Stable profilage isotopique du flux métabolique intermédiaire dans la phase de développement et de l'adulte Caenorhabditis elegans

L'objectif général de l'expérience suivante est de surveiller de manière non invasive les modifications métaboliques en temps réel au niveau de l'organisme entier, dans les voies de la glycolyse, du métabolisme du pyruvate et du cycle de l'acide tricarboxylique, modifications induites par des altérations spécifiques des voies métaboliques, génétiques ou par des traitements pharmacologiques. Ceci est réalisé en administrant des isotopes stables à des nématodes vivants afin d'obtenir un enrichissement isotopique suffisant dans un plus grand nombre de métabolites, permettant ainsi la quantification des modifications génétiques ou pharmacologiques des voies métaboliques intermédiaires. Dans une deuxième étape, l'incorporation isotopique dans le dioxyde de carbone atmosphérique et dissous est mesurée par spectrométrie de masse en rapport isotopique, ce qui permet une évaluation plus directe des flux métaboliques intermédiaires sur de courtes périodes de temps.

Les échantillons suivants sont ensuite traités pour l'analyse des acides aminés libres totaux chez le ver entier par HPLC, ainsi que pour l'enrichissement isotopique des acides aminés et des acides organiques par GCMS, afin de quantifier les modifications du flux métabolique chez les nématodes. Après exposition aux isotopes stables, on obtient des résultats montrant les effets de durées variables d'exposition à l'isotope, de l'élimination bactérienne et de différentes méthodes de lyse du ver chez des vers de type sauvage, permettant d'analyser l'abondance isotopique dans les métabolites intermédiaires. Cette méthode peut fournir des informations sur la régulation du métabolisme intermédiaire.

Il peut également être appliqué à nos systèmes tels que les lignées cellulaires de mammifères et les tissus. Nous avons eu pour la première fois l'idée de cette méthode en observant des anomalies constantes dans l'analyse des acides aminés libres des vers par HPLC, anomalies suggérant une altération du flux métabolique intermédiaire lors de modifications respiratoires primaires de la fonction. Pour commencer cette procédure.

Des vers ayant été exposés à un précurseur métabolique marqué par un isotope stable, soit durant le développement, soit à l'âge adulte, sont récoltés dans un tube plastique de centrifugation de 1,5 millilitre. Nous diluons généralement les vers à une concentration de 1000 vers par millilitre. Ajouter de l'acide perchlorique à 60 % contenant de l'acide epsilon-aminocaproïque comme étalon interne aux vers, afin d'obtenir une concentration finale de 4 % d'acide perchlorique et de 20 nanomolaire d'étalon interne.

Laisser reposer le ver pendant cinq minutes par gravité, puis retirer et conserver le surnageant dans un autre tube. L'étape suivante constitue l'un des aspects les plus critiques de cette procédure. Les vers doivent être complètement disruptés par tamisage avant l'analyse des métabolites libres. À l'aide d'un homogénéisateur en plastique et d'une perceuse motorisée, broyer les échantillons de vers pendant 15 secondes.

Vérifiez visuellement la disruption des vers par microscopie optique et répétez le broyage si nécessaire. Dans cette image, les panneaux A et B montrent les vers avant le broyage. Contrairement aux panneaux C et D qui montrent les vers après broyage, transférez le surnageant précédemment conservé dans des tubes en plastique de 1,5 millilitre avec l'homogénat de vers et effectuez une centrifugation.

Échantillons à 2, 250 tr/min 1300 g pendant cinq minutes. Après centrifugation, transférez le surnageant dans un nouveau tube en verre de sept millilitres. Conservez le culot pour une utilisation ultérieure dans un dosage de la concentration en protéines.

Ajoutez maintenant quatre hydroxydes de potassium normaux au SUPERNAT jusqu'à ce que la plage de pH des échantillons soit comprise entre sept et huit. Centrifugez les échantillons neutralisés dans des tubes en verre de sept millilitres à 2 250 tr/min (1 300 g) pendant cinq minutes. Pour éliminer les sels, transférez le surnageant de chaque échantillon dans un nouveau tube en verre de sept millilitres. Les échantillons neutralisés peuvent désormais être préparés pour la quantification des métabolites par chromatographie liquide à haute performance ou HPLC, et par chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse ou GCMS pour l'HPLC.

