Protocole pour des essais de l'ARNi dans les moustiques adultes (A. gambiae)

Je m’appelle Lindsay Garver et je suis étudiante au doctorat dans le laboratoire du Dr George Dimopoulos à l’École de santé publique Johns Hopkins. Et je vais vous montrer comment faire du silençage des gènes par l’intermédiaire de l’ARNi à l’aide d’une technique d’injection. La première étape consiste donc à collecter les moustiques que nous allons injecter.

Ce ne sont que des stocks et terriblement Gabi. C’est un mélange d’hommes et de femmes. Et c’est notre aspirateur alimenté par batterie.

Il a un ventilateur à l’intérieur, qui créera une aspiration, attirant les moustiques à travers cette buse dans ce réservoir. Alors on se déconnecte. Nous avons une petite porte d’accès, qui est généralement scotchée pour garder les moustiques à l’intérieur, mais nous l’ouvrons et insérons la buse, l’allumons et l’utilisons pour collecter.

Une fois que nous avons les moustiques à l’intérieur, nous bouchons le haut de la buse, voyons les moustiques là-bas dans le réservoir. Ensuite, nous voulons anesthésier ces moustiques. Nous enterrons donc ce réservoir dans un seau à glace que nous recouvrons de glace et attendons que les moustiques descendent.

D’accord, la prochaine étape consiste à injecter les Mosquitoes et pour les utiliser, nous utiliserons ceci, qui est un nano jet deux. Il se compose d’une partie baguette, que je tiendrai. Et cela contiendra l’aiguille, qui distribuera le liquide dans le moustique.

Le panneau de commande, qui a nos boutons de remplissage et de vide et est responsable de l’aspiration du liquide dans et hors de l’aiguille. Et puis c’est le pied. Celui-ci sera déposé sur le sol.

Et en poussant cela avec mon pied, vous distribuerez une goutte du volume approprié dans le moustique. Alors, pendant que les moustiques sont sur la glace, nous préparons le poste de travail en réglant un bloc froid de zéro degré à deux degrés Celsius. Ce bloc froid est doté d’une fixation plate, sur laquelle est ensuite montée une glissière en verre.

Et cela empêchera les moustiques de bouger pendant que nous essayons de les manipuler. Je prendrai également l’une de ces aiguilles capillaires en verre. Il s’agit simplement d’un tube capillaire en verre ordinaire qui a été chauffé et tiré au milieu pour créer une aiguille.

Et c’est ce qui retiendra notre liquide. Et puis c’est ce que nous allons utiliser pour injecter le moustique et distribuer le liquide. La prochaine chose que nous devons faire est donc de placer l’aiguille capillaire sur notre baguette d’injection.

Nous retirons l’embout nasal. Assurez-vous que les anneaux intérieurs sont situés conformément aux instructions de votre fabricant. Faites glisser l’aiguille de verre vers le bas dans l’embout nasal, en faisant attention à l’embout afin de ne pas le casser.

Une fois que c’est bien fixé, glissez l’aiguille de la baguette dans l’aiguille capillaire et vissez fermement l’embout nasal. La prochaine chose à faire est de s’assurer que l’aiguille de votre tube capillaire est d’une bonne largeur pour les injections. C’est un point très important car une aiguille trop fine ne distribuera pas la bonne quantité de liquide et une pointe d’aiguille trop épaisse blessera le moustique et éventuellement causera la mort.

C’est quelque chose qui demande beaucoup de pratique, mais une, une bonne largeur est en fait cruciale pour une bonne injection et la survie de vos moustiques. Ce que je fais, c’est utiliser votre pince à pointe fine pour casser la pointe de l’aiguille afin que l’aiguille soit toujours conforme mais stable. Nous avons besoin de notre échantillon d’ARN double brin.

Cet échantillon a été préparé à l’aide d’une trousse. Il existe une variété de kits sur le marché qui peuvent générer des ARN doubles standard spécifiques pour le gène d’intérêt. Nous utilisons nos ARN à une concentration de trois microgrammes par microlitre, et nous avons notre kit d’injection nano de sorte qu’une injection distribue 69 nanolitres de position.

Le tube met notre aiguille dans le liquide et utilise le bouton de remplissage sur l’éjection n pour aspirer le liquide dans l’aiguille. La quantité de liquide dont vous aurez besoin dans l’aiguille est directement proportionnelle au nombre de moustiques que vous allez injecter. D’accord? Et nous devons maintenant préparer les moustiques.

