Pharmacologie comportementale dans le conditionnement classique de la réponse Extension Proboscis chez les abeilles ( Apis mellifera)

L'objectif général de cette procédure est d'étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents à l'apprentissage et à la formation de la mémoire. Chez les abeilles, la première étape consiste à recueillir des abeilles en vol libre depuis leur ruche. Ensuite, les abeilles sont fixées dans des tubes en plastique.

La troisième étape de la procédure consiste à réaliser un conditionnement classique. Des médicaments peuvent être injectés à certains moments précis autour du conditionnement afin d'étudier leur effet sur l'apprentissage et la formation de la mémoire. La dernière étape de la procédure consiste à évaluer la rétention de la mémoire.

En fin de compte, les changements de comportement après un traitement médicamenteux peuvent révéler les mécanismes moléculaires sous-jacents à l'apprentissage et à la formation de la mémoire. Chez les abeilles. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'apprentissage et de la mémoire en mettant au jour les mécanismes moléculaires de la formation de la mémoire.

En général, les chercheurs novices dans cette méthode rencontreront des difficultés, car le moment de la présentation des stimuli pendant l'apprentissage et la récupération de la mémoire doit être précis. De plus, le régime d'alimentation est critique. La procédure sera démontrée par Cutting Gearing et Johannes Faberg à des étudiants de master de mon laboratoire. La veille de l'expérience, collectez les abeilles entre 14 h et 16 h à l’aide d’une pyramide en plexiglas perméable à la lumière UV.

Une fois revenu au laboratoire, placez la pyramide sur sa base et assombrissez les parois avec une serviette en laissant l'apex découvert. Ouvrez l'apex et tenez un flacon en verre au-dessus de l'ouverture, permettant à une seule abeille de pénétrer dans le flacon avant de refermer. Poursuivez cette procédure jusqu'à ce que toutes les abeilles aient été transférées dans un flacon en verre en automne et en hiver.

Lorsque les abeilles ne volent pas à l'extérieur, une ruche est conservée à l'intérieur d'une serre dans un filet ; des abeilles individuelles sont alors capturées directement dans le filet. À l’aide d’un flacon en verre par abeille, immobilisez l’abeille en refroidissant le flacon sur de la glace pendant deux minutes et demie à trois minutes et demie. Surveillez attentivement l’abeille et retirez-la de la glace dès qu’elle cesse de bouger.

Immobilisez l'abeille dans un petit tube en plastique à l'aide d'un ruban adhésif. Veillez à ce que l'abeille puisse librement bouger son abdomen, mais pas sa tête, son thorax ni ses pattes. Il est également important de ne pas comprimer le cou.

Une fois l'abeille préparée, placer le tube dans un trou numéroté sur une plaque. Pour un meilleur maniement et une identification plus facile.

Les tubes sont toujours réinsérés dans le même trou. Après manipulation, nourrissez les abeilles entre 16 h et 18 h à un endroit distinct du site d'entraînement. Provoquez la réponse d'extension proboscidienne ou PER en touchant les abeilles et leurs antennes.

Avec une solution de saccharose, laissez l'abeille consommer une goutte d'environ quatre microlitres de solution d'ARS. Veillez à ne pas salir les antennes, les pièces buccales ou le tube en plastique de l'abeille. Nourrissez chaque abeille jusqu'à ce qu'elle n'en veuille plus.

Montrez un PER rapide et fiable lorsque leurs antennes sont touchées avec la solution. Lors des soirées suivantes de l'expérience, nourrissez chaque abeille quatre fois avec une goutte de solution de saccharose. Remplissez un bol en plastique d'environ 0,5 à un centimètre de hauteur avec de l'eau du robinet.

Placer la grille avec les abeilles harnachées dans le bol en utilisant des plaques lysa comme plateforme. Couvrir le bol avec du carton et stocker à température ambiante pendant la nuit. Les abeilles subissent une conditionnement olfactif vers 10h00 le matin suivant la collecte.

30 minutes avant le début de l'expérience. Placer le support contenant les abeilles harnachées près du site de conditionnement, mais à l'écart de l'ouverture du tuyau d'évacuation où les abeilles seront entraînées. Ensuite, préparer le stimulus conditionnel en travaillant sous une hotte.

Utilisez une pipette à embout filtrant pour prélever quatre microlitres d'huile de clou de girofle et les déposer sur un papier filtre rond. Placez le papier filtre parfumé dans une seringue de 20 millilitres et insérez le piston. Réglez le lecteur audio qui délivrera un signal acoustique à l'expérimentateur.

Cela garantit le minutage précis du stimulus, du début du stimulus, de la fin du stimulus, de la durée et du positionnement. Préparez-vous à enregistrer le comportement de l'abeille tout au long de l'acquisition. Un score positif est attribué si l'abeille étend son SSIS entre le début du stimulus conditionné et la présentation du stimulus non conditionné.

