Name: Stable profilage isotopique du flux métabolique intermédiaire dans la phase de développement et de ladulte Caenorhabditis elegans /em (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: Découvrez le profilage isotopique stable du flux métabolique intermédiaire chez Caenorhabditis elegans. Cette méthode permet de quantifier les altérations génétiques et pharmacologiques des voies métaboliques en temps réel.

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Ce travail a été financé en partie par le National Institutes of Health (K08-DK073545 et NICHD parrainé par la recherche intellectuelle et une déficience intellectuelle Centre bourse de nouveau), La Fondation de Philadelphie, et l&#39;Université de Pennsylvanie McCabe attribution (MJF), ainsi que le Tristan Mullen Fonds (MJF et MY). Le contenu est uniquement la responsabilité de leurs auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles des instituts nationaux de la santé.

<ol><li>Hope, I. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHope%2C+IA+%22C.+elegans%3A+A+practical+approach%22">C. elegans: A practical approach</a>. , University Press. Oxford. (1999).</li>
<li>Dingley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+chain+dysfunction+variably+increases+oxidant+stress+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory chain dysfunction variably increases oxidant stress in Caenorhabditis elegans.</a> Mitochondrion. 10, 125-136 (2010).</li>
<li>Jones, B. N., Gilligan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((o-Phthaldialdehyde+precolumn+derivatization+and+reversed-phase+high-performance+liquid+chromatography+of+polypeptide+hydrolysates+and+physiological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+chromatography%22%5BJournal%5D)">o-Phthaldialdehyde precolumn derivatization and reversed-phase high-performance liquid chromatography of polypeptide hydrolysates and physiological fluids.</a> Journal of chromatography. 266, 471-482 (1983).</li>
<li>Falk, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+pathway+profiling+of+mitochondrial+respiratory+chain+mutants+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+genetics+and+metabolism%22%5BJournal%5D)">Metabolic pathway profiling of mitochondrial respiratory chain mutants in C. elegans.</a> Molecular genetics and metabolism. 93, 388-397 (2008).</li>
<li>Yudkoff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+in+vivo+ureagenesis+with+stable+isotopes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+genetics+and+metabolism%22%5BJournal%5D)">Measuring in vivo ureagenesis with stable isotopes.</a> Molecular genetics and metabolism. 100, Suppl 1. 37-41 (2010).</li>
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</ol>

