Un allèle spécifique Assay expression du gène pour l'épreuve la base fonctionnelle des associations génétiques

L'objectif général de l'expérience suivante est de tester si une variante d'ADN particulière, comme celle associée à une maladie, a un effet sur l'expression d'un gène particulier. Cela est réalisé en sélectionnant des lignées cellulaires hétérozygotes à la fois pour cette variante et pour un polymorphisme nucléotidique simple dans le gène d'intérêt. Dans une deuxième étape, l'ADN et l'ARN sont extraits des cellules, puis utilisés comme matrice pour une réaction d'extension primaire spécifique aux allèles.

Les produits de l'extension primaire suivants sont ensuite analysés par spectrométrie de masse afin de quantifier l'abondance relative des deux allèles. Les résultats obtenus indiquent si la variante d'ADN initiale associée à une maladie est également associée à une différence d'expression génique, basée sur des mesures quantitatives spécifiques aux allèles par spectrométrie de masse. Les principaux avantages de cette technique sont qu'elle ne nécessite pas de manipulation moléculaire, contrairement à un essai de gène rapporteur luciférase, et qu'elle mesure les niveaux endogènes d'expression génique.

De plus, nous sommes en mesure de comparer les niveaux d'expression entre les deux allèles de manière internement contrôlée, ce qui élimine une partie de la variabilité expérimentale. Cette méthode nous aide à répondre à des questions essentielles dans le domaine de la génétique humaine, telles que les mécanismes moléculaires sous-jacents aux associations génétiques. Nous avons conçu cette méthode pour la première fois lorsque nous avons identifié une association génétique s'étendant sur trois gènes et que nous n'avons pas pu affiner le signal vers un seul gène.

Par cartographie génétique plus poussée. Les cellules utilisées pour ce dosage doivent exprimer le gène d'intérêt et satisfaire à deux exigences génotypiques fondamentales. Elles doivent être hétérozygotes à la fois pour les séquences d'ADN associées à la maladie et pour les marqueurs d'ADN, permettant de distinguer les transcrits selon leur origine chromosomique. Dans la stratégie de sélection de lignées cellulaires illustrée ici, les lignées cellulaires A et B sont hétérozygotes pour un marqueur codant transcrit, représenté par des triangles.

Cependant, la lignée cellulaire Omnicell A est hétérozygote pour la séquence d'ADN associée à une maladie, appelée variante d'ADN à risque, représentée par des cercles. L'allèle bleu de la variante à risque est associé à un niveau plus faible de transcription. Après avoir sélectionné la culture de la lignée cellulaire, les cellules dans un flacon selon les spécifications du fournisseur, nous utiliserons des fibroblastes dans cette démonstration. Bien que cet essai soit également applicable à d'autres types cellulaires, y compris les cellules primaires, préparez deux boîtes de Pétri de 10 centimètres pour les extractions d'ADN et d'ARN respectivement.

Lorsque les cellules atteignent une confluence de 80 %, elles peuvent être récoltées pour des extractions d'ADN et d'ARN en utilisant des méthodes standard, y compris des kits disponibles commercialement adaptés au type cellulaire sélectionné. Avant de réaliser ce test, concevoir deux paires d'amorces PCR pour chaque marqueur d'ADN, une paire pour l'amplification de l'ADN génomique et l'autre pour l'amplification d'ADNc ; placer les amorces sens et antisens pour l'amplification d'ADNc dans des exons différents afin d'éviter toute contamination génomique ; concevoir les amorces de manière à obtenir un produit PCR compris entre 100 et 500 paires de bases de longueur pour chaque lignée cellulaire ; préparer des réactions PCR de huit microlitres. Quatre réactions indépendantes pour l'amplification de l'ADN génomique et quatre réactions indépendantes pour l'amplification d'ADNc à chaque fois.

La micro-PCR contient le tampon MLA, les dNTP, les amorces, le chlorure de magnésium et soit de l'ADN génomique soit de l'ADNc. Réaliser les réactions de PCR dans les conditions optimisées pour chaque paire d'amorces, en maintenant le nombre de cycles dans la phase linéaire d'amplification. Une fois les réactions de PCR terminées, éliminer les amorces de PCR et les dNTP en excès en ajoutant de l'exonucléase I et de la phosphatase alcaline de crevette (SAP) à chaque produit de PCR, puis en incubant à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes, suivies de 15 minutes à 85 degrés Celsius.

Déposez chaque produit de PCR en double sur une plaque de 384 puits, de sorte que huit mesures soient disponibles pour chaque échantillon. Au total, 16 dépôts pour le dosage d'extension primaire. Concevez l'amorce d'extension à l'aide du logiciel de conception de dosage de manière à ce que la même amorce puisse être utilisée à la fois pour les produits génomiques et ceux de la PCR d'ADN-C.

