Name: Application dune conductance des récepteurs NMDA dans les neurones dopaminergiques mésencéphale de rat utilisant la technique du clamp dynamique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-21T15:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: Apprenez à appliquer une conductance NMDA dans les neurones dopaminergiques du mésencéphale de rat en utilisant la technique du clamp dynamique. Cette méthode permet de contrôler précisément l'activation des récepteurs et d'étudier l'activité neuronale en temps réel.

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1. Préparation Trancher <ol><li> Couper les tranches de cerveau à l'aide d'un microtome vibrante. Nous avons préparé 240 um tranches horizontales mésencéphale d'un isoflurane anethetized rats Sprague-Dawley (Charles River Laboratories) à l'aide d'un microtome vibrant (Microm HM 650V) en conformité avec l'Université du Texas à San Antonio de protection des animaux et du Comité institutionnel d'utilisation. </li><li> Gardez les tranches dans une chambre d'incubation jusqu'à ce que vous êtes prêt à enregistrer. Nous utilisons un récipient d'incubation chauffée à 32 ° C et remplis de liquide céphalorachidien artificiel (ACSF, en mM): 126 NaCl, KCl 2,5, 1,25 NaH 2 PO 4, 4 MgCl 2, CaCl 2 2, 10 dextrose, 25 NaHCO 3, 1,3 acide ascorbique, du pyruvate de sodium 2,4 et 0,05 glutathion. </li></ol> 2. Enregistrement électrophysiologique <ol><li> Transfert de la tranche de la plate-forme d'enregistrement intracellulaire dans laquelle un fluide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) à 35 ° C est perfusé. Nous utilisons les mêmes que dans aCSF 1.2, sauf que 2 mM MgCl 2 a été utilisé et le glutathion a été omise. Pour les tranches à l'horizontale préparés, nous coupent généralement la tranche le long de la ligne médiane. </li><li> Visualisez le neurone cible. Nous visualisés individuels substantia nigra neurones dopaminergiques avec un système d'imagerie gradient de contraste. </li><li> Tirez une électrode en utilisant un extracteur d'électrode électronique. Nous tirons des électrodes avec une résistance de pointe de 4-10 MQ en utilisant un extracteur P97 Micropipette (Sutter Instrument Company). </li><li> Remplir une électrode avec la solution interne désirée. Nous utilisons une solution contenant (en mM): 138 K-gluconate, HEPES 10, 2 MgCl 2, 0,2 EGTA, 0,0001 CaCl 2, 4 Na-ATP, 0,4 Na-GTP. La solution interne a été ajusté à un pH de 7,3 à l'aide 1M KOH et une osmolarité de 270 à 275 mOsms. </li><li> Création d'un sceau sur le neurone gigaohm désiré. Rupture du sceau avec aspiration. Ceci constitue un enregistrement de cellules entières. Un amplificateur Multiclamp 700B a été utilisé dans notre configuration. L'amplificateur doit ensuite être placé dans le mode 'I = 0' pince de courant. </li></ol> 3. Application de la conductance dynamique avec pince <ol><li> RTXI (www.rtxi.org) a été exécuté sur l'ordinateur de serrage dynamique. Un modèle personnalisé écrit contenant un récepteur NMDA a été chargé en mémoire. Le courant doit être injecté dans la cellule en temps réel est calculé par l'équation suivante: J'ai NMDA = g-NMDA * [1 / (1 ​​+ ([Mg] / 3,57) * e (V-0.062 m *))] * (V m - E NMDA) où g NMDA est la conductance souhaitée (en N.-É.; Par défaut à 0 ns), [Mg] est la concentration de magnésium (fixé à 1,5 mM dans notre exemple ci-dessous), E NMDA est le potentiel d'inversion pour le récepteur NMDA (fixé à 0 mV), et V m est le potentiel de membrane de la cellule de mesure de l'amplificateur (en millivolts). </li><li> La sortie de l'ordinateur pince dynamique a été connecté à l'entrée de commande de l'amplificateur via un convertisseur analogique-numérique. </li><li> L'amplificateur a été placé dans le mode 'IC' pince de courant. </li><li> Entrez votre conductance souhaitée récepteur NMDA dans RTXI (par exemple 40ns). Vous devriez voir un éclat phasique des potentiels d'action. Alternativement, une conductance peut être donnée à RTXI via une sortie analogique (figure 1A, g (t) '). Un facteur d'échelle approprié doit être utilisé dans RTXI de convertir le signal de volts à Siemens. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs Une installation réussie pour l'application d'une conductance de l'aide du collier dynamique est montré dans la figure 1A. En utilisant cette configuration, nous avons fait une cellule entière d'enregistrement somatiques à partir d'un neurone dopaminergique dans la substance noire pars compacta. Cellules dopaminergiques généralement feu spontanément à des taux bas avec un motif stimulateur-comme. Un éclat de potentiels d'action peuvent être évoqués par l'application d'une conductance phasique du récepteur NMDA avec pince dynamique (figure 1B). <img src="/files/ftp_upload/2275/2275fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1: Application de la conductance des récepteurs NMDA en utilisant la technique du clamp dynamique. Installation du matériel illustrant A. les liens entre la plate-forme d'enregistrement intracellulaire et de l'ordinateur pince dynamique. B. Une salve de potentiels d'action est évoquée par l'application d'une conductance des récepteurs NMDA 40ns dans un enregistrement de cellules entières d'une substantia nigra pars compacta neurone dopaminergique.

