Profilage de la méthyltransférase et autres S-Adénosyl- _L-Homocystéine protéines liant par spectrométrie de masse de captation composé (CDSM)

L'objectif général de l'expérience suivante est de caractériser des méthyltransférases issues de mélanges protéiques complexes par spectrométrie de masse à l'aide de composés de capture, ou CCMS. Les méthyltransférases sont isolées fonctionnellement à l'aide de composés de capture trifonctionnels portant comme fonction de sélectivité l'inhibiteur du produit général des méthyltransférases, la S-adényl-L-homocystéine (SAH), dans le protocole illustré ici. Cet isolement fonctionnel est réalisé en incubant un lysat cellulaire avec le composé de capture afin d'établir un équilibre de liaison réversible entre la fonction de sélectivité du composé de capture et les protéines cibles. Dans une deuxième étape, le mélange est irradié par une lumière UV à l'intérieur de la boîte Capra.

La photo-irradiation active la fonction réactive du composé de capture. Ceci induit la formation d'un pontage covalent irréversible entre le composé de capture et les protéines cibles. Ensuite, les conjugués protéiques du composé de capture sont séparés du lysat, lavés soigneusement, libérés du support solide et trypsinisés afin d'identifier les protéines capturées par analyse en spectrométrie de masse des peptides triptyques. Les résultats obtenus démontrent l'isolement et l'identification directs de méthyltransférases à partir d'un lysat cellulaire d'Escherichia coli, basés sur la spectrométrie de masse associée à un composé de capture.

Bonjour, je suis Thomas Lentz du laboratoire de CaTECH au sein du département de biochimie. Je suis Mathias Rega, également du laboratoire CapTech de biochimie. Je suis Mer Linsky du département analytique.

Aujourd'hui, nous allons vous présenter la procédure de capture in situ des méthyltransférases à partir d'extraits cellulaires équilibrés. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les interactions entre petites molécules et protéines. Cette méthode permet l'isolement et l'identification de sous-protéomes fonctionnels tels que les kinases, les métalloprotéinases, les GTPases, les AIS, entre autres.

Nous utilisons également cette approche pour la découverte de cibles médicamenteuses. Commençons donc. Pour les expériences de capture, on utilise le kit L homocystine caper de type court SAH caper pour escargot.

Ce kit comprend le composé de piégeage SAH et la SAH libre en tant que compétiteur. Il contient également des billes magnétiques recouvertes de streptavidine d'un diamètre d'un micron, un tampon de capture concentré cinq fois et un tampon de lavage concentré cinq fois. À l'aide de différents tubes d'une bande de tubes PCR de 200 microlitres, préparez des billes magnétiques recouvertes de streptavidine chargées avec le composé de piégeage SAH en mélangeant 50 microlitres de billes magnétiques recouvertes de streptavidine à 10 milligrammes par millilitre avec 25 microlitres de composé de piégeage SAH à 100 micromolaire pour chaque Eloqua, vigoureusement.

Agiter les suspensions obtenues à température ambiante pendant deux minutes afin de permettre la liaison de la partie biotine du composé de capture à la streptavidine présente à la surface des billes magnétiques. Ensuite, rassembler magnétiquement les billes Capra dans les bouchons des tubes PCR à l’aide du Capra Mag, éliminer le surnageant et resuspendre les billes Capra obtenues dans 200 microlitres de tampon de lavage à une fois. Rassembler à nouveau magnétiquement les billes Capra dans les bouchons des bandes de tubes PCR et éliminer le surnageant.

Ensuite, fermez les tubes afin d'éviter l'assèchement des billes. Étiquetez ensuite de nouveaux tubes pour le test de capture et les contrôles nécessaires, y compris le contrôle de compétition. Prélevez le contrôle de compétition du « pull down » et du test de capture combiné plus « pull down », puis placez les tubes étiquetés dans la boîte Capra pour réguler la température entre zéro et quatre degrés Celsius.

Ensuite, pipeter le volume d'eau milli Q calculé pour un volume réactionnel final de 100 microlitres et 20 microlitres de tampon de capture à cinq fois. Pour chaque réaction, ajouter 0,26 milligramme de lysat total de cellules entières d’*E. coli* DH5α dans chaque tube et mélanger doucement par retournement. Pour le témoin de compétition et le témoin de compétition du « pull down », ajouter 20 microlitres de solution compétitrice de SAH à 10 millimolaire.