Séparez 50 microlitres de chaque échantillon neutralisé pour une injection directe en HPLC. La quantification des acides aminés libres est réalisée à l’aide d’une dérivation préalable avec un aldéhyde et une détection fluorescente. Comme décrit précédemment, les échantillons neutralisés restants subiront une extraction à l’aide d’une résine échangeuse d’ions pour la GCMS afin de déterminer l’enrichissement isotopique des acides aminés et des acides organiques, comme indiqué dans la section suivante.

Pour préparer les billes, ajoutez de l'acide chlorhydrique normal à des billes G1 et G50 séparément. Dans des béchers d'un litre, agitez chaque flacon pendant 30 minutes à l'aide d'un agitateur magnétique. Ensuite, lavez les billes avec de l'eau déionisée 10 fois jusqu'à ce que le pH des lavages soit égal au pH de l'eau.

Ensuite, nous allons présenter notre méthode de préparation de colonnes sur mesure peu coûteuses à l’aide de pipettes en verre. Des colonnes préfabriquées sont également disponibles sur le marché. Pour préparer une colonne, utilisez une pince pour insérer un bouchon de coton juste au-dessus de la partie la plus étroite de l’embout d’une pipette Pasteur, utilisez des billes G une pour l’extraction des acides organiques et des billes G 50.

Pour l'extraction des acides aminés, remplir chaque colonne jusqu'à environ un tiers de la hauteur de la colonne. Si un échantillon est déjà à pH neutre, rien n'est ajouté à l'échantillon avant de l'appliquer sur la colonne AG 1. Pour extraire les acides organiques afin d'extraire les acides aminés, ajouter un millilitre d'acide chlorhydrique 0,1 N à l'échantillon avant de l'appliquer sur la colonne AG 50.

Appliquez maintenant les échantillons préalablement neutralisés préparés sur chaque colonne. Lavez chaque colonne 10 fois avec de l'eau jusqu'à ce que les éluats soient neutres. Une fois le lavage terminé, éluerez chaque colonne dans de nouveaux tubes en verre de 4 millilitres préalablement étiquetés. Pour l'extraction des acides organiques, ajoutez 3 millilitres d'acide chlorhydrique trois normal à la colonne AG une.

Ceci permet l'analyse de l'enrichissement isotopique en nombre total de carbone marqués parmi les espèces à trois carbones, les espèces à quatre carbones, les espèces à cinq carbones et les espèces à six carbones. Pour l'extraction des acides aminés, ajouter trois millilitres d'hydroxyde d'ammonium quatre normal à une colonne AG 50. Ceci permet l'analyse de l'enrichissement isotopique en nombre total de carbone marqués parmi les espèces à trois carbones et les espèces à cinq carbones.

À l'issue des extractions des acides organiques et des acides aminés, placer les échantillons dans des vials dans un évaporateur réactif à trois voies pendant la nuit jusqu'à dessiccation complète. Les échantillons sont ensuite dérivés et analysés par GCMS, comme décrit dans le protocole. Commencer cette procédure en transférant mille vers adultes jeunes sur une boîte de gélose NGM expérimentale de 35 millimètres contenant du glucose marqué universellement au carbone 13 et de la souche d'E. coli.

Placez ensuite la plaque NGM expérimentale sans son couvercle dans une chambre en verre sur mesure équipée d'un robinet trois voies hermétiquement scellé, permettant un prélèvement et un remplacement précis de l'atmosphère. Recouvrez le joint situé là où le disque en verre optiquement transparent repose sur la plaque avec de la graisse à vide élevé.

Scellez la chambre avec le disque de verre. Notez l'heure. À l'instant zéro, puis 30 minutes plus tard, prélevez 10 millilitres de l'atmosphère de la chambre en verre à l'aide d'une seringue de 20 millilitres par le robinet à trois voies.

Fermer le robinet à tige du compartiment. Après le prélèvement, transférer l'échantillon dans un tube en verre sous vide de couleur rouge contenant un millilitre de bicarbonate de sodium dans de l'hydroxyde de sodium 0,1 molaire. Ensuite, injecter 10 millilitres d'air dans le compartiment en verre par le robinet à trois voies. À l’aide d’une seringue de 20 millilitres, fermer le robinet à tige du compartiment après avoir réinjecté l’atmosphère et, avant de reprendre l’incubation, répéter le prélèvement d’atmosphère du compartiment en verre aux instants 60, 90 et 120 minutes.

