养容器，使溶液均匀覆盖整个细胞表面。</li>
 <li>将培养容器在37 °C条件下孵育3分钟。</li>
 <li>从培养箱中取出容器，吸除Dispase溶液，并用D-PBS轻柔洗涤细胞。</li>
 <li>使用细胞刮棒轻柔地将细胞从培养皿表面刮下，并将细胞转移至无菌的15 mL离心管中。</li>
 <li>用KSR-FF冲洗培养皿两次，轻柔“冲下”未脱落的细胞。将冲洗液与离心管中的细胞混合。</li>
 <li>在室温下以200 x g离心5分钟，使细胞沉淀。</li>
 <li>小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀，并弃去上清。</li>
 <li>轻弹离心管，使细胞沉淀完全从管底脱离。</li>
 <li>使用5 mL血清移液管，将细胞轻柔重悬于预平衡的KSR-FF中。切勿吹打。注意：此步骤中必须轻柔重悬细胞，避免用力，以防细胞损伤。</li>
 <li>按所需传代比例将细胞接种至新的Geltrex包被的60 mm培养皿中，并前后左右轻轻晃动培养皿数次，使细胞在表面均匀分布。</li>
 <li>将培养皿置于37 °C、含4%至6% CO2的湿化培养箱中培养。</li>
 <li>次日，轻柔更换废弃培养基为KSR-FF，以去除细胞碎片。此后每天更换一次废弃培养基。每日观察iPS细胞生长状态，并根据需要进行传代（约每4-5天一次）。当细胞融合度达到70-80%时建议传代。有关iPS细胞的冷冻保存与复苏，请参阅我们题为“使用完全KnockOut血清替代无饲养层培养基进行人iPS细胞的冷冻保存与复苏”的实验方案。</li>
</ol>
预期结果
<img src="/files/ftp_upload/2236/2236fig1.jpg" alt="显微镜下的细胞培养；细胞生长研究；显微成像；生物学研究。" data-altupdatedat="1754904545000" data-alt="图1"> 
 图1. 下方的相差显微图像显示了在Geltrex包被的培养皿中使用完全KnockOut血清替代无饲养层培养基培养的iPSCs。这些iPSCs表现出与hESCs相似的形态特征，具有较大的细胞核和较少的细胞质。（40倍放大）
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>组分</td>
 <td>35 mm 培养皿</td>
 <td>60 mm 培养皿</td>
 <td>100 mm 培养皿</td>
 </tr>
 <tr valign="top">
 <td>完全 KnockOut SR 培养基</td>
 <td>2 mL</td>
 <td>4 mL</td>
 <td>10 mL</td>
 </tr>
 <tr valign="top">
 <td>Geltrex 溶液</td>
 <td>1 mL</td>
 <td>1.5 mL</td>
 <td>4–5 mL</td>
 </tr>
 <tr valign="top">
 <td>Dispase</td>
 <td>0.5 mL</td>
 <td>1 mL</td>
 <td>3–4 mL</td>
 </tr>
 <tr valign="top">
 <td>用于洗涤的 D-PBS</td>
 <td>2 mL</td>
 <td>4 mL</td>
 <td>10 mL</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
表1. 推荐体积
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2236/2236appendix.pdf">请点击此处查看附录</a>。

<ol><li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Maherali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+and+techniques+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).</li>
<li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+rat+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+combining+genetic+reprogramming+and+chemical+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors.</a> Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).</li>
<li>Liao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines+from+adult+rat+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells.</a> Cell Stem Cell. 4, 11-15 (2009).</li>
<li>Dimos, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+patients+with+ALS+can+be+differentiated+into+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons.</a> Science. 321, 1218-1221 (2008).</li>
<li>Aasen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnli%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnli. 26, 1276-1284 (2008).</li>
<li>Park, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of human-induced pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 3, 1180-1186 (2008).</li>
</ol>

本文作者受雇于 Life Technologies，该公司生产本文所用的试剂和仪器。

<table><tbody><tr><td>敲除型DMEM/F12</td><td></td><td>货号 12660-012</td><td>注：有关替代 DMEM 产品的使用，请参见附录</td></tr><tr><td>GlutaMAX-I</td><td></td><td>货号 35050-061</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut血清替代物</td><td></td><td>KnockOut SR，货号 10828-028</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut血清替代物生长因子混合液</td><td></td><td>KnockOut SR-GFC，货号 A10580-01</td><td></td></tr><tr><td>FGF-basic，人重组蛋白，10 &amp;mu;g</td><td></td><td>bFGF，货号 PHG0024</td><td>注：替代的bFGF包装规格见附录。</td></tr><tr><td>2-巯基&amp;#8211;乙醇</td><td></td><td>货号 21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td></td><td>货号 17105-041</td><td>注：替代的传代方法见附录。</td></tr><tr><td>Geltrex hESC鉴定级低生长因子基底膜基质，1 mL</td><td></td><td>货号 A10480-01</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;不含钙和镁的D-磷酸盐缓冲液（D-PBS） </td><td></td><td>货号 14190-144</td><td></td></tr><tr><td>无菌组织培养罩</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37℃培养箱&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette-Aid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37℃水浴&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌刻度吸管（5 mL，10 mL）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60毫米组织培养处理培养皿</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