Pour le test de capture, ajouter 20 microlitres d'eau milli Q au lieu de la solution SAH, mélanger délicatement tous les tubes par retournement et centrifuger brièvement, pour les tests de capture et de capture combinée avec précipitation. Ensuite, suspendre les billes Capra dans le lysat respectif et incuber trois heures à quatre degrés Celsius. Maintenir les billes en suspension par rotation afin de permettre la liaison réversible des protéines liant le SAH à la fonction de sélectivité SAH du composé de capture SAH.

Après l'incubation, centrifuger brièvement et placer les suspensions dans la boîte Capra. Séparer les tubes et retirer les suspensions destinées au test de précipitation et au contrôle de compétition de précipitation, puis les placer sur de la glace. Laisser les suspensions restantes pour le contrôle de compétition du test de capture et pour le test de capture combiné.

Tirer vers le bas sur le bouton poussoir de l’appareil Capra pour irradier les échantillons avec de la lumière UV tout en les refroidissant simultanément. Irradier les échantillons pendant une durée totale de 30 minutes selon des intervalles d'irradiation de 2,5 minutes dans des tubes fermés, à une température comprise entre 0 et 4 degrés Celsius. Ce processus entraînera la formation d'une liaison covalente de réticulation entre la fonction réactive du composé de capture SAH et les protéines de liaison de la SAH.

Retirer les suspensions de la boîte Capra après un intervalle d'irradiation de 2,5 minutes. Les refroidir dans de l'eau glacée pendant environ 15 secondes et les mélanger plusieurs fois par retournement. Ensuite, centrifuger brièvement les échantillons pour éliminer toute suspension restant sur les couvercles, puis les remettre dans la boîte Capra pour l'intervalle d'irradiation suivant.

Ensuite, ajoutez de nouveau les suspensions pour la rétention et le contrôle de compétition de la rétention, puis ajoutez 20 microlitres de solution de SAH à 10 millimolaire dans le test de capture destiné au contrôle de compétition, soit le contrôle de compétition de rétention et le test de capture combiné avec rétention, et ajoutez 20 microlitres d’eau milli Q. Incubez les suspensions pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius, en maintenant les billes et la suspension en rotation dans le test de capture. Les protéines liant le SAH qui ne sont pas réticulées au composé de capture SAH seront déplacées.

Après l'incubation, recueillir les billes capra à partir des suspensions à l'aide du capra mag et éliminer le surnageant. Laver ensuite les billes par resuspension, en les redispersant dans 200 microlitres de tampon de lavage à une fois et en récupérant les billes par séparation magnétique. Répéter ce lavage cinq fois, puis resuspendre les billes dans 200 microlitres d'eau milli Q et récupérer les billes par séparation magnétique.

Resuspendre les billes dans 200 microlitres d'acétonitrile à 60 % et recueillir les billes à l’aide du capri mag. Répéter ce lavage à l'acétonitrile deux fois. Appliquer un traitement par ultrasons si les billes ne peuvent pas être facilement resuspendues.

Ensuite, libérez les protéines capturées à partir des billes en ajoutant 200 microlitres d'acétonitrile 60 % fraîchement préparé contenant 0,2 % d'acide trifluoroacétique, puis incubez pendant 10 minutes à température ambiante sous agitation vigoureuse. Appliquez à nouveau des ultrasons si les billes ne peuvent pas être facilement remises en suspension.

Enfin, récupérez magnétiquement les billes et jetez-les. Coupez la bande de tubes en tubes individuels, percez les couvercles et évaporez le surnageant jusqu'à séchage. À cette étape, à l'aide d'un évaporateur centrifuge, les protéines capturées peuvent soit être soumises à une électrophorèse SDS-PAGE, soit être traitées pour une spectrométrie de masse comme décrit dans la section suivante ; dissolvez les protéines capturées libérées des billes magnétiques dans 10 microlitres de bicarbonate d'ammonium à 50 millimolaire.