En appliquant la spectrométrie de masse pour mesurer l&#39;abondance isotopique en métabolites intermédiaires offre une image merveilleusement détaillée des changements biochimiques essentielles 5. Ici, nous avons fourni des protocoles détaillés pour exploiter cette méthodologie très sensible et spécifique pour évaluer le flux métaboliques intermédiaire dans le modèle animal génétiquement polyvalent, C. elegans. En effet, l&#39;alimentation des animaux qui vivent avec des isotopes stables étiquetés précurseurs métaboliques (comme le 13 C-glucose) permet un nouvel aperçu du flux voie intermédiaire métaboliques lors de la mesure d&#39;enrichissement isotopique des métabolites en aval. Nous avons développé une méthodologie fiable pour obtenir une solide analyse des flux à travers la glycolyse, le métabolisme du pyruvate, et le cycle de Krebs. Ceci peut être réalisé à la fois chez les animaux nourris des isotopes stables du début des larves des stades de développement ou le début de la période post-mitotiques pour adultes. L&#39;enrichissement isotopique de différentes espèces métabolite peut être étudiée en collaboration avec le ver gratuitement toute profilage des acides aminés par chromatographie liquide à haute performance, comme décrit précédemment 4, afin de déterminer absolue enrichissement isotopique dans différentes espèces de l&#39;alanine vers libre, l&#39;aspartate, le glutamate et la glutamine. En effet, les modèles compatibles d&#39;enrichissement isotopique sont obtenus lorsque l&#39;on mesure des acides aminés et acides organiques dans les analytes aliquotes de 1.000 à 2.000 jeunes vers adultes synchrone. Cette méthodologie peut discriminer sensibilité anormale du flux d&#39;intermédiaire dans le nucléaire basé sur les gènes mitochondriaux des souches mutantes par rapport aux vers de type sauvage. Cette technique a une valeur pour enquêter sur des altérations spécifiques de flux dans les voies biochimiques de la pertinence par rapport aux communes des erreurs innées du métabolisme. En particulier, l&#39;utilisation du glucose marqué avec des isotopes stables informe le flux de carbone à travers le centre des voies métaboliques de la pertinence d&#39;une maladie mitochondriale. En effet, nos données suggèrent l&#39;application d&#39;une telle méthodologie peut discriminer sensibilité anormale du flux d&#39;intermédiaire dans un réacteur nucléaire à base génétique sous-unité du complexe III mitochondrial souche mutante (ISP-1 (qm150)) par rapport à vers de type sauvage. Il est important de reconnaître que depuis l&#39;exposition isotopique est terminée sur une période de un à plusieurs jours, quantifiés enrichissement isotopique représente une valeur &quot;état stationnaire&quot; enrichissement plutôt que de flux quantifiables sur une période de temps définie, tels que fixés dans la cellule à base de modèles exposés à des isotopes pour une période de minutes à plusieurs heures. Une autre limite potentielle d&#39;interroger le flux voie au cours du développement des nématodes se rapporte à différentes longueurs du développement larvaire qui se produisent, en particulier les souches mutantes. Par exemple, beaucoup de graves mutations mitochondriales sont connus pour provoquer un arrêt lors de la troisième (L3) stade larvaire 6. Ainsi, l&#39;analyse de l&#39;incorporation d&#39;isotopes que chez les animaux qui survivent à l&#39;âge adulte peut ne pas être représentatifs de toute la population mutante. Toutefois, cette méthodologie pourrait être adaptée afin d&#39;évaluer l&#39;incorporation isotopique en métabolites intermédiaires à un stade larvaire spécifique (comme L2) plutôt que d&#39;attendre que les animaux d&#39;atteindre le stade adulte. De même, les animaux qui entrent dans le stade alternatif connu sous le nom de larves dauer probablement considérablement modifié (probablement inférieur) métaboliques flux relatif aux animaux qui procèdent directement à travers les quatre stades larvaires. Les futures études pourraient également être réalisées pour évaluer directement l&#39;incorporation isotopique des animaux étape dauer des différents fonds génétiques. Exposer les animaux à des isotopes stables pour une période déterminée (ici, 24 à 48 heures) en commençant une fois les animaux ont atteint le stade adulte jeune (comme détaillé dans le Protocole B) élimine l&#39;impact de la variable de périodes de développement. Alors que 13 C-glucose interroge seule la glycolyse, le métabolisme du pyruvate et de flux cycle de l&#39;acide tricarboxylique, d&#39;autres traceurs isotopiques pourraient être évalués à interroger le flux voie biochimique par d&#39;autres voies d&#39;intérêt chez les nématodes. Par exemple, 15 N-glycine pourrait être utilisé pour évaluer le chiffre d&#39;affaires d&#39;acides aminés dans les nématodes. Une autre limite potentielle de cette approche est le niveau de sensibilité de la détection de métabolites. Notre expérience suggère un minimum de 500 nématodes adultes jeunes sont requises pour mener à quantifier l&#39;incorporation isotopique par les méthodes HPLC et GC / MS employé ici. L&#39;utilisation d&#39;instruments avec une plus grande sensibilité, comme la chromatographie liquide ultra (UPLC), peut permettre une nouvelle réduction du nombre d&#39;animaux étudiés, même si nous pensons que ce n&#39;est probablement pas pour permettre une quantification fiable de métabolites et d&#39;incorporation isotopique en espèces de vers métabolite unique. Nous avons étudié les populations de vers de 1000 animaux par expérience, que nous avons trouvé détecter de façon fiable métabolites de faible abondance dans chaque souche. Cependant, certains métabolites, tels que le GABA, ne peuvent être quantifiés de manière fiable dans des populations beaucoup plus de nématodes, de l&#39;ordre de1x10 6 animaux 4. En résumé, le profilage des isotopes stables fournit un non-invasive et sûre (non radioactif) approche qui a longtemps été utilisé pour étudier les erreurs innées du métabolisme. L&#39;application de cette méthodologie à C. elegans fournit la capacité nouvelle pour examiner in vivo et en temps réel, des altérations métaboliques qui se produisent au niveau de l&#39;animal entier, qui peuvent résulter de différents troubles génétiques et / ou expositions agent pharmacologique.