<ol><li>Robinson, H. P., Kawai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+of+digitally+synthesized+synaptic+conductance+transients+to+measure+the+integrative+properties+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons.</a> J Neurosci Methods. 49, 157-165 (1993).</li>
<li>Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+clamp%3A+artificial+conductances+in+biological+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The dynamic clamp: artificial conductances in biological neurons.</a> Trends Neurosci. 16, 389-394 (1993).</li>
<li>Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+clamp%3A+computer-generated+conductances+in+real+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons.</a> J Neurophysiol. 69, 992-995 (1993).</li>
<li>Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+clamp+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The dynamic clamp comes of age.</a> Trends Neurosci. 27, 218-224 (2004).</li>
<li>Deister, C. A., Teagarden, M. A., Wilson, C. J., Paladini, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intrinsic+neuronal+oscillator+underlies+dopaminergic+neuron+bursting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An intrinsic neuronal oscillator underlies dopaminergic neuron bursting.</a> J Neurosci. 29, 15888-15897 (2009).</li>
<li>Lobb, C. J., Wilson, C. J., Paladini, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamic+role+for+GABA+receptors+on+the+firing+pattern+of+midbrain+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">A dynamic role for GABA receptors on the firing pattern of midbrain dopaminergic neurons.</a> J Neurophysiol. 104, 403-413 (2010).</li>
</ol>

La technique du clamp dynamique démontré ici améliore la technique traditionnelle de l&#39;injection de courant continu en permettant à l&#39;expérimentateur de mimer les effets électriques de l&#39;activation d&#39;un récepteur. Dans cette vidéo, nous avons montré que l&#39;on peut ajouter les effets de l&#39;activation d&#39;un récepteur NMDA à l&#39;activité spontanée des neurones dopaminergiques, c&#39;est à dire un éclat de potentiels d&#39;action sont évoqués. Grâce à la flexibilité de la mise en œuvre du matériel / logiciel, une variété d&#39;extensions peuvent être utilisées. Le signe du courant injecté peut être commuté du négatif au positif, ce qui représente un scénario où les effets de récepteur activé est retiré d&#39;un neurone. Neurones du modèle, représenté sous la forme d&#39;une série d&#39;équations différentielles, peuvent également être résolues numériquement et permettre à l&#39;expérimentateur d&#39;étudier les petits réseaux.