无饲养层人诱导多能干细胞的适应、培养与传代——使用完全型knockout血清替代无饲养层培养基

Feeder-Free Adaptation, Culture and Passaging of Human IPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

2006年发现人类和小鼠成纤维细胞可被重编程生成诱导多能干细胞（iPS细胞）1-3，其特性与胚胎干细胞极为相似，这一发现为药物研发、细胞治疗和基础研究提供了宝贵的新型多能细胞来源。
多年来，GIBCO 培养基和试剂一直处于多能干细胞研究的前沿。添加 Knockout 血清替代物的 Knockout DMEM 是胚胎干细胞生长以及当前诱导多能干细胞（iPS 细胞）培养的首选培养基3-9。这一黄金标准培养基体系现在可通过添加 Knockout SR 生长因子混合物实现无饲养层培养。
传统的人类胚胎干细胞（ES）和诱导多能干细胞（iPS）培养方法需要使用小鼠或人类成纤维细胞饲养层，或饲养层条件培养基。这些培养方法耗时费力，难以扩大规模，且由于培养条件未明确定义，难以维持hiPS细胞的未分化状态。Invitrogen开发了Knockout SR生长因子混合物，可帮助您轻松将hiPS细胞培养转为无饲养层体系，同时继续使用Knockout SR培养基。

以下方案提供了将人诱导性多能干细胞（iPS细胞）适应于无饲养层培养的详细说明，使用完全 KnockOut 血清替代无饲养层培养基（KSR-FF）。细胞适应后，还提供了持续传代维持的操作指导。