<table><tbody><tr><td>S. basal</td><td></td><td>&lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt; - page 59</td><td>Protocoles A et B</td></tr><tr><td>Cholestérol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-8503</td><td>Protocole B</td></tr><tr><td>OP50 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>Centre de génétique Caenorhabditis</td><td></td><td>Protocoles A et C</td></tr><tr><td>K12 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>Centre de génétique Caenorhabditis</td><td></td><td>Protocole B</td></tr><tr><td>agar NGM</td><td>Research Products International Corp.</td><td>N81800-1000,0</td><td>Protocoles A, B et C</td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C glucose (marqué universellement)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>CLM-1396</td><td>Protocole A et C</td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;glucose C (1,6 marqué)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>CLM-2717</td><td>Protocole B</td></tr><tr><td>Acide perchlorique (PCA) à 60 %</td><td>Fisher Scientific</td><td>MK2766500</td><td>Protocoles A et B</td></tr><tr><td>&amp;#949;acide ε-aminocaproïque (étalon interne)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-2504</td><td>Protocoles A et B</td></tr><tr><td>MTBSTFA</td><td>Regis</td><td>270243</td><td>Protocole E</td></tr><tr><td>Acétonitrile</td><td>Regis</td><td>270010</td><td>Protocole E</td></tr><tr><td>Résine AG 1-X8, 100-200, forme chlorure</td><td>Bio-Rad</td><td>140-1441</td><td>Protocoles A et B (extraction des acides organiques)</td></tr><tr><td>Résine AG 50W-X8, 100-200, forme hydrogène</td><td>Bio-Rad</td><td>142-1441</td><td>Protocoles A et B (extraction des acides aminés)</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-8875</td><td>Protocole C</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td>Protocole C</td></tr><tr><td>3N HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>Protocole D</td></tr><tr><td>1N HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>Protocole A</td></tr><tr><td>0,1 N HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>Protocole D</td></tr><tr><td>4N NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;OH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30501</td><td>Protocole D</td></tr><tr><td>4N KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>484016</td><td>Protocoles A et B</td></tr><tr><td>Eau déionisée</td><td>Milli Q Biocel</td><td>ZMQA60F01</td><td>Protocole D</td></tr><tr><td>Hélium</td><td>Airgas</td><td>24001364</td><td>Protocole C2</td></tr><tr><td>Microscope stéréo zoom SMZ-800</td><td>Nikon Instruments</td><td>NI MNA41000</td><td>Protocoles A, B et C</td></tr><tr><td>pH-mètre</td><td>Fisher Scientific</td><td>S68167</td><td>Protocoles A et B</td></tr><tr><td>Centrifugeuse de table - 5804R</td><td>Eppendorf</td><td>05-400-93</td><td>Protocoles A et B</td></tr><tr><td>Agitateur rotatif incubé</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>M1324-0004</td><td>Protocole B</td></tr><tr><td>Mini agitateur rotatif LabRoller</td><td>Labnet International</td><td>H-5500</td><td>Protocoles A et B</td></tr><tr><td>Pestles</td><td>Kontes Corp</td><td>K749520-0090</td><td>Protocoles A et B</td></tr><tr><td>Perceuse</td><td>Kontes Corp</td><td>K749540-0000</td><td>Protocoles A et B</td></tr><tr><td>bécher en verre de 1 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-539P</td><td></td></tr><tr><td>Flacons Erlenmeyer de 1 L</td><td>VWR international</td><td>89000-368</td><td></td></tr><tr><td>Flacons Erlenmeyer de 25 mL</td><td>VWR international</td><td>89000-356</td><td>Protocole B</td></tr><tr><td>Tubes en verre ronds de 7 ml + bouchon en caoutchouc</td><td>VWR international</td><td>VT6431</td><td>Protocoles A, B et C1, C2</td></tr><tr><td>Tubes en verre ronds de 10 ml + bouchon en caoutchouc</td><td>VWR international</td><td>VT6430</td><td>Protocole C2</td></tr><tr><td>Tubes à bouchon bleu</td><td>Labco</td><td>438B</td><td></td></tr><tr><td>Tubes coniques en plastique de 50 ml</td><td>Falcon BD</td><td>14-959-49A</td><td>Tous les protocoles</td></tr><tr><td>Tubes microcentrifugeurs de 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-320</td><td>Protocoles A et B</td></tr><tr><td>Seringues (1 mL, 10 mL, 20 mL)</td><td>BD Biosciences</td><td>301025, 301029, 301031</td><td>Protocoles C1 et C2</td></tr><tr><td>aiguilles de calibre 25</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-253-131</td><td>Protocoles C1 et C2</td></tr><tr><td>Colonnes de chromatographie Poly-Prep</td><td>Bio-Rad</td><td>731-1550</td><td>Protocole D</td></tr><tr><td>Pipettes Pasteur</td><td>VWR international</td><td>14673-043</td><td>Protocole D</td></tr><tr><td>Plaques de Pétri de 60 mm</td><td>VWR international</td><td>25373-085</td><td>Protocole C</td></tr><tr><td>Chambre en verre (fond coupé d'un flacon de 1 L) équipée d'un robinet tripode étanche à la graisse</td><td>Personnalisé</td><td></td><td>Protocole C</td></tr><tr><td>Plaque de verre transparente optiquement</td><td>Personnalisé</td><td></td><td>Protocole C</td></tr><tr><td>Réacti-Vap III évaporateur</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>18826</td><td>Protocole D</td></tr><tr><td>Coton</td><td>VWR international</td><td>14224-516</td><td>Protocole D</td></tr><tr><td>Graisse pour vide élevé</td><td>Dow Corning</td><td>1597418</td><td>Protocole C1</td></tr><tr><td>Papier d'aluminium</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-18</td><td>Protocole B</td></tr><tr><td>Minuterie</td><td>ISC Bioexpress</td><td>T-2504-5</td><td>Protocole C</td></tr><tr><td>Spectromètre de masse à rapport de gaz</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td>Protocole D</td></tr><tr><td>GC-MS</td><td>Hewlett-Packard</td><td>5980/5971</td><td>Protocole D</td></tr><tr><td>GC-MS</td><td>Agilent Technologies</td><td>6980N/5973N</td><td>Protocole D</td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Varian Inc., Agilent</td><td>9010</td><td>Protocole D</td></tr></tbody></table>