Analyser ces échantillons de dioxyde de carbone atmosphérique pour détecter l'enrichissement en carbone marqué à l'aide d'un spectromètre de masse à rapport gazeux, comme décrit dans le texte du protocole. Les isotopes stables sont correctement incorporés après deux heures chez les vers jeunes adultes, comme en témoigne ici la mesure du carbone marqué dans le dioxyde de carbone atmosphérique et dans le dioxyde de carbone dissous des vers nourris soit avec des OP50 E. coli vivants, soit avec des OP50 E. coli tués par irradiation UV. Le rapport entre le dioxyde de carbone à base de carbone 13 et le dioxyde de carbone à base de carbone 12 était plus élevé dans la fraction de dioxyde de carbone dissous dans les vers par rapport au dioxyde de carbone atmosphérique libéré. On a observé qu'une exposition prolongée à un isotope stable dès la période larvaire, suivie d'un lavage des vers sur milieu NGM sans bactéries, augmentait l'enrichissement isotopique du glutamate libre chez les vers jeunes adultes.

Dans ce graphique, L1 représente des vers nourris avec du glucose marqué au carbone 13 universellement et des bactéries OP50 à partir du stade larvaire L1 jusqu'au stade de jeune adulte à 959 cellules ; YA représente des vers nourris avec du glucose marqué au carbone 13 et des bactéries OP50 pendant 48 heures, à compter du premier jour de ponte au stade de jeune adulte. L'axe des abscisses indique le nombre total d'atomes de carbone marqués dans chaque espèce de glutamate, et l'axe des ordonnées indique le pourcentage d'enrichissement. Tous les animaux ont été débarrassés de l'excès de marqueur isotopique avant la préparation des échantillons en aval.

Pour les analyses GCMS, les barres vertes indiquent des vers débarrassés après exposition isotopique par alimentation avec E. coli OP50 sur des plaques NGM pendant deux heures avant l'extraction au PCA. Les barres bleues et grises indiquent des vers débarrassés après exposition isotopique sur des plaques NGM sans bactéries pendant deux ou six heures respectivement avant l'extraction au PCA, indépendamment de la durée du cours temporel d'exposition isotopique. Aucune différence significative dans l'enrichissement isotopique des métabolites intermédiaires n'a été observée lorsque les animaux ont été débarrassés sur des plaques pendant deux ou six heures.

Dans les deux protocoles d'exposition isotopique, une moindre enrichissement isotopique a été observé dans les métabolites intermédiaires lorsque les animaux ont été débarrassés en leur donnant des bactéries non marquées pendant deux heures. Par conséquent, le protocole de nettoyage optimal pour les vers cultivés sur des plaques NGM ensemencées avec des bactéries marquées a été défini comme un nettoyage de deux heures sur des plaques NGM non ensemencées afin d'optimiser le pourcentage d'enrichissement dans les métabolites intermédiaires. Après un traitement de 24 heures en culture liquide avec un glucose marqué au carbone 13 à six atomes de carbone, en l'absence de bactéries.

Une comparaison a été réalisée entre des échantillons de vers fragmentés uniquement par sonication ou par sonication combinée à un broyage, comme illustré sur cette figure. Les vers fragmentés par sonication combinée à un broyage présentaient un enrichissement isotopique supérieur à celui des échantillons fragmentés uniquement par sonication, permettant finalement d'alimenter des vers vivants avec un précurseur isotopique stable, soit durant leur développement à partir du stade L1 sur des boîtes, soit dès le premier jour de ponte d'œufs en tant qu'adultes jeunes, pendant 24 heures en culture liquide. Cette méthode permet une analyse sensible de l'enrichissement isotopique parmi les métabolites, indicateur du flux à travers la glycolyse et le métabolisme du pyruvate dans le cycle de l'acide tricarboxylique après son développement.

Cette technique a ouvert la voie à la recherche sur les maladies mitochondriales, permettant d'explorer le flux métabolique intermédiaire chez *C. elegans*. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer le profilage isotopique stable du métabolisme intermédiaire et de l'analyse du flux métabolique chez les nématodes, *C. elegans*.