Placer les échantillons dans un bain à ultrasons, puis vortexer les échantillons. Ensuite, ajouter un microlitre de trypsine à 0,5 microgramme par microlitre dans du HCl 1 millimolaire, centrifuger brièvement et incuber la solution à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Après l'incubation nocturne, désaler une solution contenant les peptides triptyques des protéines capturées à l'aide d'un matériau C18, tel que des embouts de purification (stage tips) de 20 microlitres selon les instructions du fabricant fournis par Biosystems, puis éluer les peptides deux fois avec 10 microlitres de méthanol 50 %, acide formique 5 %.

Ensuite, évaporer le solvant à l’aide d’un évaporateur centrifuge, laissant les peptides dessalés secs ; dissoudre les peptides dans 5,5 µL d’acide formique à 0,1 % en appliquant des ultrasons dans un bain à ultrasons et en vortexant. Enfin, analyser l’échantillon par chromatographie liquide en flux nanométrique couplée à une spectrométrie de masse en tandem, comme décrit dans le protocole écrit. Pour analyser les données MSM S, utiliser un algorithme d’identification protéique tel que SEQUEST implémenté dans le logiciel Bioworks version 3.3 0.1, SP One et X! Tandem implémenté dans le logiciel Scaffold 3.

Une recherche automatisée dans la base de données est effectuée à l'aide de la base de connaissances la plus récente de la ressource universelle de protéines. Base de données Swiss-Prot publiée sur www.expasy.org relative à l'organisme étudié.

La base de données utilisée pour la présente étude est une souche de coli. K12 release 57 dash 11 au sein de Seaquest, configurée pour une recherche automatisée dans la base de données avec une tolérance du précurseur de cinq parties par million. Une tolérance ionique de fragment d'une unité de masse atomique et une spécificité en tripsine complète, autorisant jusqu'à deux clivages manqués.

Définir les modifications variables pour autoriser la phosphorylation de la sérine, de la thréonine et de la tyrosine, l'oxydation de la méthionine, la déamidation de l'asparagine et du glutamine, l'acétylation de la lysine, la formylation de la lysine, ainsi que la méthylation de l'arginine, de la lysine, de la thréonine et de l'asparagine. Ne pas utiliser de modifications fixes lors de la recherche dans la base de données. Charger les fichiers DTA ou SRF générés par Seaquest dans le logiciel Scaffold 3, qui effectue l'évaluation probabiliste des attributions peptidiques et des identifications protéiques en combinant les recherches dans la base de données Seaquest et X!Tandem. Scaffold est utile pour comparer, valider et visualiser facilement les listes de protéines provenant de plusieurs échantillons.

Définissez les paramètres dans le logiciel Scaffold trois pour n'accepter que l'identification des protéines et pour signaler des résultats distincts. Configurez les résultats de manière à ce qu'ils contiennent au moins un peptide discriminant ayant passé la validation probabiliste. Selon l'analyse de Scaffold trois, ne considérez que les peptides ayant une probabilité supérieure ou égale à 95 %, telle que spécifiée par l'algorithme Peptide Prophet intégré à Scaffold.

Trois logiciels fixent les probabilités d'identification des protéines pour plusieurs attributions de peptides à une valeur supérieure ou égale à 95 %, selon l'algorithme Protein Prophet. Pour les identifications de protéines à partir d'un seul peptide, fixer arbitrairement la probabilité de la protéine à une valeur supérieure ou égale à 50 % et inspecter manuellement le peptide correspondant. Les spectres MS/MS des protéines composées de peptides similaires et qui ne peuvent être différenciées uniquement par analyse MS/MS sont regroupés par le logiciel afin de respecter les principes de parcimonie.

Le taux de fausses découvertes estimé pour les identifications de peptides peut être déterminé à l’aide de l’approche par base de données protéique inversée et doit être inférieur à 1 % ici. La page SDS, une analyse par coloration argent des protéines entières capturées est présentée dans le test de capture. Un excès de SAH libre a été ajouté après l’étape d’irradiation UV afin de s’assurer que seules les protéines ayant le composé de capture fixé de manière covalente par la fonction de photoréactivité sont isolées.