stable profilage isotopique du flux métabolique intermédiaire dans la phase de développement et de l&#39;adulte caenorhabditis elegans</em

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable profilage isotopique a longtemps permis d&#39;enquêtes sensibles sur les conséquences métaboliques de mutations génétiques et / ou thérapies pharmacologiques dans des modèles cellulaires et de mammifères. Ici, nous décrivons des méthodes détaillées pour effectuer stables profilage isotopique du métabolisme intermédiaire et flux métaboliques dans le nématode Caenorhabditis elegans. Les méthodes sont décrites pour le profilage de l&#39;ensemble vis des acides aminés libres, le dioxyde de carbone marqué, étiqueté acides organiques et des acides aminés marqués chez les animaux exposés à des isotopes stables soit de développement précoce de croissance sur des plaques d&#39;agar nématodes ou le début que les jeunes adultes tandis exposée à divers traitements pharmacologiques en culture liquide. Acides aminés libres sont quantifiés par chromatographie liquide haute performance (CLHP) en aliquots ver toute extraction dans l&#39;acide perchlorique à 4%. Universellement étiqueté 13 C-glucose ou 1,6 - 13 C 2-glucose est utilisé comme le précurseur des isotopes stables de carbone dont l&#39;étiquette est tracée par spectrométrie de masse de dioxyde de carbone (à la fois l&#39;atmosphère et dissous) ainsi que des métabolites indicatif de flux à travers la glycolyse , le métabolisme du pyruvate, et le cycle de Krebs. Les résultats représentatifs sont inclus pour démontrer les effets du temps d&#39;exposition d&#39;isotopes, divers protocoles de compensation bactériennes, et les méthodes alternatives perturbations ver de type sauvage nématodes, ainsi que l&#39;ampleur relative de l&#39;incorporation isotopique dans mitochondriale vers le complexe III mutant (ISP-1 (qm150) ) par rapport au type sauvage vers. Application de profilage isotopique stable en présence de nématodes vivants offre une capacité nouvelle pour examiner l&#39;ensemble des altérations au niveau du métabolisme des animaux en temps réel qui sont causées par des troubles individuels génétiques et / ou thérapies pharmacologiques.

Stable profilage isotopique par analyse spectrométrique de masse chromatographie en phase gazeuse du flux métabolique intermédiaire est décrite dans le nématode,<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt;. Les méthodes sont détaillées pour évaluer l&#39;enrichissement isotopique en dioxyde de carbone, des acides organiques, acides aminés après une exposition pendant le développement d&#39;isotopes soit sur gélose ou durant l&#39;âge adulte dans la culture liquide.

Stable profilage isotopique du flux métabolique intermédiaire dans la phase de développement et de l&#39;adulte Caenorhabditis elegans</em

Le profilage isotopique stable permet depuis longtemps d'étudier avec sensibilité les conséquences métaboliques des mutations génétiques et/ou des thérapies pharmacologiques chez...