Spécifiez une longueur d'amorce comprise entre 14 et 18 paires de bases. Réalisez la réaction d'extension primaire avec un mélange approprié de trois terminateurs déssoxyribonucléotidiques et d'un déssoxyribonucléotide. Une réaction d'extension primaire typique comprend une étape initiale à 94 degrés Celsius pendant deux minutes, suivie de 40 cycles de 94 degrés Celsius pendant cinq secondes, 52 degrés Celsius pendant cinq secondes et 72 degrés Celsius pendant cinq secondes.

Enfin, les oligonucléotides allongés sont quantifiés par spectrométrie de masse à désorption/ionisation par laser assistée par matrice et temps de vol, en utilisant un spectromètre de masse spectro reader. Un point clé de ce protocole consiste à utiliser plusieurs stratégies pour contrôler le bruit expérimental et éliminer les artefacts. Il est vraiment important de répéter l'expérience au moins trois fois.

Le meilleur témoin pour l'expérience consiste à utiliser une lignée cellulaire hétérozygote pour le test de polymorphisme ponctuel du revêtement destiné à l'extension primaire, mais qui ne porte pas l'allèle associé à la maladie. En outre, concevoir des tests pour des marqueurs codants transcrits d'ADN alternatifs. Si ceux-ci ne sont pas disponibles, un témoin supplémentaire peut être fourni par des paires d'amorces PCR alternatives ciblant différents exons pour le test d'extension primaire.

Un contrôle interne peut être assuré par la conception des amorces d'extension et leur hybridation aux brins direct et inverse. Un exemple d'analyse d'expression allélique spécifique est présenté ici, accompagné d'exemples de profils de spectrométrie de masse. Cette figure montre les résultats de l'analyse de quatre produits primaires d'extension spécifiques à un allèle, réalisée sur quatre matrices différentes.

Les deux graphiques supérieurs représentent les résultats obtenus à partir de l'analyse de l'ADN génomique de deux lignées cellulaires différentes, chacune étant hétérozygote pour un polymorphisme codant transcrit. Toutefois, seule la lignée cellulaire A est hétérozygote pour la variante d'ADN à risque. Les deux graphiques inférieurs représentent les résultats obtenus à partir de l'analyse de l'ADNc généré à partir des mêmes lignées cellulaires en raison d'un artefact expérimental.

Le premier pic est toujours plus élevé que le second pic, même dans l'analyse génomique. Par conséquent, les résultats de l'analyse génomique sont utilisés pour normaliser les données d'ADNc. L'analyse statistique est réalisée en extrayant l'intégralité du rapport de typage ELO à l'aide du logiciel de type mass array.

Ce rapport fournit des données sur la surface des pics, et nous présentons ici un exemple relatif à deux lignées cellulaires, la cellule A et la cellule B, hétérozygotes pour un SNP codant, mais seule la cellule A étant hétérozygote pour un marqueur associé à une maladie. Les colonnes en gris sont générées directement par le logiciel, tandis que les colonnes en vert sont déterminées manuellement pour chaque cellule. Il existe huit mesures tant pour l'ADNc que pour l'ADN génomique.

Le logiciel calculera la surface sous chaque pic du spectre, ce qui représente l'abondance de chacun des deux allèles. Le rapport entre les allèles est calculé en divisant la surface de l'allèle un par celle de l'allèle deux pour chaque échantillon d'ADNc et génomique. Une moyenne et une erreur standard sont calculées à partir des huit mesures.

Une erreur standard élevée, supérieure à 0,1, indique que les mesures ne sont pas cohérentes et doivent être écartées. Enfin, le rapport moyen d'ADNc est normalisé à l'aide du rapport moyen d'ADN génomique afin d'estimer l'écart par rapport à un rapport égal à un, valeur attendue en l'absence de différence d'expression allélique. Le rapport normalisé diffère de un dans la cellule A, mais est proche de un dans la cellule B ; ces données suggèrent que la lignée cellulaire A porte une variante d'ADN en phase avec l'allèle mesuré par le second pic, ce qui réduit l'expression du gène analysé.

La lignée cellulaire B fournit un contrôle négatif très pratique. Il est essentiel, lors de la mise en œuvre de cette procédure, de définir des variants génétiques informatifs et d'établir des contrôles expérimentaux appropriés après avoir suivi cette méthode. D'autres approches peuvent être utilisées, comme l'immunoprécipitation de chromatine spécifique à un haplotype, qui permettent de répondre à des questions telles que l'existence de variants génétiques pour lesquels aucun marqueur transcrit n'est disponible afin d'analyser l'expression allélique spécifique des gènes.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment analyser l'ARN de manière spécifique à l'allèle et comment utiliser cette approche pour étudier des variants fonctionnels génétiquement importants.