<table><tbody><tr><td>K-gluconate anhydre</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Réactif</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; X 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Réactif</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acide éthylène glycol-bis(B-amin&amp;#8211;éthyl éther)-N,N,N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;-tétraacétique</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Réactif</td><td>MP Biomedicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaGTP</td><td>Réactif</td><td>MP Biomedicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Réactif</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, Anhydre</td><td>Réactif</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Réactif</td><td>Acros Organics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Réactif</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CholCl</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Réactif</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acide ascorbique</td><td>Réactif</td><td>Acros Organics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutathion</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope Olympus BX51WI (avec objectif 40x)</td><td>Microscope</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 convertisseurs A/N</td><td>Équipement</td><td>Tout fournisseur</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiclamp 700B avec tête CV-7B</td><td>Équipement</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tireuse de micropipettes P-97 Flaming/Brown</td><td>Équipement</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aiguilles de seringue Microfil</td><td>Équipement</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulateur</td><td>Équipement</td><td>Siskiyou, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Moniteur</td><td>Équipement</td><td>Triview</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

application d&#39;une conductance des récepteurs nmda dans les neurones dopaminergiques mésencéphale de rat utilisant la technique du clamp dynamique

Application of a NMDA Receptor Conductance in Rat Midbrain Dopaminergic Neurons Using the Dynamic Clamp Technique

Les neuroscientifiques étudier le fonctionnement du cerveau en étudiant comment les neurones dans le cerveau communiquent. De nombreux chercheurs examiner les changements de l&#39;activité électrique d&#39;un ou plusieurs neurones en réponse à une entrée expérimentalement contrôlé. L&#39;activité électrique des neurones peuvent être enregistrés dans des tranches de cerveau isolé en utilisant des techniques de patch-clamp avec les micropipettes de verre. Traditionnellement, les expérimentateurs peuvent imiter entrée neuronale par injection directe de courant à travers la pipette, la stimulation électrique des cellules ou encore des connexions axonales dans la tranche, ou la manipulation pharmacologique par les récepteurs situés sur la membrane de la cellule neuronale enregistrée. Directe d&#39;injection de courant a les avantages du passage d&#39;un signal de courant prédéterminé avec précision temporelle élevée à l&#39;emplacement de l&#39;enregistrement (en général le soma). Cependant, il ne change pas la résistance de la membrane neuronale pas les canaux ioniques sont physiquement ouvert. Injection de courant emploie habituellement des impulsions rectangulaires et n&#39;a donc pas le modèle de la cinétique des canaux ioniques. Enfin, l&#39;injection de courant ne peut pas imiter les changements chimiques dans la cellule qui se produit avec l&#39;ouverture de canaux ioniques. Les récepteurs peuvent être physiquement activées par la stimulation électrique ou pharmacologique. L&#39;expérimentateur a une bonne précision temporelle de l&#39;activation du récepteur avec une stimulation électrique de la tranche. Cependant, il est limité précision spatiale de l&#39;activation du récepteur et la nature exacte de ce qui est activé lors de la stimulation est inconnue. Ce dernier problème peut être partiellement atténué par des agents pharmacologiques spécifiques. Malheureusement, le cours du temps d&#39;activation des agents pharmacologiques est généralement lente et la précision spatiale des entrées enregistrées sur la cellule est inconnue. La technique du clamp dynamique permet un expérimentateur de changer le courant passe directement dans la cellule basée sur la rétroaction en temps réel du potentiel de membrane de la cellule (Robinson et Kawai 1993, Sharp et al, 1993a, b;. Pour revue, voir Prinz et al. 2004). Cela permet à un expérimentateur pour imiter les changements électriques qui se produisent sur le site de l&#39;enregistrement en réponse à l&#39;activation d&#39;un récepteur. En temps réel des modifications dans le courant appliqués sont déterminés par une équation mathématique mis en œuvre dans le matériel. Nous avons récemment utilisé la technique du clamp dynamique pour enquêter sur la génération de salves de potentiels d&#39;action par l&#39;activation phasique des récepteurs NMDA dans les neurones dopaminergiques de la substantia pars compacta du locus niger (Deister et al, 2009;. Lobb et al, 2010).. Dans cette vidéo, nous démontrons les procédures nécessaires pour appliquer une conductance des récepteurs NMDA dans un neurone dopaminergique.