L'objectif général de l'expérience suivante est de surveiller de manière non invasive les modifications métaboliques en temps réel, au niveau de l'organisme entier, dans la glycolyse, le métabolisme du pyruvate et le cycle de l'acide tricarboxylique, modifications provoquées par des voies métaboliques individuelles, des altérations génétiques et/ou des traitements pharmacologiques. Cela est réalisé en administrant des isotopes stables à des nématodes vivants afin d'obtenir un enrichissement isotopique suffisant dans un plus grand nombre de métabolites, permettant ainsi la quantification des modifications génétiques et/ou pharmacologiques des voies métaboliques intermédiaires. Dans une deuxième étape, l'incorporation isotopique dans le dioxyde de carbone atmosphérique et dissous est mesurée par spectrométrie de masse en rapport gazeux, ce qui permet une évaluation plus directe des flux métaboliques intermédiaires sur de courtes périodes de temps.Ensuite, les échantillons sont traités pour l'analyse des acides aminés libres totaux chez le ver entier par HPLC, ainsi que par enrichissement isotopique des acides aminés et des acides organiques par GCMS, afin de quantifier les modifications du flux métabolique chez les nématodes. Après exposition aux isotopes stables, des résultats sont obtenus qui montrent les effets de durées variables d'exposition à l'isotope, de l'élimination bactérienne et de différentes méthodes de lyse des vers chez des vers sauvages, permettant d'analyser l'abondance isotopique dans les métabolites intermédiaires. Cette méthode peut fournir des informations sur la régulation du métabolisme intermédiaire.Il peut également être appliqué à nos systèmes tels que les lignées cellulaires de mammifères et les tissus. Nous avons eu pour la première fois l'idée de cette méthode en observant des anomalies constantes dans l'analyse des acides aminés libres des vers par HPLC, anomalies suggérant une altération du flux métabolique intermédiaire lors de modifications respiratoires primaires de la fonction. Pour commencer cette procédure.Des vers ayant été exposés à un précurseur métabolique marqué par un isotope stable, soit durant le développement, soit à l'âge adulte, sont récoltés dans un tube plastique de centrifugeuse de 1,5 millilitre. Nous diluons généralement les vers à une concentration de 1000 vers par millilitre. Ajouter de l'acide perchlorique à 60 % contenant de l'acide epsilon-aminocaproïque comme étalon interne aux vers, afin d'obtenir une concentration finale de 4 % d'acide perchlorique et de 20 nanomolaire d'étalon interne.Laisser reposer le ver pendant cinq minutes par gravité, puis retirer et conserver le surnageant dans un autre tube. L'étape suivante constitue l'un des aspects les plus critiques de cette procédure. Les vers doivent être complètement disruptés par tamisage avant l'analyse des métabolites libres. À l'aide d'un homogénéisateur en plastique et d'une perceuse motorisée, broyer les échantillons de vers pendant 15 secondes.Confirmez visuellement la disruption des vers par microscopie optique et répétez le broyage si nécessaire. Sur cette image, les panneaux A et B montrent les vers avant le broyage. Contrairement aux panneaux C et D qui montrent les vers après broyage, transférez le surnageant précédemment conservé dans des tubes en plastique de 1,5 millilitre avec l'homogénat de vers et centrifugez.Échantillons à 2 250 tr/min, 1300 g pendant cinq minutes. Après centrifugation, transférer le surnageant dans un nouveau tube en verre de sept millilitres. Conserver le culot pour une utilisation ultérieure dans un dosage de la concentration en protéines.Ajoutez maintenant quatre hydroxydes de potassium normaux au SUPERNAT jusqu'à ce que la plage de pH des échantillons soit comprise entre sept et huit. Centrifugez les échantillons neutralisés dans des tubes en verre de sept millilitres à 2 250 tr/min (1 300 g) pendant cinq minutes. Pour éliminer les sels, transférez le surnageant de chaque échantillon dans un nouveau tube en verre de sept millilitres. Les échantillons neutralisés peuvent désormais être préparés pour la quantification des métabolites par chromatographie liquide à haute performance ou HPLC, et par chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse ou GCMS pour l'HPLC.Séparez 50 microlitres de chaque échantillon neutralisé pour une injection directe en HPLC. La quantification des acides aminés libres est réalisée à l’aide d’une dérivation préalable avec un aldéhyde et une détection fluorescente. Comme décrit précédemment, les échantillons neutralisés restants subiront une extraction à l’aide d’une résine échangeuse d’ions pour la GCMS afin de déterminer l’enrichissement isotopique des acides aminés et des acides organiques, comme indiqué dans la section suivante.Pour préparer les billes, ajoutez de l'acide chlorhydrique normal à des billes G1 et G50 séparément. Dans des béchers d'un litre, mélangez chaque échantillon pendant 30 minutes à l'aide d'un agitateur magnétique. Ensuite, lavez les billes avec de l'eau déionisée 10 fois jusqu'à ce que le pH des lavages soit égal au pH de l'eau.Ensuite, nous allons présenter notre méthode de préparation de colonnes sur mesure peu coûteuses à l’aide de pipettes en verre. Des colonnes préfabriquées sont également disponibles sur le marché. Pour préparer une colonne, utilisez une pince pour insérer un bouchon de coton juste au-dessus de la partie la plus étroite de l’embout d’une pipette Pasteur, utilisez des billes G une pour l’extraction des acides organiques et des billes G 50.Pour l'extraction des acides aminés, remplir chaque colonne jusqu'à environ un tiers de la hauteur de la colonne. Si un échantillon est déjà à pH neutre, rien n'est ajouté à l'échantillon avant de l'appliquer sur la colonne AG 1. Pour extraire les acides organiques afin d'extraire les acides aminés, ajouter un millilitre d'acide chlorhydrique 0,1&nbsp;N à l'échantillon avant de l'appliquer sur la colonne AG 50.Appliquez maintenant les échantillons préalablement neutralisés préparés sur chaque colonne. Lavez chaque colonne 10 fois avec de l'eau jusqu'à ce que les éluats soient neutres. Une fois le lavage terminé, éluez chaque colonne dans de nouveaux tubes en verre de 4 millilitres, étiquetés. Pour l'extraction des acides organiques, ajoutez 3 millilitres d'acide chlorhydrique 3 N à la colonne AG 1.Ceci permet l'analyse de l'enrichissement isotopique en fonction du nombre total de carbone marqués parmi les espèces à trois carbones, les espèces à quatre carbones, les espèces à cinq carbones et les espèces à six carbones. Pour l'extraction des acides aminés, ajouter trois millilitres d'hydroxyde d'ammonium quatre normal à une colonne AG 50. Ceci permet l'analyse de l'enrichissement isotopique en fonction du nombre total de carbone marqués parmi les espèces à trois carbones et les espèces à cinq carbones.À l’issue des deux extractions, acide organique et acide aminé, placer les échantillons dans des vials sur un évaporateur réactif à trois postes pendant la nuit jusqu’à dessiccation. Les échantillons sont ensuite dérivés et analysés par GCMS, comme décrit dans le texte du protocole. Commencer cette procédure en transférant mille vers adultes jeunes sur une boîte de gélose NGM expérimentale de 35 millimètres contenant du glucose marqué universellement au carbone 13 et de l’E. coli.Placez ensuite la plaque NGM expérimentale sans son couvercle dans une chambre en verre sur mesure équipée d'un robinet trois voies étanche permettant un prélèvement et un remplacement précis de l'atmosphère. Recouvrez le joint situé là où le disque en verre optiquement transparent repose sur la plaque avec de la graisse à vide élevé.Scellez la chambre avec le disque de verre. Notez l'heure. À l'instant zéro, puis 30 minutes plus tard, prélevez 10 millilitres de l'atmosphère de la chambre en verre à l'aide d'une seringue de 20 millilitres par le robinet à trois voies.Fermer le robinet à tige du compartiment. Après avoir prélevé l'échantillon, le transférer dans un tube en verre sous vide de couleur rouge contenant un millilitre de bicarbonate de sodium dans une solution d'hydroxyde de sodium 0,1 molaire. Ensuite, injecter 10 millilitres d'air dans le compartiment en verre par le robinet à trois voies. À l'aide d'une seringue de 20 millilitres, fermer le robinet à tige du compartiment après avoir réinjecté l'atmosphère et, avant de reprendre l'incubation, répéter le prélèvement d'atmosphère