Les protéines ont été identifiées par spectrométrie de masse (MS) à partir de bandes de gel protéiques découpées après la digestion Ingel Triptych. À titre de comparaison, le premier lane à gauche montre 0,25 % du lysat total de cellules d’e coli DH five alpha à partir duquel les protéines ont été isolées dans le test de capture. Cette comparaison met en évidence la réduction spectaculaire de la complexité de l'échantillon obtenue grâce à la technologie des composés de capture.

Les témoins ont été déposés au centre du gel et comprennent le témoin de compétition du test. Ce témoin contient un excès de SAH libre agissant comme compétiteur avant l'étape d'irradiation UVI, afin d'empêcher la liaison des protéines au composé de capture SAH par l'intermédiaire de la fonction de sélectivité du SAH. Le témoin de compétition est essentiel pour identifier les protéines capturées de manière non spécifique qui ne se lient pas au SAH.

Ainsi, les protéines identifiées dans le test de capture, mais pas dans le contrôle de compétition, sont des protéines spécifiques liant le SAH. Une expérience de précipitation sans irradiation UV et sans ajout de SAH libre est également incluse.

Le témoin de compétition de la précipitation n'est pas non plus irradié, mais contient du SAH comme compétiteur. Enfin, le test combiné de capture suivi de la précipitation est irradié aux UV et aucun SAH libre n'est ajouté au cours du protocole. Il est clair que le réticulation photochimique améliore le rendement et la sensibilité de l'expérience, et que la spécificité peut être facilement évaluée dans des expériences de compétition en utilisant un excès de SAH libre, au lieu d'analyser les protéines intactes capturées par électrophorèse SDS-PAGE.

L'ensemble du mélange de protéines capturées peut être analysé simultanément par chromatographie liquide à flux nanométrique couplée à une spectrométrie de masse en tandem après digestion Triptych. Il s'agit de l'approche CCMS réelle, nettement plus sensible que l'analyse par électrophorèse SDS-PAGE. Les MÉTHYLTRANSFÉRASES et d'autres protéines sélectionnées identifiées par des expériences CCMS sont présentées dans ce tableau.

Les nombres indiqués représentent le nombre brut de spectres peptidiques par protéine, beaucoup plus de méthyltransférases et d'autres protéines liant le SAH sont identifiées dans le test d'immobilisation par rapport au test de précipitation. La spécificité pour le SAH est démontrée par l'absence quasi complète de ces protéines dans le contrôle de compétition. Le nombre total de protéines identifiées dans les analyses CCMS ainsi que le recouvrement protéique entre les analyses ont été consignés dans un tableau.

Le nombre de protéines identifiées avec au moins deux peptides est indiqué entre parenthèses. La forte reproductibilité de la méthode peut être déduite du fort recouvrement protéique, principalement pour les protéines non spécifiques, entre les expériences comparables, en particulier pour les protéines identifiées de manière robuste avec au moins deux peptides ici. Les diagrammes de Venn décrivent le recouvrement des protéines identifiées dans le test d'immunoprécipitation, le contrôle de compétition et le « pull down », tandis que les nombres totaux de protéines identifiées sont indiqués à droite (les nombres de protéines identifiées avec au moins deux peptides étant entre parenthèses) ; les nombres de méthyltransférases et de SAH nucléase sont indiqués à gauche.

Nous venons de vous montrer comment isoler et identifier des méthyltransférases ou d'autres sous-protéomes fonctionnels à partir de lysats cellulaires d'*E. coli* ou d'autres tissus ou lysats cellulaires par spectrométrie de masse avec composé capturant, ou CCMS. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de veiller à éviter une exposition prolongée du composé capturant à la lumière visible, de maintenir les échantillons au frais, de préparer fraîchement la solution d'acétonitrile-TFA utilisée pour libérer les protéines capturées à partir des billes magnétiques, et d'éviter toute contamination des expériences par des sources protéiques exogènes telles que la kératine provenant de la poussière ou de l'expérimentateur.

Nous avons également découvert que cela dépend du dispositif spécifique, que la configuration décalée, que la configuration de photocrosslinkage entre le composé préalablement piégé et les protéines en solution ou que la configuration en phase décrite ici donne de meilleurs résultats. Voilà tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.