Application d'une conductance des récepteurs NMDA dans les neurones dopaminergiques mésencéphale de rat utilisant la technique du clamp dynamique

Les neuroscientifiques étudient le fonctionnement du cerveau en examinant la manière dont les neurones communiquent entre eux. Ici, des modifications de l'activité électrique d'un neurone unique sont provoquées par l'application d'une conductance contrôlée expérimentalement à l'aide de la technique du clampage dynamique. Tout d'abord, des tranches cérébrales fines sont découpées et conservées dans une chambre d'incubation remplie de liquide céphalorachidien artificiel.

Une tranche est ensuite transférée vers un dispositif d’enregistrement en configuration de patch clamp. Un neurone est sélectionné, puis scellé à l’aide d’une électrode d’enregistrement en utilisant un ordinateur de clampage dynamique relié à l’amplificateur d’enregistrement. Une conductance des récepteurs NMDA est appliquée dans la cellule.

Les enregistrements obtenus montrent un sursaut de potentiels d'action, suggérant que l'activation des récepteurs NMDA constitue un mécanisme cellulaire par lequel les neurones dopaminergiques peuvent générer des salves. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes actuelles telles que l'injection de courant continu ou le traitement pharmacologique réside dans notre capacité à déterminer précisément les effets de l'activation d'un récepteur défini expérimentalement sur l'activité électrique d'un neurone vivant. Après avoir rapidement extrait le cerveau d'un rat Bragg dolly anesthésié, découper des tranches cérébrales horizontales de 240 micromètres à l'aide d'un microtome vibrant.

Au fur et à mesure que les tranches sont découpées, utilisez une pipette de transfert pour les placer dans une chambre d'incubation à 32 degrés Celsius remplie de liquide céphalorachidien artificiel jusqu'au moment de réaliser les expériences d'enregistrement. Le dispositif d'enregistrement intracellulaire est composé d'un microscope équipé d'objectifs configurés pour l'imagerie en contraste de gradient, d'un moniteur, d'un système de perfusion, d'un amplificateur MultiClamp 700B, d'un convertisseur analogique-numérique, d'un micromanipulateur et d'une tête d'amplification. Un ordinateur Mac Pro exécute le logiciel d'acquisition de données, AxoGraph X, ainsi que le logiciel MultiClamp Commander. À côté du dispositif d'enregistrement intracellulaire et de l'ordinateur Mac Pro se trouve un ordinateur Sun Microsystems fonctionnant sous Linux en temps réel, accompagné de son convertisseur analogique-numérique, qui sera utilisé avec la technique de « clamp » dynamique.

Le dispositif d'enregistrement intracellulaire doit perfuser un liquide céphalorachidien artificiel à environ 35 degrés Celsius. Si la coupe destinée à l'enregistrement a été préparée horizontalement, utilisez une pipette de transfert pour la placer dans une boîte de Pétri contenant du liquide céphalorachidien artificiel, puis, à l'aide d'un outil de découpe, divisez la coupe en deux le long de la ligne médiane. Ensuite, pour effectuer les enregistrements électrophysiologiques, utilisez une pipette pour transférer la coupe vers le dispositif d'enregistrement intracellulaire.

À l’aide de l’objectif 40 x, visualisez le neurone cible ici ; un neurone dopaminergique individuel de la substance noire est visible. Notez le soma de forme elliptique avec deux dendrites qui s’étendent. À l’aide d’un tireur de micropipettes électronique P 97, tirez des électrodes ayant une résistance de pointe comprise entre quatre et dix mégohms.

Ensuite, à l’aide d’une aiguille de seringue microfill, remplir une électrode avec la solution interne. Insérer l’électrode remplie dans la demi-cellule, reliée à l’étage d’entrée de l’amplificateur, en utilisant une seringue connectée à la demi-cellule par un court morceau de tubulure. Appliquer une faible pression positive sur l’électrode d’enregistrement.

Sous contrôle visuel, abaissez l'électrode sur le neurone cible. Un affaissement sera visible à la surface de la cellule. Appliquez une faible pression négative pour former un scellement gigaseal sur le neurone souhaité.

Appliquez une aspiration par la bouche pour rompre le scellement. Cela constitue un enregistrement en configuration whole cell. Une fois le scellement rompu, utilisez l'interface logicielle Multi Clamp Commander pour placer l'amplificateur en mode courant nul, dans lequel aucun courant ne peut être injecté.

Pour appliquer une conductance NMDA à cette cellule, commencez par exécuter le logiciel RTXI sur l'ordinateur de clampage dynamique. Chargez ensuite un modèle personnalisé contenant un récepteur NMDA en mémoire. Une fois le modèle chargé en mémoire par RTXI, le courant à injecter dans la cellule sera calculé en temps réel à l'aide de l'équation indiquée ici, où G-N-M-D-A correspond à la conductance souhaitée en nanos, les semens étant réglés à zéro nanos.

Par défaut, MG représente la concentration en magnésium. E-N-M-D-A est le potentiel de renversement pour le récepteur NMDA, fixé à zéro millivolt, et VM est le potentiel membranaire de la cellule mesuré à partir de l'amplificateur en millivolts. Maintenant, à l'aide d'un câble BNC standard, reliez la sortie de l'ordinateur de clampage dynamique à l'entrée de commande de l'amplificateur via un convertisseur analogique-numérique.

Placez l'amplificateur en mode de blocage de courant standard ic à l'aide de l'interface logicielle Multi Clamp Commander. RTXI a été configuré pour recevoir la conductance souhaitée GFT à partir d'un signal de tension provenant du logiciel d'acquisition de données Axo Graph X. Ici, nous exécutons un protocole simple AXO Graph X dans lequel un saut de conductance d'une seconde de 40 nano Siemens est appliqué à la cellule.

Un train d'impulsions est déclenché en réponse à un saut de conductance en utilisant le dispositif décrit dans cette vidéo ; un enregistrement somatique en configuration tout-cellule réalisé sur un neurone dopaminergique de la substance noire pars compacta a été effectué. Les cellules dopaminergiques présentent généralement une activité spontanée à faible fréquence, avec un patron de type pacemaker. Un train d'impulsions peut être déclenché par l'application phasique d'une conductance des récepteurs NMDA à l'aide du clampage dynamique.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment appliquer une conductance NMDA dans un neurone dopaminergique vivant au sein d'une tranche cérébrale isolée. Toutefois, cette technique peut être utilisée pour tout type cellulaire pouvant être enregistré à l’aide de techniques électrophysiologiques classiques. De même, le clampage dynamique peut être étendu afin de reproduire les effets électriques d’un large éventail de types de récepteurs.

Nous espérons que cette vidéo vous a été utile pour comprendre en quoi consiste la technique du clampage dynamique et comment nous l'utilisons dans notre laboratoire. Merci donc d'avoir regardé.