Specific Antigen In Vivo en utilisant des cellules CFSE cible marquée

L'objectif général de l'expérience suivante est d'évaluer la qualité fonctionnelle des lymphocytes T CD8 positifs en réponse à un antigène particulier, en étudiant leur capacité à tuer des cellules cibles in vivo. Cela est réalisé en premier lieu en induisant des lymphocytes T effecteurs spécifiques de l'antigène par immunisation de souris receveuses. Dans un deuxième temps, les cellules cibles primaires sont rendues spécifiques ou traitées d'une autre manière, ce qui achève la mise en place du système effecteur-cible spécifique.

Ensuite, les cellules cibles sont administrées aux souris receveuses par transfert adoptif rétro-orbitaire. Afin d'observer les résultats in vivo du phénomène de destruction par les effecteurs, des analyses ont été obtenues et montrent si les effecteurs ont détruit certaines des cellules cibles, selon une analyse cytométrique en flux des cellules marquées au CFSE. Bonjour, je m'appelle Marina Ward.

Je suis étudiante diplômée dans le laboratoire de Gary Splitter à l'Université du Wisconsin à Madison. Cette méthode permettra d'obtenir des informations sur la cytotoxicité des lymphocytes T cytotoxiques (CTL) et peut également être appliquée à l'étude de la prolifération et de la survie cellulaires. Le Dr Jerome Harms, scientifique de mon laboratoire, démontrera la procédure de transfert adoptif. Commencez stratégiquement par définir un système spécifique d'effecteurs et de cibles.

Par exemple, dans un dosage classique de CTL in vivo, utilisez une immunisation par peptide purifié pour induire des lymphocytes T spécifiques CD8 positifs ; utilisez le même peptide pour pulser les cellules cibles syngéniques, créant ainsi un système spécifique effeteur-cible. Décontaminez la surface de travail d'une hotte de sécurité biologique afin d'assurer la stérilité des injections. Préparez l'immunisation par peptide en le plaçant d'abord dans un tube de deux millilitres.

50 microgrammes de peptide purifié dans 100 microlitres de DMSO à 10 % dans du PBS par souris. Ensuite, ajouter une quantité égale d’adjuvant incomplet froid, libre d’adjuvant, avec des billes de un millimètre pour le mélange. Fermer hermétiquement le bouchon du tube avec du parafilm et conserver l’immunogène sur glace jusqu’à l’injection.

Utilisez un agitateur vortex réglé à la vitesse maximale de tours par minute pour mélanger l'émulsion pendant trois minutes, puis replacez immédiatement l'émulsion sur de la glace après le mélange. L'émulsion obtenue doit avoir une consistance similaire à celle de la mayonnaise. Laissez l'émulsion reposer à quatre degrés Celsius toute la nuit ou jusqu'à une semaine, en effectuant un mélange supplémentaire si une séparation est observée au moment de l'immunisation.

Identifier les souris pour cette partie de l'expérience. Utiliser une seringue d'un millilitre et une aiguille de calibre 20 pour prélever l'émulsion. Veiller à ne pas aspirer de billes afin de préparer les cellules cibles.

Des souris syngéniques naïves sont utilisées pour euthanasier ces souris naïves. Conformément aux normes approuvées par l’A-A-A-L-A-C. Vaporisez la zone concernée de la souris avec de l’éthanol à 70 % afin de minimiser le risque de contamination par le pelage de la souris ou d'autres contaminants externes. À l’aide de ciseaux de dissection, faites une petite incision à travers la peau du côté gauche de la souris.

Tirer le lambeau de peau pour découvrir la poche péritonéale et les organes internes. Inciser le péritoine en prenant soin de ne pas endommager les organes sous-jacents. Localiser la rate, qui est proche de la surface et de couleur rouge foncé.

Retirer soigneusement la rate et la placer immédiatement dans un tube conique de 15 millilitres contenant 10 millilitres de milieu RPMI préparé sur de la glace. Poursuivre avec les souris restantes. Transférer la rate et le milieu dans un homogénéisateur de tissus en verre.