无饲养层人诱导多能干细胞的适应、培养与传代——使用完全型KnockOut血清替代无饲养层培养基

2006年发现，人类和小鼠成纤维细胞可被重编程生成诱导性多能干细胞（iPS细胞）¹⁻³，其特性与胚胎干细胞极为相似……

本实验的总体目标是使用完全型无血清替代物、无饲养层培养基，将人诱导性多能干细胞适应并维持在无饲养层的培养条件下。该过程首先需准备明胶、TRX包被或CellStart包被的培养板。实验的第二步是利用disc space将IPS细胞从MEF饲养层转移至无饲养层培养基中进行传代。该实验流程的最后一步是持续以无饲养层条件培养你的诱导多能干细胞（IPS细胞）。最终，可通过多能性标志物的免疫染色获得结果，显示与甲基纤维素培养体系中相似的细胞生长状态和干性特征。大家好，我是来自Life Technologies公司GIBCO网站的Kate Wagner。与现有技术相比，该技术的主要优势在于在整个工作流程中使用敲除型血清替代物（knockout serum replacement）可节省时间并提高细胞培养的一致性。目前，敲除型产品系列包含适用于人胚胎干细胞、小鼠胚胎干细胞和诱导性多能干细胞的饲养层依赖、无饲养层以及无异源条件下的全套培养基和试剂。KSR 可用于细胞系的建立、生长、扩增、冻存以及分化的初始步骤。以下视频将向您展示如何在无饲养层条件下，使用KSR对细胞进行适应和包装。在制备包被培养皿的前一天，需要准备好经Gel TRX包被的培养皿。在前一晚将一管Gel TRX置于冰箱中过夜，缓慢解冻。次日，将解冻后的Gel TRX用基础培养基按1:100的比例稀释，即将1毫升Gel TRX转移至含有99毫升基础培养基的瓶子中。轻轻混匀该溶液。我们推荐使用Knockout DMEM/F12作为基础培养基，但请参见实验方案正文中的其他选择。用Gel Rex溶液覆盖每个培养皿的整个表面。对于每个60毫米的培养皿，加入1.5毫升的Gel Trek溶液。将培养皿在 37 摄氏度下孵育 1 小时。额外的平板可用封口膜包裹后置于冰箱中，保存时间最长可达 4 周。额外稀释的 gelt TRX 可分装后在 -20 至 -80 摄氏度保存，但在使用前应避免反复冻融。将包被有 gelt TRX 的培养皿转移至超净台或层流罩中，并使其平衡至室温。同时，准备好所有其他所需试剂，并确保所有培养基均已平衡至 37 摄氏度并适当充气。为使人源 IPCs 适应无饲养层培养基的首次培养。诱导多能干细胞（IPSC）在饲养层细胞上培养，直至其融合度达到70%至80%。从每个60毫米的培养皿中吸除培养基，并加入适量的消化液（dispase溶液），用量为1毫升。随后，将培养皿置于37°C条件下孵育3至5分钟。吸出每块培养皿中的 dispa 溶液，用 DPBS 轻轻冲洗甲醇饲养细胞 2 至 3 次。接着，向每块培养皿中加入适量的完全血清替代培养基。使用细胞刮棒，轻轻将细胞从培养皿表面刮下。将每皿的细胞悬液收集至单独的15毫升锥形管中。用适量的完全无血清替代培养基冲洗每个培养皿，并将冲洗液加入含有细胞悬液的15毫升锥形管中，随后在室温下以200 ×g离心5分钟，使细胞沉淀。离心后，小心吸除并弃去上清液，切勿扰动细胞沉淀。轻轻弹击离心管，使细胞沉淀完全从管底脱落。根据所需的传代比例，加入适量的完全血清替代物、无饲养层培养基。轻轻重悬沉淀物。不要将细胞团块分散成更小的团块，因为较小的团块不易良好贴附于表面。吸除先前制备的凝胶Rex包被培养皿中残留的凝胶TRE溶液，并缓慢向每个培养皿中加入适量的细胞悬液。将培养皿前后、左右反复移动数次，使细胞在皿表面均匀分散。轻轻将培养皿放入37摄氏度、含4%至6% CO2的湿化空气培养箱中。此后每天更换培养液，直至细胞融合度达到约70%至80%。当在完全无血清、无饲养层培养基中培养的人诱导性多能干细胞达到 70% 至 80% 汇合度时，即可进行传代。若存在任何已分化细胞，应在传代前将其去除。使用移液器吸去 60 毫米培养皿中的废弃培养基，并用缓冲液清洗细胞两次。用预热的 DPBS 轻轻加入一毫升基于圆盘的预热溶液至培养皿中。轻轻摇晃培养皿，使溶液覆盖整个细胞表面。将培养物置于 37 °C 下孵育 3 至 5 分钟。接下来，吸除消化液，用DPBS轻柔地洗涤细胞两次，加入完全血清替代物、无饲养层培养基，然后轻轻刮下培养皿表面的细胞。使用细胞刮刀将细胞转移至无菌的15毫升离心管中。用完全血清替代物冲洗培养皿两次。用无饲养层培养基轻轻冲洗未脱落的细胞。将两次冲洗的培养基连同细胞一并收集至15毫升离心管中。在室温下以200 ×g离心5分钟，使细胞形成沉淀，注意不要扰动细胞沉淀。小心吸出并弃去上清液。轻轻弹动离心管，使细胞沉淀完全从管底脱落。用完全血清替代物轻柔重悬细胞。使用5毫升血清移液管将细胞悬液转移至新鲜的60毫米gelt TRX包被培养皿中，按所需传代比例进行接种。切勿滴定。将培养皿前后、左右反复移动数次，使细胞在其表面分散均匀。次日，将培养皿置于37摄氏度、含4%至6%二氧化碳的湿化空气培养箱中。轻柔地用完全血清替代物替换用过的培养基。更换无饲养层的完全培养基以去除细胞碎片。此后每天更换一次用过的培养基。此相差图像显示了在经gelt TRX包被的培养皿上，使用完全血清替代物、无饲养层培养基培养的人诱导性多能干细胞。胰岛前体细胞（IPC）的形态与人类胚胎干细胞相似，表现为细胞核较大、细胞质较少。免疫染色显示，在添加生长因子混合物的敲除血清替代培养基中培养的IPC表达了多能性标志物OCT4和SSEA4。观看本视频后，您应充分了解如何在敲除血清替代、无饲养层的条件下适应和维持您的IPC培养。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利。

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生物学

免费接驳适应，文化和传代使用完整的基因敲除血清替代馈线中的人类iPS细胞

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通过乙二胺四乙酸介导的去黏附实现饲养细胞上人多能干细胞快速、经济、无酶传代

本方法描述了利用高效慢病毒介导的基因递送系统，在稳定表达靶向L2HGDH基因的sgRNA的人胚胎干细胞（hESC）系H9中，构建CRISPR介导的基因敲除。...

CRISPR-Cas9 介导的无饲养层培养条件下人多能干细胞基因敲除

本文介绍一种可分化并扩增人诱导多能干细胞（iPSC）来源的表达嵌合抗原受体（CAR）的自然杀伤细胞的方法，该方法能增强其对多种恶性肿瘤的杀伤能力。本方案展示了优化后的iPSC来源CAR-NK细胞的分化与扩增过程，以及针对多种肿瘤细胞系的抗肿瘤活性检测方法。...

人诱导多能干细胞来源的表达嵌合抗原受体的自然杀伤细胞研究进展

学习使用完全KnockOut血清替代无饲养层培养基将人类诱导多能干细胞适应并维持于无饲养层培养条件的方法。该技术可提高细胞培养的一致性和效率，适用于干细胞生物学研究。

无饲养层人诱导多能干细胞的适应、培养与传代——使用完全型KnockOut血清替代无饲养层培养基

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