du compartiment en verre aux temps 60, 90 et 120 minutes.Analyser ces échantillons de dioxyde de carbone atmosphérique afin de mesurer l'enrichissement en carbone marqué à l'aide d'un spectromètre de masse à rapport gazeux, comme décrit dans le texte du protocole. Les isotopes stables sont correctement incorporés après deux heures chez les vers jeunes adultes, comme en témoigne la présence de carbone marqué mesuré dans le dioxyde de carbone atmosphérique et dans le dioxyde de carbone dissous des vers nourris soit avec des OP50 E. coli vivants, soit avec des OP50 E. coli tués par irradiation UV. Le rapport entre le dioxyde de carbone à base de carbone 13 et le dioxyde de carbone à base de carbone 12 était plus élevé dans la fraction de dioxyde de carbone dissous dans les vers par rapport au dioxyde de carbone atmosphérique libéré. On a observé qu'une exposition prolongée à un isotope stable dès la période larvaire, suivie d'un lavage des vers sur milieu NGM sans bactéries, augmentait l'enrichissement isotopique du glutamate libre chez les vers jeunes adultes.Dans ce graphique, L1 représente des vers nourris avec du glucose marqué au carbone 13 universellement et des bactéries OP50 à partir du stade larvaire L1 jusqu'au stade de jeune adulte à 959 cellules ; YA représente des vers nourris avec du glucose marqué au carbone 13 et des bactéries OP50 pendant 48 heures, à compter du premier jour de ponte au stade de jeune adulte. L'axe des abscisses indique le nombre total d'atomes de carbone marqués dans chaque espèce de glutamate, et l'axe des ordonnées indique le pourcentage d'enrichissement. Tous les animaux ont été débarrassés de l'excès de marqueur isotopique avant la préparation des échantillons en aval.Pour les analyses GCMS, les barres vertes indiquent des vers débarrassés après une exposition isotopique par alimentation avec E. coli OP50 sur des plaques NGM pendant deux heures avant l'extraction au PCA. Les barres bleues et grises indiquent des vers débarrassés après une exposition isotopique sur des plaques NGM sans bactéries pendant deux ou six heures respectivement avant l'extraction au PCA, indépendamment de la durée de l'exposition isotopique. Aucune différence significative dans l'enrichissement isotopique des métabolites intermédiaires n'a été observée lorsque les animaux ont été débarrassés sur des plaques pendant deux ou six heures.Dans les deux protocoles d'exposition isotopique, une moindre enrichissement isotopique a été observé dans les métabolites intermédiaires lorsque les animaux ont été débarrassés en leur administrant des bactéries non marquées pendant deux heures. Par conséquent, le protocole de nettoyage optimal pour les vers cultivés sur des plaques NGM ensemencées avec des bactéries marquées a été défini comme un nettoyage de deux heures sur des plaques NGM non ensemencées, afin d'optimiser le pourcentage d'enrichissement dans les métabolites intermédiaires. Après un traitement de 24 heures en culture liquide avec un glucose marqué au carbone 13 à six atomes de carbone, en l'absence de bactéries.Une comparaison a été effectuée entre des échantillons de vers disrupturés uniquement par sonication ou par sonication combinée à un broyage, comme illustré sur cette figure. Les vers disrupturés par sonication combinée à un broyage présentaient un enrichissement isotopique supérieur à celui des échantillons disrupturés uniquement par sonication, enfin en alimentant des vers vivants avec un précurseur isotopique stable, soit durant leur développement à partir du stade L1 sur boîtes, soit à partir du premier jour de ponte d’œufs, en tant que jeunes adultes, pendant 24 heures en culture liquide. Permet une analyse sensible de l’enrichissement isotopique parmi les métabolites indicatifs du flux à travers la glycolyse, le métabolisme du pyruvate dans le cycle de l’acide tricarboxylique après son développement.Cette technique a ouvert la voie à la recherche sur les maladies mitochondriales, permettant d'explorer le flux métabolique intermédiaire chez *C. elegans*. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer le profilage isotopique stable du métabolisme intermédiaire et de l'analyse du flux métabolique chez les nématodes, *C. elegans*.