Broyez la rate jusqu'à ce que tous les tissus aient perdu leur couleur. Faites passer les produits homogénéisés à travers un filtre cellulaire de 70 microns dans un tube conique de 50 millilitres. Rincez une fois l'homogénéisateur avec du milieu frais et mélangez-le avec l'homogénat de rate en versant à travers le filtre. Centrifugez les échantillons à quatre degrés Celsius et à 1 300 tours par minute.

Pendant sept minutes, décantez et jetez le surnageant. Resuspendez le culot cellulaire dans 10 millilitres de réactif lyse, puis incubez à 37 degrés Celsius pendant sept minutes. Ajoutez jusqu'à 50 millilitres de milieu frais, puis récoltez les cellules par centrifugation.

Répétez ce lavage. Comptez les cellules et aliquotez 10 millions de cellules par puits dans une plaque de culture histologique de 96 puits à fond rond.

Incuber à quatre degrés Celsius pendant une heure et demie. Transférer à l'incubateur à 37 degrés Celsius pour les 30 dernières minutes. Préparer le réactif CFSE frais selon les instructions du fabricant et le diluer à une concentration de travail comprise entre 0,5 et 25 micromolaire.

Préparez deux solutions de CFSE dont les concentrations diffèrent d'un facteur dix. Équilibrez ces solutions de CFSE à faible et forte concentration à 37 degrés Celsius avant le marquage. Retirez la plaque de 96 puits contenant les cellules cibles de l'incubateur et faites précipiter les cellules par centrifugation.

À température ambiante, secouer doucement la plaque pour éliminer le surnageant. Resuspendre les cellules dans 200 microlitres de solution de CFSE à faible ou forte concentration et incuber pendant 15 minutes dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Récupérer les cellules par centrifugation à température ambiante, secouer doucement la plaque pour éliminer le surnageant, puis resuspendre les cellules dans 200 microlitres de milieu frais et incuber pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Récupérer à nouveau les cellules par centrifugation, éliminer le surnageant et resuspendre les culots dans 50 microlitres de PBS. Mettre de côté une partie des cellules marquées pour les contrôles sans transfert lors de l'analyse des données, ainsi que pour l'analyse en cytométrie en flux en vue du transfert adoptif.

Ajouter une puits de cellules marquées au CFSE à faible concentration à un puits de cellules marquées au CFSE à forte concentration par souris. Ainsi, l'injection résultante se compose de 50 % de cellules cibles spécifiques et de 50 % de cellules non pertinentes dans 0,1 millilitre. Afin de faciliter le transfert adoptif, anesthésier les souris immunisées au peptide et injecter 0,1 millilitre de cellules cibles marquées par voie rétro-orbitaire chez le receveur.

Six heures après, euthanasier les souris réceptrices pour la récolte des cellules, isoler la rate des souris et purifier la population cellulaire selon le même protocole que celui utilisé. Lors de la préparation des cellules spléniques cibles, ensemencer les cellules à raison d’un million par puits dans une plaque de culture tissulaire de 96 puits à fond rond, fixer les cellules récupérées et non transférées avec du paraformaldéhyde, analyser les échantillons au cytomètre en flux et traiter les données. La présentation typique des résultats de la cytotoxicité cellulaire spécifique est illustrée de deux manières.

Un pic spécifique de l'épitope atténué sur l'histogramme FACS et la valeur calculée indiquent une lyse spécifique aux cellules. Ici, les nombres indiquent le pourcentage de cellules présentant un phénotype CFSE élevé ou faible parmi les cellules témoins non transférées marquées au CFSE, récupérées chez une souris receveuse immunisée au PBS, et parmi les cellules marquées au CFSE récupérées chez deux souris receveuses différentes spécifiques à des peptides. Remarquez les pics spécifiques à l'épitope atténués, indicatifs d'une destruction cellulaire spécifique.

Alternativement, les résultats peuvent être présentés sous forme graphique afin d'indiquer la lyse cellulaire spécifique pour chaque groupe de souris : PBS, peptide A et peptide B. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de mettre au point votre propre test de destruction CTL in vivo en utilisant des souris.