Traverser une ligne virtuelle entre les mandibules ouvertes. Pour commencer un essai d'acquisition, sélectionnez l'abeille à entraîner et placez-la devant l'échappement pendant 10 secondes. Peu avant la fin de cet intervalle de dix secondes, positionnez la seringue contenant l'odeur à trois centimètres des abeilles et des antennes. Présentez l'odeur pendant cinq secondes en poussant 20 millilitres d'air à travers la seringue.

Après trois secondes, introduire le stimulus non conditionné en touchant la partie ventrale du flagelle distal des deux antennes avec une solution de saccharose, à l’aide d’un cure-dent humide. En prenant soin de ne pas déposer la solution sur les abeilles ni sur leurs antennes, on laisse ensuite l’abeille lécher le cure-dent. Ce stimulus composé dure quatre secondes, après quoi les abeilles sont retirées du contexte d’entraînement et replacées dans le support.

13 secondes après la présentation du stimulus conditionnel, un essai d'entraînement dure 28 secondes. Ramenez l'abeille sur le site d'entraînement après un intervalle inter-essai de 10 minutes. Réalisez le deuxième des trois essais comme indiqué précédemment, puis attendez encore 10 minutes avant d'effectuer le dernier appariement.

Une fois l'entraînement terminé pour la journée, remettez les supports dans le bol. N'oubliez pas de nourrir chaque abeille quatre fois avec une goutte de solution de saccharose de quatre microlitres entre 16 h et 18 h. Comme démontré précédemment, des tests de rétention peuvent être réalisés à tout intervalle allant de quelques minutes à plusieurs jours après l'entraînement. Préparez-vous au test de mémoire en plaçant le support d'abeilles près du site de conditionnement pendant 30 minutes.

Commencez le test en plaçant une abeille devant l'orifice d'échappement pendant 10 secondes. Présentez le stimulus conditionnel pendant cinq secondes et notez l'apparition d'une RPE. Une fois les tests terminés pour la journée, replacez les supports dans le bol.

Veillez à nourrir chaque abeille quatre fois avec une goutte de quatre microlitres de solution de saccharose entre 16 h et 18 h, comme indiqué précédemment. À la fin de l'ensemble de l'expérience, vérifiez que l'abeille est toujours capable d'extérioriser son proboscis en touchant ses antennes avec la solution SRA afin qu'elle soit incluse dans l'analyse ; les abeilles doivent survivre à toute l'expérience et présenter une PER intacte. Dans certaines études, des injections systémiques sont utilisées pour étudier l'effet d'interventions pharmacologiques sur la mémoire olfactive. Ces injections peuvent être administrées à différents moments selon le protocole expérimental.

Pour commencer, faites un petit trou dans la cuticule de la partie postérieure du S scootin près de la fissure du S scootle, au-dessus du muscle volant, à l’aide d’une aiguille hypodermique jetable. Ensuite, remplissez un tube capillaire en verre avec un microlitre de la solution à tester. Insérez le capillaire dans l’orifice de la cuticule et injectez la solution dans le muscle volant.

Des expérimentateurs formés sont capables d'injecter un B toutes les 30 secondes, permettant un minutage précis de l'injection et du conditionnement. Deux expériences sont présentées ici. La première expérience examine l'impact d'une injection systémique de sérum physiologique administrée avant l'entraînement sur l'apprentissage d'une mémoire.

Il existe trois groupes dans cette étude : un groupe ne recevant aucun traitement, un groupe recevant une injection systémique d'un microlitre de solution saline tamponnée au phosphate ou un groupe faux traitement. Ces traitements ont été administrés 30 minutes avant l'entraînement, illustré ici à gauche. Le pourcentage d'animaux présentant la réponse conditionnée au cours de l'acquisition a augmenté au fil des trois essais d'entraînement, sans différence significative entre les groupes.

Les histogrammes à droite montrent que ni l'injection de PBS ni la lésion factice n'ont affecté la rétention de la mémoire. Vingt-quatre heures après l'entraînement, dans la deuxième expérience, les injections ont été administrées 40 minutes après l'entraînement ; les abeilles ont alors été divisées en deux groupes : l'un recevant une solution saline, l'autre un microlitre d'inhibiteur de la synthèse protéique, l'Anisa mycine. Les histogrammes à droite montrent une nette diminution de la rétention de la mémoire chez les abeilles ayant reçu l'Anisa mycine. Ces résultats soulignent l'importance de la synthèse protéique dans la formation de la mémoire olfactive.

Après cette procédure, des enregistrements électrophysiologiques peuvent être effectués afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que quelle est la base neurophysiologique de l'apprentissage et de la formation de la mémoire après son développement ? Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l'étude de l'apprentissage et de la mémoire pour explorer les mécanismes moléculaires et neurophysiologiques impliqués dans la formation de la mémoire chez l'abeille domestique.