Nous prenons donc notre plat en plastique P two et nous l’insérons dans notre seau de glace. Nous vérifions que nos moustiques ne bougent pas et nous les répartissons finement sur la boîte de Pétri froide. Cela garantit que pendant que nous travaillons, les moustiques ne bougent pas et ne volent pas.

Nous positionnons ensuite les moustiques sur notre lame de verre, qui est maintenant à zéro degré Celsius. Et le positionnement des moustiques est crucial pour la façon dont nous les injectons. Vous voulez donc que vos moustiques soient alignés de manière ordonnée afin que vous sachiez lesquels ont été injectés et lesquels n’ont pas été injectés.

Et vous voulez également qu’il y ait suffisamment d’espace entre vos moustiques pour que vous puissiez les atteindre avec l’injecteur. Nous transférons donc des moustiques individuels de la boîte pee-wee à la lame, en prenant soin, en prenant soin de les manipuler par leurs pattes. Cela évite d’écraser les corps et entraîne une plus grande survie.

Nous sommes donc maintenant prêts à injecter. Nous utilisons la pince à pointe fine pour soutenir le moustique d’un côté, je suis droitier, donc je l’utilise dans ma main gauche. Et puis nous injectons de l’autre côté en insérant la pointe de l’aiguille dans le côté du thorax, de sorte que le thorax du moustique soit pris en sandwich entre les pointes de la pince et la pointe de l’aiguille et la pointe de l’aiguille entre.

Une fois que la pointe de l’aiguille est à l’intérieur du thorax, appuyez sur la pédale, vous entendrez un bip et du liquide sera distribué dans le thorax du moustique. Ensuite, vous passez au suivant et répétez. De temps en temps, lorsque vous retirez l’aiguille, vous verrez une goutte de liquide qui est sortie du site d’entrée.

Et si cela se produit, vous pouvez attendre que le liquide soit réabsorbé dans le site d’entrée. Si cela se produit, ce n’est pas grave. Si la goutte n’est pas réabsorbée, si la goutte reste à l’extérieur du thorax, alors ce moustique doit être jeté et vous, vous en injectez un autre à sa place.

Il est également important de s’assurer que votre aiguille ne va pas plus loin dans le thorax que nécessaire. Vous ne voulez pas passer de l’autre côté ou laisser passer une trop grande largeur d’aiguille. La survie du thorax ou des moustiques sera compromise.

Nous continuons donc cette procédure pour tous les moustiques au besoin. Donc, pour stocker vos moustiques injectés, nous avons utilisé un gobelet en carton doublé de cire d’une pinte qui a été recouvert d’un filet à mailles fines et fixé avec un élastique et un couvercle en carton. Nous avons ouvert la porte d’accès qui est recouverte de ruban adhésif et ajoutons soigneusement nos moustiques pour aider vos moustiques à survivre.

Vous devriez ajouter une boule de coton qui a été mariée à une solution à 10 % de saccharose qui agit comme une source de nourriture pour les moustiques pendant qu’ils sont ici. Et une serviette en papier pliée humide. Étant donné que les moustiques blessés ont tendance à se dessécher, cela aidera à préserver l’humidité et à aider à la survie de vos moustiques injectés.

Nous complétons cela avec un couvercle de Petri pour contenir l’humidité afin que notre serviette en papier et nos boules de coton restent humides. Ensuite, nous l’incubons dans des conditions normales de contrôle de l’environnement. Ainsi, la cinétique moléculaire du silençage génique médié par l’ARNi varie beaucoup d’un gène à l’autre.

Ainsi, pour certains gènes, le silençage peut avoir lieu en une journée et pour d’autres, un silençage efficace n’aura pas lieu avant plusieurs jours. Les différences entre chaque gène peuvent être mesurées à l’aide d’une PCR quantitative en temps réel, ce qui permettra de surveiller les niveaux de transcription chez vos moustiques et vous dira quand vous avez réussi à réduire au silence efficacement. Je recommanderais donc de mettre de côté quelques-uns de vos moustiques injectés à cette fin.

Cela vous aidera également à déterminer l’efficacité de vos ARN double brin en général, si vous, vos ARN double brin spécifiques, pouvez réaliser un silence efficace. Et si vous interférez en fait avec les niveaux de transcrits, je viens de vous montrer la procédure pour le silençage génique médié par l’ARNi des moustiques anomalies de Gambie. Cette procédure implique la micro-injection d’ARN double brin dans le thorax des moustiques Anole Gabi.

Cette procédure est importante car c’est l’un des déchets les plus faciles et les plus efficaces pour manipuler des gènes individuels chez les moustiques.