Dans cette vidéo, nous démontrons comment appliquer une conductance dans un neurone dopaminergique enregistrés dans la configuration cellule entière dans les tranches de cerveau de rat. Cette technique est appelée le collier dynamique.

Application d&#39;une conductance des récepteurs NMDA dans les neurones dopaminergiques mésencéphale de rat utilisant la technique du clamp dynamique

Les neuroscientifiques étudient le fonctionnement du cerveau en examinant la manière dont les neurones communiquent entre eux. De nombreux chercheurs analysent les changements dans le...

Les neuroscientifiques étudient le fonctionnement du cerveau en examinant la manière dont les neurones communiquent entre eux. Ici, des modifications de l'activité électrique d'un neurone unique sont provoquées par l'application d'une conductance contrôlée expérimentalement à l'aide de la technique du clampage dynamique. Tout d'abord, des tranches cérébrales fines sont découpées et conservées dans une chambre d'incubation remplie de liquide céphalorachidien artificiel.Une tranche est ensuite transférée vers un dispositif d’enregistrement en configuration de patch clamp. Un neurone est sélectionné, puis scellé à l’aide d’une électrode d’enregistrement en utilisant un ordinateur de clampage dynamique relié à l’amplificateur d’enregistrement. Une conductance des récepteurs NMDA est appliquée dans la cellule.Les enregistrements obtenus montrent un sursaut de potentiels d'action, suggérant que l'activation des récepteurs NMDA constitue un mécanisme cellulaire par lequel les neurones dopaminergiques peuvent générer des salves. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes actuelles telles que l'injection de courant continu ou le traitement pharmacologique réside dans notre capacité à déterminer précisément les effets de l'activation d'un récepteur défini expérimentalement sur l'activité électrique d'un neurone vivant. Après avoir rapidement extrait le cerveau d'un rat Bragg dolly anesthésié, découper des tranches cérébrales horizontales de 240 micromètres à l'aide d'un microtome vibrant.Au fur et à mesure que les tranches sont découpées, utilisez une pipette de transfert pour les placer dans une chambre d'incubation à 32 degrés Celsius remplie de liquide céphalorachidien artificiel jusqu'au moment de réaliser les expériences d'enregistrement. Le dispositif d'enregistrement intracellulaire est composé d'un microscope équipé d'objectifs configurés pour l'imagerie en contraste de gradient, d'un moniteur, d'un système de perfusion, d'un amplificateur MultiClamp 700B, d'un convertisseur analogique-numérique, d'un micromanipulateur et d'une tête d'amplification. Un ordinateur Mac Pro exécute le logiciel d'acquisition de données, AxoGraph X, ainsi que le logiciel MultiClamp Commander. À côté du dispositif d'enregistrement intracellulaire et de l'ordinateur Mac Pro se trouve un ordinateur Sun Microsystems fonctionnant sous Linux en temps réel, accompagné de son convertisseur analogique-numérique, qui sera utilisé avec la technique de « clamp » dynamique.Le dispositif d'enregistrement intracellulaire doit perfuser un liquide céphalorachidien artificiel à environ 35 degrés Celsius. Si la coupe destinée à l'enregistrement a été préparée horizontalement, utilisez une pipette de transfert pour la placer dans une boîte de Pétri contenant du liquide céphalorachidien artificiel, puis, à l'aide d'un outil de découpe, divisez la coupe en deux le long de la ligne médiane. Ensuite, pour effectuer les enregistrements électrophysiologiques, utilisez une pipette pour transférer la coupe vers le dispositif d'enregistrement intracellulaire.