Cristallisation des protéines pour la cristallographie aux rayons X

L’objectif global de cette procédure est de produire des cristaux de protéines pour les expériences de diffraction des rayons X ici. Trois techniques différentes de criblage de cristaux sont démontrées : des méthodes de cristallisation par diffusion de vapeur, y compris la goutte suspendue et la goutte assise, ainsi que des méthodes de cristallisation par micro-lots sont décrites pour la cristallisation par diffusion de vapeur. Les puits sont remplis de précipitant.

Ensuite, une forte concentration d’échantillon de protéine purifiée est mélangée à l’agent précipitant. La goutte mélangée est ensuite scellée dans un puits contenant la solution précipitante. La cristallisation par micro-lots commence par le remplissage du puits avec de l’huile de paraffine.

La protéine est ensuite chargée dans les puits, suivie de la solution précipitante. L’étape finale de toutes les méthodes consiste à laisser le système s’équilibrer et à suivre l’apparence et la croissance des cristaux dans les gouttes. En fin de compte, des cristaux peuvent être obtenus à partir de cette technique et le motif de diffraction des protéines peut être déterminé à l’aide d’une source de rayons X dotée d’un détecteur approprié.

Bonjour, je m’appelle Sal et je travaille dans le laboratoire du professeur Yoga Motis au Département de biophysique moléculaire et de biochimie de l’Université de Yale. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure de cristallisation d’une protéine purifiée. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la base structurelle de l’infection virale.

Alors commençons, faisons pousser quelques cristaux. Pour identifier une méthode de cristallisation pour une macromolécule de choix, des criblages initiaux peuvent être effectués à l’aide de solutions de cristallisation disponibles dans le commerce qui sont choisies pour exploiter la méthode factorielle incomplète à matrice clairsemée des conditions d’essai. Ces conditions sont sélectionnées en fonction de conditions de cristallisation connues et généralement réussies pour les macromolécules.

Une fois que l’état de cristallisation est connu, un tamis étroit peut être assemblé pour faire varier la concentration du précipitant en pH autour du coup d’origine. Habituellement, les conditions de cristallisation utilisées pour ces tamis consistent en un assaut d’agent précipitant et un tampon pour fixer le pH, toutes les solutions mères doivent être filtrées à travers un filtre de 0,22 micron pour cette démonstration. Les conditions de cristallisation précédemment identifiées pour le lysosome de poulet sont utilisées avec du chlorure de sodium comme précipitant pour commencer la procédure en préparant des solutions d’un millilitre de diverses concentrations de chlorure de sodium dans 0,1 molaire d’acétate de sodium de divers phs.

Ensuite, décongelez, l’échantillon de protéines est stocké à moins 80 degrés Celsius et conservé sur de la glace. Les concentrations typiques de protéines sont de l’ordre de cinq à 50 milligrammes par millilitre avec des concentrations plus élevées, donnant généralement de meilleurs résultats. Ici, une solution de 50 milligrammes par millilitre de lysosome d’œuf de poule dans de l’acétate de sodium à 0,02 molaire pH 4,9 est utilisée.

Faites tourner l’échantillon pendant 15 minutes à 18 000 g et à quatre degrés Celsius pour éliminer les protéines partiellement agrégées ou le précipité de l’étape de décongélation. Ces agrégats peuvent interférer avec la croissance des cristaux et favoriser une agrégation supplémentaire. Après centrifugation.

Déterminez la concentration en protéines à partir de son absorbance à 280 nanomètres à l’aide d’un photomètre à spectre UV. La concentration en protéines peut être calculée à partir de la lecture de l’absorbance et du coefficient d’extinction de la protéine. Une fois que l’échantillon de protéines est prêt, remplissez un plateau de cristallisation de 24 puits avec 500 microlitres de solution de précipitant selon la carte du plateau.

Créez un anneau de graisse en silicone autour du bord de chaque puits sans fermer parfaitement l’anneau afin que l’air puisse s’échapper sur le puits. Plafond. Nettoyez la lame de couverture avec un spray d’air condensé ou une lingette professionnelle pour éviter la poussière, ce qui facilitera l’interprétation des gouttes de cristallisation et éliminera les contaminations. L’étape suivante consiste à pipeter des volumes égaux de l’échantillon de protéines et de la solution de réservoir sur la lame de couverture.

Cependant, différents volumes de protéines et de précipitants peuvent être essayés dans le cadre du processus d’optimisation : l’utilisation d’une plus grande quantité de protéines que de précipitant entraîne une concentration nette de la protéine dans la chute équilibrée, ce qui peut être souhaitable pour les échantillons de protéines dute ou pour ralentir la nucléation ou la croissance cristalline. Pour cette démonstration, deux microlitres de lysozyme de 50 milligrammes par millilitre dans de l’acétate de sodium 0,02 molaire. Le pH quatre est chargé au centre de la lame de couverture, suivi de deux microlitres de solution de cristallisation.