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Nous présentons robustes méthodes biochimiques et microscopiques pour...

Biochimique et High Throughput évaluation microscopique de la masse grasse dans<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Pour étudier la relation entre l’homéostasie des protéines, le stress et le vieillissement, nous avons surveillé les changements dans le repliement des protéines en suivant le dysfonctionnement des protéines, la localisation des protéines dans la cellule et la stabilité des protéines aux niveaux de l’organisme, des cellules et des protéines, en utilisant le métazoaire génétiquement traitable Caenorhabditis elegans comme système modèle.

Utilisation de Caenorhabditis elegans comme système modèle pour étudier l’homéostasie des protéines dans un organisme multicellulaire

Ici, on montre comment suivre et quantifier les processus de développement chez C. elegans. Les méthodes présentées sont basées sur des outils open-source qui peuvent être facilement mis en œuvre. Il est démontré comment reconstruire des modèles de forme cellulaire 3D, comment suivre manuellement les structures subcellulaires et comment analyser le flux contractile cortical.

Suivi et quantification des processus de développement des<em&gt; C. elegans</em&gt; Utilisation des outils open-source

Ici, nous détaillons des protocoles spécifiquement conçus pour surveiller les défauts morphogéniques qui se produisent pendant les phases précoces et tardives de l’élongation embryonnaire du nématode Caenorhabditis elegans. En fin de compte, ces protocoles sont conçus pour identifier les gènes qui régulent ces phases et pour caractériser leurs besoins différentiels le long de l’axe antéro-postérieur de l’embryon.

Novel Metrics à Caractériser Embryonic Allongement du nématode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

L’approche de marqueur trophique acide gras, c'est-à-dire l’assimilation des acides gras comme molécule entière et le transfert dans les tissus de consommateurs mineures ou sans aucune modification, est entravée par les lacunes dans les connaissances dans le métabolisme des acides gras des invertébrés du sol petite. Profilage de Isotopologue est fourni comme un outil précieux pour démêler les interactions trophiques.

Profilage de l’acide gras 13C Isotopologue donne un aperçu de transfert trophique de carbone et le métabolisme des lipides des consommateurs d’invertébrés

Nous décrivons une extraction artisanale modifiée et les dosages colorimétriques de lactate et pyruvate chez le nématode elegans de c. Lors de l’utilisation de trousses d’analyse commerciale, le développement technique de leur sensibilité et de précision est important. Précipitation de protéines dans l’extraction est l’étape la plus critique pour le dosage des métabolites intracellulaires.

Petits dosages colorimétriques de Lactate intracellulaire et Pyruvate chez le nématode Caenorhabditis elegans

Ce protocole décrit une méthode pour la culture à grande échelle de Caenorhabditis elegans , sur des milieux solides. Comme alternative à la culture liquide, ce protocole permet d’obtenir les paramètres de différentes échelles en culture axée sur la plaque. Cela augmente la comparabilité des résultats en omettant les différences morphologiques et métaboliques entre culture des médias liquides et solides.

Axée sur la plaque de culture à grande échelle de Caenorhabditis elegans: préparation des échantillons pour l’étude des modifications métaboliques dans le diabète

La respiration mitochondriale est critique pour la survie de l’organisme ; par conséquent, le taux de consommation d’oxygène est un excellent indicateur de la santé mitochondriale. Dans ce protocole, nous décrivons l’utilisation d’un respiromètre commercialement disponible pour mesurer basale et taux de consommation maximale d’oxygène en vivent, intact et librement mobiles Caenorhabditis elegans.

Mesure des taux de consommation d’oxygène intactes de Caenorhabditis elegans

Cette étude présente des protocoles pour deux approches d’analyse de l’activité locomotrice semi-automatisées chez les vers gas-1de la maladie du complexe I de C. elegans (fc21),à savoir ZebraLab (un test à débit moyen) et WormScan (un test à haut débit) et fournit une analyse comparative parmi un large éventail de méthodes de recherche pour quantifier le comportement des nématodes et la fonction neuromusculaire intégrée.

Analyse comparative de méthodes expérimentales pour quantifier l’activité animale dans les modèles de maladie mitochondriale de Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans est un modèle puissant pour examiner les déterminants moléculaires à l’origine des interactions hôte-microbiome. Nous présentons un pipeline à haut débit profilant les niveaux de colonisation du microbiome intestinal chez un seul animal ainsi que des aspects clés de la physiologie de C. elegans.

Application de la vermimétrie de flux pour la quantification et l’analyse du microbiome intestinal de Caenorhabditis elegans

Ce protocole décrit un test permettant de quantifier le taux d’alimentation de Caenorhabditis elegans basé sur la mesure de l’élimination des bactéries en culture liquide.

Quantifier l’apport alimentaire chez Caenorhabditis elegans en mesurant la clairance bactérienne

Découvrez le profilage isotopique stable du flux métabolique intermédiaire chez Caenorhabditis elegans. Cette méthode permet de quantifier les altérations génétiques et pharmacologiques des voies métaboliques en temps réel.

Stable profilage isotopique du flux métabolique intermédiaire dans la phase de développement et de ladulte Caenorhabditis elegans /em (Vidéo) | JoVE Journal

Stable profilage isotopique du flux métabolique intermédiaire dans la phase de développement et de l'adulte Caenorhabditis elegans

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