À l’aide de l’objectif 40 x, visualisez le neurone cible ici ; un neurone dopaminergique individuel de la substance noire est visible. Notez le soma de forme elliptique avec deux dendrites qui s’étendent. À l’aide d’un tireur de micropipettes électronique P 97, tirez des électrodes ayant une résistance de pointe comprise entre quatre et dix mégohms.Ensuite, à l’aide d’une aiguille de seringue microfill, remplir une électrode avec la solution interne. Insérer l’électrode remplie dans la demi-cellule, reliée à l’étage d’entrée de l’amplificateur, en utilisant une seringue connectée à la demi-cellule par un court morceau de tubulure. Appliquer une faible pression positive sur l’électrode d’enregistrement.Sous contrôle visuel, abaissez l'électrode sur le neurone cible. Un affaissement sera visible à la surface de la cellule. Appliquez une faible pression négative pour former un scellement gigaseal sur le neurone souhaité.Appliquez une aspiration par la bouche pour rompre le scellement. Cela constitue un enregistrement en configuration whole cell. Une fois le scellement rompu, utilisez l'interface logicielle Multi Clamp Commander pour placer l'amplificateur en mode courant nul, dans lequel aucun courant ne peut être injecté.Pour appliquer une conductance NMDA à cette cellule, commencez par exécuter le logiciel RTXI sur l'ordinateur de clampage dynamique. Chargez ensuite un modèle personnalisé contenant un récepteur NMDA en mémoire. Une fois le modèle chargé en mémoire par RTXI, le courant à injecter dans la cellule sera calculé en temps réel à l'aide de l'équation indiquée ici, où G-N-M-D-A correspond à la conductance souhaitée en nanos, les semens étant réglés à zéro nanos.Par défaut, MG représente la concentration en magnésium. E-N-M-D-A est le potentiel de renversement pour le récepteur NMDA, fixé à zéro millivolt, et VM est le potentiel membranaire de la cellule mesuré à partir de l'amplificateur en millivolts. Maintenant, à l'aide d'un câble BNC standard, reliez la sortie de l'ordinateur de clampage dynamique à l'entrée de commande de l'amplificateur via un convertisseur analogique-numérique.Placez l'amplificateur en mode de blocage de courant standard ic à l'aide de l'interface logicielle Multi Clamp Commander. RTXI a été configuré pour recevoir la conductance souhaitée GFT à partir d'un signal de tension provenant du logiciel d'acquisition de données Axo Graph X. Ici, nous exécutons un protocole simple AXO Graph X dans lequel un saut de conductance d'une seconde de 40 nano Siemens est appliqué à la cellule.Un train d'impulsions est déclenché en réponse à un saut de conductance en utilisant le dispositif décrit dans cette vidéo ; un enregistrement somatique en configuration tout-cellule réalisé sur un neurone dopaminergique de la substance noire pars compacta a été effectué. Les cellules dopaminergiques présentent généralement une activité spontanée à faible fréquence, avec un patron de type pacemaker. Un train d'impulsions peut être déclenché par l'application phasique d'une conductance des récepteurs NMDA à l'aide du clampage dynamique.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment appliquer une conductance NMDA dans un neurone dopaminergique vivant au sein d'une tranche cérébrale isolée. Toutefois, cette technique peut être utilisée pour tout type cellulaire pouvant être enregistré à l’aide de techniques électrophysiologiques classiques. De même, le clampage dynamique peut être étendu afin de reproduire les effets électriques d’un large éventail de types de récepteurs.Nous espérons que cette vidéo vous a été utile pour comprendre en quoi consiste la technique du clampage dynamique et comment nous l'utilisons dans notre laboratoire. Merci donc d'avoir regardé.

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Application d'une conductance des récepteurs NMDA dans les neurones dopaminergiques mésencéphale de rat utilisant la technique du clamp dynamique

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