Lorsque vous pipetez des protéines et une solution réservoir sur la lame de couverture, soyez extrêmement prudent pour éviter la formation de bulles, qui se produit souvent lorsque l’air est soufflé hors de la pipette. Mélangez doucement la goutte pour aider à prévenir la précipitation prématurée des protéines en raison des concentrations localement élevées de précipitants dans la goutte Le mélange est particulièrement important pour les précipitants visqueux tels que le polyéthylène glycol à l’aide d’une pince à épiler. Retournez doucement la glissière du couvercle et posez-la sur l’anneau de graisse sur le dessus, bien faites-le de manière directionnelle afin que l’air puisse s’échapper du puits.

Sinon, l’air peut soulever la glissière du couvercle, compromettant l’étanchéité du puits. Passez au puits suivant jusqu’à ce que le plateau soit complet. Une fois le plateau installé, inspectez-le visuellement, en éliminant les particules de poussière et autres contaminants qui peuvent réduire l’identification faussement positive des cristaux de protéines.

Utilisez une feuille de score pour documenter l’expérience. Ensuite, placez le plateau à la température d’incubation souhaitée, généralement entre quatre degrés Celsius et la température ambiante. La température la plus réussie est de 20 degrés Celsius.

Prenez soin de manipuler le plateau avec douceur et d’éviter les secousses, les vibrations ou les changements de température pendant le transfert ou l’incubation peuvent empêcher la croissance des cristaux ou affecter négativement la qualité des cristaux. Vérifiez la présence de cristaux dans le plateau le lendemain, puis tous les quelques jours, en manipulant toujours les plateaux avec soin. Documentez les trouvailles et déposez les morphologies dans un bac Feuille de pointage spécifique.

Les cristaux mettent généralement de deux à cinq jours à apparaître, bien que les cristaux apparaissent parfois presque immédiatement ou jusqu’à plusieurs mois plus tard. Une fois que les conditions de cristallisation ont été identifiées et que le taux de croissance des cristaux est connu, il est préférable de laisser les plateaux intacts jusqu’à ce que les cristaux soient apparus et aient atteint au moins la moitié de leur taille finale. Laisser les plateaux intacts peut réduire le nombre d’événements de nucléation cristalline, ce qui entraîne ainsi un plus petit nombre de cristaux plus gros pour la cristallisation des gouttes assises Suivez la même procédure que pour la goutte suspendue, sauf que nous utiliserons un plateau de goutte bien assis à 24 puits dans lequel les lames de couverture ne sont pas nécessaires.

Au lieu de cela, le puits contient une étagère sur laquelle la protéine et le précipitant sont mélangés à la pipette, deux microlitres de solution de lysozyme de 50 milligrammes par millilitre au centre de l’étagère, évitant la génération de bulles d’air. Ensuite, ajoutez deux microlitres de solution précipitante à l’échantillon après la configuration du plateau. Scellez les puits avec du ruban adhésif avec une goutte d’assise.

Aucune glissière de couverture n’est nécessaire. Continuez l’incubation et l’encastrement des cristaux comme décrit pour la chute suspendue. Pour effectuer une procédure de micro-lot.

Préparez la solution de cristallisation et la protéine comme décrit pour la procédure de goutte suspendue. Procurez-vous un nouveau plateau de micro-lot et un spray d’air pour éviter la poussière et d’autres grosses particules dans le plateau de micro-lot. Ajoutez de l’huile de paraffine dans chaque puits à une profondeur de trois millimètres.

Retirez ensuite l’excès d’huile. Ensuite, chargez un microlitre de la solution protéique dans le puits prérempli, en vous assurant que la goutte coule au fond du puits. Chargez ensuite un microlitre de solution précipitante dans le puits.

Assurez-vous que la goutte coule au fond du puits et fusionne avec la gouttelette de protéine. Passez au puits suivant jusqu’à ce que le plateau soit complet et poursuivez l’incubation et l’analyse des cristaux comme décrit ici. Résultats typiques de la cristallisation des protéines.

Des expériences sont présentées. La précipitation amorphe se produit lorsque la protéine et/ou le précipitant sont en forte concentration. À l’inverse, les gouttes insaturées restent généralement claires.

La séparation de phase peut se produire si la protéine ou le détergent se sépare en une phase différente lorsqu’il est mélangé à certains précipitants à forte concentration. Dans des conditions optimales, les cristaux de protéines devraient former Arabidopsis csn. Sept cristaux de protéines obtenus dans le polyéthylène glycol 8 000 et l’acétate de magnésium apparaissent en forme de bâtonnet.

Les cristaux sont également des cristaux de protéines de lysosome obtenus dans une molaire, du chlorure de sodium et de l’acétate de sodium. pH 4,9. Cette vidéo en accéléré démontre que les cristaux de lysosome se transforment en grands prismes quelques heures après leur installation lors de l’utilisation de la méthode de la goutte suspendue.

Nous venons de vous montrer comment mettre en place une expérience sur les protéines lorsque vous effectuez cette procédure. Il est important de travailler dans un environnement qui contrôle constamment la température et l’humidité, car une humidité élevée aide à minimiser l’évaporation des gouttes, essayez d’adopter une technique qui minimise l’exposition de la goutte à l’air libre. Pour cette raison, il est essentiel de travailler dans un environnement de travail bien organisé.

Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.